李蕊婷，盧士玲，李開(kāi)雄，馬宇霞，鄧紅梅

(石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子，832000)

目前，肉制品的發(fā)酵劑研究在我國(guó)屬于一個(gè)比較熱門(mén)的領(lǐng)域。在肉制品成熟的過(guò)程中添加合適的發(fā)酵劑，對(duì)實(shí)現(xiàn)發(fā)酵肉工業(yè)化生產(chǎn)，縮短產(chǎn)品成熟期，對(duì)使產(chǎn)品特征標(biāo)準(zhǔn)化和安全化將起重要的作用［1］。但是隨著肉制品的發(fā)酵和成熟，其內(nèi)源菌群不斷變化，加入不同的發(fā)酵劑可能對(duì)內(nèi)源菌群產(chǎn)生一定影響(拮抗或協(xié)同)。本研究在不采取化學(xué)添加物的前提下，在熏馬腸生產(chǎn)過(guò)程中添加有抑菌作用并可產(chǎn)生物胺氧化酶的菌株作發(fā)酵劑，以不同的添加組合，采用PCR-DGGE技術(shù)研究發(fā)酵劑對(duì)內(nèi)源微生物在熏馬腸發(fā)酵和成熟過(guò)程中動(dòng)態(tài)變化的影響，為熏馬腸安全生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與主要試劑

1.1 試驗(yàn)材料

馬肉及其他輔料均購(gòu)自石河子愛(ài)家超市。

發(fā)酵劑:本實(shí)驗(yàn)室分離提取到的4株葡萄球菌和1株植物乳桿菌(Staphylococcus epidermidis;Staphylococcussimulans.001;Staphylococcussimulans.002;Staphylococcus simulans.003;Lactobacillus plantarum)注:Staphylococcus simulans有3個(gè)不同種，分別編號(hào)為 001、002、003。

1.2 主要儀器和試劑

恒溫恒濕培養(yǎng)箱，德國(guó) BINDER公司;灌腸機(jī)(MM12型絞肉機(jī));海爾冰箱;電子天平;高速離心機(jī);小型離心機(jī)(Anke TLG-16G);超凈工作臺(tái)(SWCF-1F);PCR儀，美國(guó) Bio-Rad公司;DGGE電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司;凝膠成像儀(GelDoc 2000 system Bio-Rad，美國(guó));微型振蕩器;海爾控溫冰箱;Eppendorf移液槍(1 ～10μL、1 ～20 μL、20 ～ 200 μL、10 ～1 000 μL)。

細(xì)菌總DNA提取試劑盒(天根);溶菌酶(sigma);PCR相關(guān)試劑盒，MarkⅢ，去離子水，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺(Sigma)，尿素(Sigma)，TRIS(Sigma)，EDTA-2Na(Sigma)，TE(Sigma)，過(guò)硫酸銨(Sigma)，SYBR Green I(Bio-V)。

2 試驗(yàn)內(nèi)容及方法

2.1 熏馬腸基本加工工藝

原料肉進(jìn)行處理，將肥膘(20%)切丁進(jìn)行漂洗(40℃)，瘦肉(80%)絞肉，混合腌制接種發(fā)酵劑;灌入腸衣發(fā)酵2 d，(發(fā)酵條件:18 ±0.5℃，RH 90% ～95%);成熟過(guò)程控制不同條件3～4 d［(14±0.5)℃，RH 80% ～85%］，5 ～7 d［(12 ± 0.5)℃，RH 75% ～80%］，8 ～28 d［(10 ± 0.5)℃，RH 70% ～75%］。

2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照熏馬腸的加工工藝，利用分離純化得到的4株葡萄球菌及1株植物乳桿菌，制作9種不同類(lèi)型熏馬腸(見(jiàn)表1)，其中發(fā)酵劑的接種量為107CFU/g，復(fù)合發(fā)酵劑以1∶1添加。在熏馬腸的發(fā)酵和成熟的過(guò)程中，分別對(duì) 9 組熏馬腸 A、B、C、D、E、F、G、H、I于0、2、7、14、28 d 進(jìn)行無(wú)菌取樣并冷凍保藏，分別對(duì)其進(jìn)行菌相測(cè)定。

表1 接種不同發(fā)酵劑類(lèi)型的熏馬腸Table 1 The smoked horsemeat sausage of inoculating with different starter culture

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 細(xì)菌總DNA的提取

取待測(cè)樣品20g于180 mL生理鹽水中，搖床振蕩30 min;4 000重力加速度的條件下4℃離心10 min;再取上清液1 mL于1.5 mL離心管在10 000重力加速度條件下4℃離心10 min，棄去上清液，反復(fù)幾次。參照DNA提取試劑盒(天根)的說(shuō)明，提取樣品總細(xì)菌的DNA。所提取的DNA溶于TE緩沖液，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，于-20℃條件下貯藏以備PCR擴(kuò)增使用。

2.3.2 PCR擴(kuò)增

所選用的引物為［2］:上游引物為帶GC夾子的U968(5＇-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3＇)，下游引物為 L1401(5＇-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3＇)。對(duì)細(xì)菌的16S rDNA的 V6-V8區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的片段為400bp。

PCR 反應(yīng)為25 μL體系:包括1μL模板DNA，上游引物和下游引物各0.5μL，HS MIX(東盛)12.5μL，無(wú)菌水10.5μL。

PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性10 min，35個(gè)循環(huán)(95℃變性30s;56℃退火30s;72℃延伸30s)，最終72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，-20℃冰箱保存以備DGGE使用。

2.3.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

DGGE采用Bio-rad電泳儀，聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%(丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺37.5:1)。變性梯度為40%～60%(40%變性劑凝膠溶液:9.6 mL 0%變性劑+14.4 mL 100%變性劑 +50μL 20%APS溶液+5μL TEMED;60%變性劑凝膠溶液:14.4 mL 0%變性劑 +9.6 mL 100%變性劑 +50μL 20%APS溶液 +5μL TEMED)，濃縮膠為:6 mL 0%變性劑 +30μL 20%APS溶液 +6μL TEMED。在 pH 為7.4的1×TAE緩沖液中，將PCR產(chǎn)物加入膠孔，溫度設(shè)定為60℃，然后開(kāi)始電泳，電泳條件為:200V電壓預(yù)跑10 min，之后85V電壓16 h。

2.3.4 SYBR Green I染色

待電泳結(jié)束后，小心取下膠片，放入50 mL pH為7.0～8.5的1×TAE(含5μL SYBR Green I)中室溫避光振蕩染色30 min，之后再將膠片放入超純水中漂洗幾次。

2.3.5 凝膠成像及DNA的回收

待染色后，小心地將DGGE膠片轉(zhuǎn)移到凝膠成像系統(tǒng)下拍照并割膠(要盡快操作，否則在紫外光的作用下，很快圖像的效果就會(huì)降低)，圖像分析采用Quantity one軟件。割膠回收是用無(wú)菌手術(shù)刀切下DGGE膠上相應(yīng)位置的條帶，分別放入已經(jīng)滅菌的1.5 mL離心管里，加入20μL無(wú)菌的TE溶液，置于4℃條件下過(guò)夜以備DNA測(cè)序的使用。

2.3.6 DNA的測(cè)序

取2μL回收的DNA為模板進(jìn)行16S rDNA的V6-V8區(qū)域擴(kuò)增，細(xì)菌上游引物為U968(5＇-AAC GCG AAG AAC CTT AC-3＇)，下游引物 L1401(5＇-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3＇)，PCR 擴(kuò)增程序同2.3.2。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，條帶的位置在400bp就可以證明該回收DNA的存在，之后將剩余PCR產(chǎn)物送到華大基因測(cè)序，登錄NCBI將所得序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行相似性比對(duì)［3］。

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)菌總DNA提取結(jié)果

選取9組不同處理的樣品，分別在其成熟過(guò)程中第0，2，7，14，28天的取樣。用細(xì)菌總 DNA 提取試劑盒，對(duì)樣品進(jìn)行無(wú)菌操作并提取樣品中的總DNA，之后將溶于TE緩沖液的DNA經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)，得到明顯的條帶，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)樣品的細(xì)菌總DNA提取效果很好，提取方法合適，所得到總DNA適合后續(xù)PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

3.2 細(xì)菌的16S rDNA PCR擴(kuò)增

以不同處理的熏馬腸細(xì)菌總DNA為模板，用引物GC-U968和L1401對(duì)16S rDNA的V6-V8可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)，獲得約400bp的特異性片段，所有樣品均有較亮的擴(kuò)增條帶，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的PCR擴(kuò)增條件是適合的，可以滿(mǎn)足后續(xù)DGGE電泳分析實(shí)驗(yàn)的條件。

3.3 熏馬腸成熟過(guò)程中細(xì)菌DGGE圖譜主要條帶的DNA序列相似性比較

由圖1和圖2可看出，因2張圖中均有對(duì)照組A，將2張圖片進(jìn)行位置比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)圖2中條帶在圖1中有相互對(duì)應(yīng)的條帶。DGGE指紋圖上的1個(gè)條帶就代表1個(gè)微生物類(lèi)群，因此，圖2中部分條帶割膠后沒(méi)有進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)比對(duì)后，對(duì)應(yīng)的位置為:m1→M1，m2→M2，m3→M3，m4→M6，m6→M8，m7→M9，m8→M10，m10→M11，m11→M13，m12→M14，m13→M15。其他 M4，M5，M7，M12，m5，m9 沒(méi)有相對(duì)應(yīng)的條帶。

圖1 熏馬腸成熟過(guò)程中細(xì)菌PCR-DGGE圖譜Fig.1 DGGE fingerprinting of PCR products of smoked horsemeat sausage during ripening

3.4 細(xì)菌DGGE圖譜主要條帶的DNA序列分析

通過(guò)PCR-DGGE電泳照相后，把條帶割膠用不帶GC夾子的引物擴(kuò)增序列(同2.3.6)后，其中m9和M12于條帶太弱，菌活力弱，菌液中濃度過(guò)低，沒(méi)有測(cè)出相應(yīng)的序列，其余可進(jìn)行后續(xù)分析。將測(cè)序結(jié)果與Gene bank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行比對(duì)，確定結(jié)果(見(jiàn)表2)。

圖2 熏馬腸成熟過(guò)程中細(xì)菌PCR-DGGE圖譜Fig.2 DGGE fingerprinting of PCR products of smoked horsemeat sausage during ripening

表2 熏馬腸成熟過(guò)程中細(xì)菌PCR-DGGE圖譜上條帶系列分析(圖1中的條帶)Table 2 Identities of bands obtained from DGGE analysis of bactrial communities in smoked horsemeat sausage during ripening(bands obtained from Fig.1)

4 討論

如圖1、圖2可看出，空白組第14天的菌相最豐富，且數(shù)量最大，第0天使M1、M2數(shù)量多，其他的菌濃度都低。第2天時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，菌相開(kāi)始豐富，M6、M7、M8、M9、M10 均出現(xiàn)。第 7 天時(shí)，種類(lèi)基本無(wú)變化，數(shù)量增多。第14天時(shí)，M10消失，出現(xiàn)M13、M14。第28天時(shí)，菌數(shù)量減少，菌群達(dá)到動(dòng)態(tài)穩(wěn)定狀態(tài)，M1、M2為自然發(fā)酵劑，且一直是優(yōu)勢(shì)菌種，幾乎不受添加發(fā)酵劑的影響。M9為植物乳桿菌，在C、E、G、I四組復(fù)合添加植物乳桿菌中，數(shù)量比不復(fù)合的相應(yīng)組數(shù)量要多，同時(shí)其他條帶的亮度也都降低，說(shuō)明此株植物乳桿菌能夠在一定程度上抑制內(nèi)源菌的生長(zhǎng)。

B組和C組中，M3、M9為發(fā)酵劑，B組中M3隨著發(fā)酵時(shí)間的增加越來(lái)越少，C組中M3增強(qiáng)，2組中的M9數(shù)量越來(lái)越大。與空白組對(duì)照，增加了內(nèi)源菌的生長(zhǎng);D組和E組中，M4、M9為加入的發(fā)酵劑，D組中M4一直未變，M9逐步增多，內(nèi)源菌增多。E組中M4越來(lái)越少，M9到第2天時(shí)增多后又下降。E組的發(fā)酵劑的內(nèi)源菌的數(shù)量減少，種類(lèi)變多;F組和G組中，m4、m7為發(fā)酵劑，2組的M7都逐漸增多，F(xiàn)組中的m4增大到28 d時(shí)降低且穩(wěn)定，G組的m4持續(xù)增多。內(nèi)源菌的種類(lèi)和數(shù)量都降低;H組和I組中，m5、m7為發(fā)酵劑，m5在0 d時(shí)出現(xiàn)，后被抑制。m7越來(lái)越多，發(fā)酵結(jié)束后并沒(méi)有明顯影響內(nèi)源菌的種類(lèi)和數(shù)量。

在熏馬腸中，實(shí)際菌相可能比檢測(cè)到的更加復(fù)雜，存在一些在本研究過(guò)程中沒(méi)有檢測(cè)到的其他屬菌或乳酸菌、腸細(xì)菌、微球菌和假單胞菌屬中的其他種類(lèi)。在很多相關(guān)的報(bào)道中，對(duì)主要腐敗菌進(jìn)行初步分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)假單胞菌(Pseudomonas sp.)是主要的腐敗優(yōu)勢(shì)菌之一［4-5］。有研究表明，當(dāng)該種微生物占整個(gè)微生物種群數(shù)小于1%時(shí)，DGGE將檢測(cè)不到該種微生物的存在［6］。

研究表明，糞腸球菌、屎腸球菌、陰溝腸桿菌、大腸埃希氏菌和產(chǎn)氣腸桿菌可產(chǎn)生大量的生物胺［7］，一些乳酸菌也可產(chǎn)生生物胺［8］，控制它們的生長(zhǎng)能夠更好的保障發(fā)酵香腸的品質(zhì)。Cocolin等人［9］將DGGE用于自然發(fā)酵意大利香腸成熟過(guò)程中菌相的分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乳酸菌是其香腸發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌，其中 Lactobacillus sake和 Lactobacillus curvatus對(duì)產(chǎn)品的酸化和蛋白質(zhì)的水解有重要作用，決定了發(fā)酵香腸的感官質(zhì)量。在本研究中，Weissella sp.是優(yōu)勢(shì)菌，但Weissella sp.不產(chǎn)生物胺已經(jīng)得到證實(shí)［10］;微球菌屬中的一些菌也能產(chǎn)生生物胺，但產(chǎn)生物胺的能力極其有限［11］，它們的存在對(duì)香腸的品質(zhì)影響不明顯。

5 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)PCR-DGGE的方法揭示了熏馬腸成熟過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌相的變化。結(jié)果表明，添加不同發(fā)酵劑的熏馬腸菌相分布呈現(xiàn)不同變化，但是隨著成熟時(shí)間的變化，優(yōu)勢(shì)菌趨于明顯。添加發(fā)酵劑所有組合對(duì)內(nèi)源菌Escherichia coli有較強(qiáng)的抑制作用;腐敗菌條帶 M8，M10，M13，M14從成熟初期到結(jié)束一直存在，添加發(fā)酵劑所有組合對(duì)內(nèi)源菌Escherichia coli有較強(qiáng)的抑制作用;其中C，D，E組中細(xì)菌種類(lèi)在發(fā)酵初期較多，但到發(fā)酵結(jié)束時(shí)，其菌含量下降，尤其對(duì)內(nèi)源菌 Pseudomonas sp.，Staphylococcus carnosus和Staphylococcus xylosus有較強(qiáng)抑制作用;G組中內(nèi)源的Pseudomonas sp.一直存在;與E組對(duì)應(yīng)的添加單一發(fā)酵劑的D組在發(fā)酵初期并沒(méi)有E組的微生物種類(lèi)多，但其抑菌效果較好;內(nèi)源的Weissella sp.和Staphylococcus sp.在成熟過(guò)程中一直存在，不受發(fā)酵劑的抑制，但Weissella sp.不產(chǎn)生物胺。F組在28 d發(fā)酵結(jié)束時(shí)，菌群的種類(lèi)和數(shù)量為最低，抑菌效果最好。

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