張等偉

摘 要 數(shù)據(jù)非依賴性采集（DIA）是隨著定量蛋白質(zhì)組學(xué)而建立的質(zhì)譜掃描技術(shù)。DIA能夠獲得掃描范圍內(nèi)所有母離子及二級(jí)子離子信息，不會(huì)造成低豐度離子信息的丟失，同時(shí)突破了高分辨質(zhì)譜二級(jí)定量的通量限制。本研究基于靜電場(chǎng)軌道阱QqITOT三合一質(zhì)譜，發(fā)展了經(jīng)典DIA方法以及WiSIMDIA和Full MSDIA兩種全新DIA方法，并對(duì)Hela細(xì)胞全蛋白中添加的10條低濃度肽段進(jìn)行定量分析，考察方法的線性、重現(xiàn)性和靈敏度。結(jié)果表明，3種方法的定量限均低至amol （14～435 amol），并展示出良好的線性和定性確證可靠性。其中，WiSIMDIA基于超高分辨一級(jí)監(jiān)測(cè)定量，與經(jīng)典DIA優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)；Full MSDIA的選擇窗口僅3 amu，能夠直接進(jìn)行搜庫鑒定，實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)依賴性采集（DDA）和DIA的統(tǒng)一，擺脫了DIA依賴于DDA建立譜圖庫的局限性。

1 引 言

數(shù)據(jù)依賴性采集（Data dependent acquisition， DDA）是串聯(lián)質(zhì)譜非目標(biāo)化合物分析的主要手段。蛋白質(zhì)組學(xué)的經(jīng)典策略鳥槍法（Shotgun）即基于DDA發(fā)展而來，利用一級(jí)全掃描檢測(cè)肽段母離子，然后按信號(hào)強(qiáng)度排列，將前若干位的母離子依次選擇、碎裂，并掃描二級(jí)碎片離子。同時(shí)，動(dòng)態(tài)排除、價(jià)態(tài)排除、中性丟失/診斷離子觸發(fā)等技術(shù)，使DDA盡可能多地采集有效肽段譜圖，實(shí)現(xiàn)鑒定結(jié)果最大化[1]?；邙B槍法，蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)酵母蛋白質(zhì)組接近完全覆蓋，人類蛋白質(zhì)組也已達(dá)到50%以上的基因組覆蓋和7個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍[2，3]。然而，DDA的局限性也逐漸顯現(xiàn)：（1） 先強(qiáng)后弱的采集方式易造成低豐度肽段信息丟失；（2） 母離子選擇有一定的隨機(jī)性，造成重現(xiàn)性不佳；（3） 每個(gè)循環(huán)獲得的譜圖數(shù)量不一，造成掃描點(diǎn)數(shù)不均勻，影響定量分析準(zhǔn)確性。

目標(biāo)蛋白質(zhì)組學(xué)針對(duì)目標(biāo)蛋白/肽段離子實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和采集，避免了DDA的信息丟失和重現(xiàn)性問題。主要采集方法包括選擇離子監(jiān)測(cè)（Selected ion monitoring， SIM）、基于三重四極桿的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Selected reaction monitoring， SRM）和基于高分辨質(zhì)譜的平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Parallel reaction monitoring， PRM），是目標(biāo)蛋白驗(yàn)證和絕對(duì)定量的有效手段[4，5]。但是目標(biāo)性的采集方法需要指定目標(biāo)肽段，對(duì)于未知肽段無法采集；通量限制也使得一次實(shí)驗(yàn)只能監(jiān)測(cè)數(shù)量有限肽段或離子對(duì)，難以滿足大規(guī)模蛋白分析的需要。

數(shù)據(jù)非依賴性采集（Data independent acquisition， DIA）使用25 amu或更大間隔將整個(gè)質(zhì)量范圍等分為若干窗口，每個(gè)窗口依次選擇、碎裂、掃描。DIA能夠獲得質(zhì)量范圍內(nèi)所有母離子的全部碎片離子信息，通量無上限，循環(huán)時(shí)間固定，同時(shí)數(shù)據(jù)可以回溯，有效解決了DDA和目標(biāo)采集方法存在的問題[6]。目前，已發(fā)展了多種基于飛行時(shí)間（QTOF）、靜電場(chǎng)軌道阱（Orbitrap）和離子阱的DIA方法[7]。Gillet等使用32個(gè)連續(xù)的25 amu窗口，基于QTOF （TripleTOF 5600）發(fā)展了SWATH技術(shù)，并證明該技術(shù)的定量能力與SRM相當(dāng)[8]。Egertson等利用QOrbitrap （Q Exactive）獨(dú)有的多重掃描功能（Multiplexing， MSX）發(fā)展了MSXDIA技術(shù)，將選擇窗口縮小到4 amu，最大程度減少了共流出肽段和雜質(zhì)的干擾[9]。

然而，傳統(tǒng)數(shù)據(jù)非依賴性采集仍存在諸多局限：（1） 由于掃描速度的限制，DIA難以使用超高分辨率掃描；（2） DIA的大窗口選擇引入較大干擾，雖然MSXDIA縮小了選擇窗口，但需要特定的算法解析數(shù)據(jù)，增加了工作量；（3） DIA依賴于DDA建立的譜圖庫進(jìn)行匹配，實(shí)現(xiàn)定性確證和定量離子選擇，因此DDA鑒定不到的蛋白，DIA也無法分析。

本研究基于四極桿靜電場(chǎng)軌道阱線性離子阱（QOTqIT）三合一質(zhì)譜，利用添加10條低濃度肽段的Hela樣本，發(fā)展并考察了3種數(shù)據(jù)非依賴性采集方法，包括經(jīng)典的DIA、全新的寬窗口SIM掃描DIA （WiSIMDIA）和全掃描DIA （Full MSDIA），定量限均達(dá)到amol水平，線性、重現(xiàn)性良好。其中，WiSIMDIA和Full MSDIA基于24萬超高分辨率，利用一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)定量、二級(jí)離子阱定性確證，進(jìn)一步縮小了選擇窗口，提高了檢測(cè)特異性。此外，F(xiàn)ullMS DIA可以直接搜庫，實(shí)現(xiàn)了DDA與DIA的統(tǒng)一，蛋白鑒定數(shù)量與DDA相當(dāng)，擺脫了譜圖庫的限制?；赒OTqIT的數(shù)據(jù)非依賴性采集方法靈活多樣、流程簡(jiǎn)單有效，在目標(biāo)蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Orbitrap Fusion三合一質(zhì)譜儀、EASYnLC 1000納流超高效液相色譜（Thermo Fisher Scientific）。標(biāo)準(zhǔn)肽段由生工生物（上海）股份有限公司合成；乙腈、甲酸（Thermo Fisher Scientific）；其它試劑均購自SigmaAldrich公司。

2.2 Hela細(xì)胞全蛋白酶解液制備

出良好的線性、重現(xiàn)性和靈敏度。3種方法的最低定量限均達(dá)到amol級(jí)，其中肽段GEEMEEMVQSAR

在DIA中最低定量限達(dá)14 amol，超越了常規(guī)SRM和PRM的定量水平。比較3種方法可以看出，DIA與WiSIMDIA結(jié)果差異不大，證明了基于高分辨的二級(jí)定量和基于超高分辨的一級(jí)定量選擇性相當(dāng)，均能有效排除基質(zhì)和共流出肽段的干擾，定量能力出色。兩種方法又各有特點(diǎn)，形成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)：DIA通過四極桿和Orbitrap兩級(jí)篩選，能有效分析極復(fù)雜的樣品；WiSIMDIA使用母離子定量，避免了碎裂過程中的損失，在相對(duì)簡(jiǎn)單的基質(zhì)中靈敏度更高。

3.4 直接搜庫鑒定的考察與比較

由于選擇窗口過大，同時(shí)二級(jí)譜圖無法與一級(jí)母離子相關(guān)聯(lián)，傳統(tǒng)數(shù)據(jù)非依賴性采集無法直接搜庫，需要譜圖庫匹配才能進(jìn)行定性確證，使DIA的應(yīng)用受制于DDA。

Full MSDIA基于一級(jí)全掃描定量，母離子未經(jīng)過前級(jí)質(zhì)量分析器選擇，因此相比DIA和WiSIMDIA受到的干擾更大，靈敏度略低。但是，F(xiàn)ull MSDIA將二級(jí)選擇窗口縮短到3 amu，與傳統(tǒng)DDA的選擇窗口相當(dāng)，能夠作為低分辨數(shù)據(jù)，直接用于數(shù)據(jù)庫檢索（相當(dāng)于母離子質(zhì)量精度為±1.5 amu），擺脫了譜圖庫的限制，實(shí)現(xiàn)了DDA與DIA的統(tǒng)一。

圖4展示了肽段YLGYLEQLLR譜圖的直接搜庫結(jié)果。DDA通常以2 amu為選擇窗口，與Full MSDIA 3 amu選擇窗口相差不大。搜庫時(shí)，F(xiàn)ull MSDIA一級(jí)質(zhì)量精度以窗口寬度為限，即±1.5 amu，類似于低分辨質(zhì)譜DDA數(shù)據(jù)的搜庫鑒定。結(jié)果顯示，F(xiàn)ull MSDIA與DDA的二級(jí)譜圖高度相似，雖然Full MSDIA譜圖等同于低分辨數(shù)據(jù)，但鑒定結(jié)果沒有明顯差異，序列匹配完全一致。

4 結(jié) 論

基于靜電場(chǎng)軌道阱QqITOT質(zhì)譜建立DIA、WiSIMDIA、Full MSDIA 3種數(shù)據(jù)非依賴性采集方法，并使用添加10條低濃度肽段的Hela細(xì)胞全蛋白樣本對(duì)方法進(jìn)行考察。結(jié)果表明，3種方法的定量限均在14～435 amol范圍內(nèi)，線性關(guān)系與重現(xiàn)性良好，定性確證可靠性高。其中，WiSIMDIA基于超高分辨SIM定量，與經(jīng)典DIA二級(jí)定量具有一定的互補(bǔ)性；而Full MSDIA將二級(jí)選擇窗口縮短到3 amu，實(shí)現(xiàn)了DIA數(shù)據(jù)直接搜庫鑒定，共從100 ng Hela細(xì)胞全蛋白樣本鑒定到2835個(gè)非冗余蛋白，與DDA鑒定結(jié)果重合度高。基于QqITOT的創(chuàng)新數(shù)據(jù)非依賴性采集方法為定量蛋白質(zhì)組學(xué)提供了全新視角與策略。

References

1 Kalli A， Smith G T， Sweredoski M J， Hess S. J. Proteome Res.， 2013， 12（7）： 3071-3086

2 Nagaraj N， Kulak N A， Cox J， Neuhauser N， Mayr K， Hoerning O， Vorm O， Mann M. Mol. Cell. Proteomics， 2012， 11（3）： M111.013722

3 Geiger T， Wehner A， Schaab C， Cox J， Mann M. Mol. Cell. Proteomics， 2012， 11（3）： M111.014050

4 Gallien S， Duriez E， Crone C， Kellmann M， Moehring T， Domon B. Mol. Cell. Proteomics， 2012， 11（12）： 1709-1723

5 Gallien S， Duriez E， Demeure K， Domon B. J. Proteomics， 2013， 81： 148-158

6 Chapman J D， Goodlett D R， Masselon C D. Mass Spectrom. Rev.， 2013： 10.1002/mas.21400

7 Law K P， Lim Y P. Expert Rev. Proteomics， 2013， 10（6）： 551-566

8 Gillet L C， Navarro P， Tate S， Rost H， Selevsek N， Reiter L， Bonner R， Aebersold R. Mol. Cell. Proteomics， 2012， 11（6）： O111.016717

9 Egertson J D， Kuehn A， Merrihew G E， Bateman N W， MacLean B X， Ting Y S， Canterbury J D， Marsh D M， Kellmann M， Zabrouskov V， Wu C C， MacCoss M J. Nat. Methods， 2013， 10（8）： 744-746

10 Senko M W， Remes P M， Canterbury J D， Mathur R， Song Q， Eliuk S M， Mullen C， Earley L， Hardman M， Blethrow J D， Bui H， Specht A， Lange O， Denisov E， Makarov A， Horning S， Zabrouskov V. Anal. Chem.， 2013， 85（24）： 11710-11714

Quantification Analysis of Targeted Proteins in Complex

Sample by Novel Data Independent Acquisition

ZHANG Wei1， Reiko Kiyonami2， JIANG Zheng*1， CHEN Wei1

1（Thermo Fisher Scientific， Shanghai 201206， China）

2（Thermo Fisher Scientific， San Jose， CA， USA）

Abstract Data independent acquisition （DIA） is a novel MS scan mode for quantitative proteomics， acquiring all precursors as well as fragments without any loss of low abundant ions， and breaks the throughput limitation of product ion quantification by highresolution MS. Here we developed three DIA methods on quadrupolelinear ion trapOrbitrap （QqITOT） Tribrid MS， classic DIA， as well as novel wide isolation window SIM scan （WiSIM）DIA and full scanDIA （Full MSDIA）. Quantitative analysis of 10 low abundant peptides spiked in Hela cell digest was performed by the three methods for linearity， reproducibility and sensitivity evaluation. The results showed that the LOQs reached amol level （14-435 amol） with good linearity and effective MS/MS confirmation. WiSIMDIA utilizes ultrahigh resolution SIM scan for quantification complementary with classic DIA. The isolation window of Full MSDIA was down to 3 amu， and the data could be directly used for database searching， thus realizing the integration of data dependent acquisition （DDA） and DIA， and avoiding the limitation of using spectra library.

Keywords Orbitrap； Data independent acquisition； Proteomics； Absolute quantification

（Received 24 April 2014； accepted 4 July 2014）

由于選擇窗口過大，同時(shí)二級(jí)譜圖無法與一級(jí)母離子相關(guān)聯(lián)，傳統(tǒng)數(shù)據(jù)非依賴性采集無法直接搜庫，需要譜圖庫匹配才能進(jìn)行定性確證，使DIA的應(yīng)用受制于DDA。

Full MSDIA基于一級(jí)全掃描定量，母離子未經(jīng)過前級(jí)質(zhì)量分析器選擇，因此相比DIA和WiSIMDIA受到的干擾更大，靈敏度略低。但是，F(xiàn)ull MSDIA將二級(jí)選擇窗口縮短到3 amu，與傳統(tǒng)DDA的選擇窗口相當(dāng)，能夠作為低分辨數(shù)據(jù)，直接用于數(shù)據(jù)庫檢索（相當(dāng)于母離子質(zhì)量精度為±1.5 amu），擺脫了譜圖庫的限制，實(shí)現(xiàn)了DDA與DIA的統(tǒng)一。

圖4展示了肽段YLGYLEQLLR譜圖的直接搜庫結(jié)果。DDA通常以2 amu為選擇窗口，與Full MSDIA 3 amu選擇窗口相差不大。搜庫時(shí)，F(xiàn)ull MSDIA一級(jí)質(zhì)量精度以窗口寬度為限，即±1.5 amu，類似于低分辨質(zhì)譜DDA數(shù)據(jù)的搜庫鑒定。結(jié)果顯示，F(xiàn)ull MSDIA與DDA的二級(jí)譜圖高度相似，雖然Full MSDIA譜圖等同于低分辨數(shù)據(jù)，但鑒定結(jié)果沒有明顯差異，序列匹配完全一致。

4 結(jié) 論

基于靜電場(chǎng)軌道阱QqITOT質(zhì)譜建立DIA、WiSIMDIA、Full MSDIA 3種數(shù)據(jù)非依賴性采集方法，并使用添加10條低濃度肽段的Hela細(xì)胞全蛋白樣本對(duì)方法進(jìn)行考察。結(jié)果表明，3種方法的定量限均在14～435 amol范圍內(nèi)，線性關(guān)系與重現(xiàn)性良好，定性確證可靠性高。其中，WiSIMDIA基于超高分辨SIM定量，與經(jīng)典DIA二級(jí)定量具有一定的互補(bǔ)性；而Full MSDIA將二級(jí)選擇窗口縮短到3 amu，實(shí)現(xiàn)了DIA數(shù)據(jù)直接搜庫鑒定，共從100 ng Hela細(xì)胞全蛋白樣本鑒定到2835個(gè)非冗余蛋白，與DDA鑒定結(jié)果重合度高?；赒qITOT的創(chuàng)新數(shù)據(jù)非依賴性采集方法為定量蛋白質(zhì)組學(xué)提供了全新視角與策略。

References

1 Kalli A， Smith G T， Sweredoski M J， Hess S. J. Proteome Res.， 2013， 12（7）： 3071-3086

2 Nagaraj N， Kulak N A， Cox J， Neuhauser N， Mayr K， Hoerning O， Vorm O， Mann M. Mol. Cell. Proteomics， 2012， 11（3）： M111.013722

3 Geiger T， Wehner A， Schaab C， Cox J， Mann M. Mol. Cell. Proteomics， 2012， 11（3）： M111.014050

4 Gallien S， Duriez E， Crone C， Kellmann M， Moehring T， Domon B. Mol. Cell. Proteomics， 2012， 11（12）： 1709-1723

5 Gallien S， Duriez E， Demeure K， Domon B. J. Proteomics， 2013， 81： 148-158

6 Chapman J D， Goodlett D R， Masselon C D. Mass Spectrom. Rev.， 2013： 10.1002/mas.21400

7 Law K P， Lim Y P. Expert Rev. Proteomics， 2013， 10（6）： 551-566

8 Gillet L C， Navarro P， Tate S， Rost H， Selevsek N， Reiter L， Bonner R， Aebersold R. Mol. Cell. Proteomics， 2012， 11（6）： O111.016717

9 Egertson J D， Kuehn A， Merrihew G E， Bateman N W， MacLean B X， Ting Y S， Canterbury J D， Marsh D M， Kellmann M， Zabrouskov V， Wu C C， MacCoss M J. Nat. Methods， 2013， 10（8）： 744-746

10 Senko M W， Remes P M， Canterbury J D， Mathur R， Song Q， Eliuk S M， Mullen C， Earley L， Hardman M， Blethrow J D， Bui H， Specht A， Lange O， Denisov E， Makarov A， Horning S， Zabrouskov V. Anal. Chem.， 2013， 85（24）： 11710-11714

Quantification Analysis of Targeted Proteins in Complex

Sample by Novel Data Independent Acquisition

ZHANG Wei1， Reiko Kiyonami2， JIANG Zheng*1， CHEN Wei1

1（Thermo Fisher Scientific， Shanghai 201206， China）

2（Thermo Fisher Scientific， San Jose， CA， USA）

Abstract Data independent acquisition （DIA） is a novel MS scan mode for quantitative proteomics， acquiring all precursors as well as fragments without any loss of low abundant ions， and breaks the throughput limitation of product ion quantification by highresolution MS. Here we developed three DIA methods on quadrupolelinear ion trapOrbitrap （QqITOT） Tribrid MS， classic DIA， as well as novel wide isolation window SIM scan （WiSIM）DIA and full scanDIA （Full MSDIA）. Quantitative analysis of 10 low abundant peptides spiked in Hela cell digest was performed by the three methods for linearity， reproducibility and sensitivity evaluation. The results showed that the LOQs reached amol level （14-435 amol） with good linearity and effective MS/MS confirmation. WiSIMDIA utilizes ultrahigh resolution SIM scan for quantification complementary with classic DIA. The isolation window of Full MSDIA was down to 3 amu， and the data could be directly used for database searching， thus realizing the integration of data dependent acquisition （DDA） and DIA， and avoiding the limitation of using spectra library.

Keywords Orbitrap； Data independent acquisition； Proteomics； Absolute quantification

（Received 24 April 2014； accepted 4 July 2014）

由于選擇窗口過大，同時(shí)二級(jí)譜圖無法與一級(jí)母離子相關(guān)聯(lián)，傳統(tǒng)數(shù)據(jù)非依賴性采集無法直接搜庫，需要譜圖庫匹配才能進(jìn)行定性確證，使DIA的應(yīng)用受制于DDA。

Full MSDIA基于一級(jí)全掃描定量，母離子未經(jīng)過前級(jí)質(zhì)量分析器選擇，因此相比DIA和WiSIMDIA受到的干擾更大，靈敏度略低。但是，F(xiàn)ull MSDIA將二級(jí)選擇窗口縮短到3 amu，與傳統(tǒng)DDA的選擇窗口相當(dāng)，能夠作為低分辨數(shù)據(jù)，直接用于數(shù)據(jù)庫檢索（相當(dāng)于母離子質(zhì)量精度為±1.5 amu），擺脫了譜圖庫的限制，實(shí)現(xiàn)了DDA與DIA的統(tǒng)一。

圖4展示了肽段YLGYLEQLLR譜圖的直接搜庫結(jié)果。DDA通常以2 amu為選擇窗口，與Full MSDIA 3 amu選擇窗口相差不大。搜庫時(shí)，F(xiàn)ull MSDIA一級(jí)質(zhì)量精度以窗口寬度為限，即±1.5 amu，類似于低分辨質(zhì)譜DDA數(shù)據(jù)的搜庫鑒定。結(jié)果顯示，F(xiàn)ull MSDIA與DDA的二級(jí)譜圖高度相似，雖然Full MSDIA譜圖等同于低分辨數(shù)據(jù)，但鑒定結(jié)果沒有明顯差異，序列匹配完全一致。

4 結(jié) 論

基于靜電場(chǎng)軌道阱QqITOT質(zhì)譜建立DIA、WiSIMDIA、Full MSDIA 3種數(shù)據(jù)非依賴性采集方法，并使用添加10條低濃度肽段的Hela細(xì)胞全蛋白樣本對(duì)方法進(jìn)行考察。結(jié)果表明，3種方法的定量限均在14～435 amol范圍內(nèi)，線性關(guān)系與重現(xiàn)性良好，定性確證可靠性高。其中，WiSIMDIA基于超高分辨SIM定量，與經(jīng)典DIA二級(jí)定量具有一定的互補(bǔ)性；而Full MSDIA將二級(jí)選擇窗口縮短到3 amu，實(shí)現(xiàn)了DIA數(shù)據(jù)直接搜庫鑒定，共從100 ng Hela細(xì)胞全蛋白樣本鑒定到2835個(gè)非冗余蛋白，與DDA鑒定結(jié)果重合度高?；赒qITOT的創(chuàng)新數(shù)據(jù)非依賴性采集方法為定量蛋白質(zhì)組學(xué)提供了全新視角與策略。

References

1 Kalli A， Smith G T， Sweredoski M J， Hess S. J. Proteome Res.， 2013， 12（7）： 3071-3086

2 Nagaraj N， Kulak N A， Cox J， Neuhauser N， Mayr K， Hoerning O， Vorm O， Mann M. Mol. Cell. Proteomics， 2012， 11（3）： M111.013722

3 Geiger T， Wehner A， Schaab C， Cox J， Mann M. Mol. Cell. Proteomics， 2012， 11（3）： M111.014050

4 Gallien S， Duriez E， Crone C， Kellmann M， Moehring T， Domon B. Mol. Cell. Proteomics， 2012， 11（12）： 1709-1723

5 Gallien S， Duriez E， Demeure K， Domon B. J. Proteomics， 2013， 81： 148-158

6 Chapman J D， Goodlett D R， Masselon C D. Mass Spectrom. Rev.， 2013： 10.1002/mas.21400

7 Law K P， Lim Y P. Expert Rev. Proteomics， 2013， 10（6）： 551-566

8 Gillet L C， Navarro P， Tate S， Rost H， Selevsek N， Reiter L， Bonner R， Aebersold R. Mol. Cell. Proteomics， 2012， 11（6）： O111.016717

9 Egertson J D， Kuehn A， Merrihew G E， Bateman N W， MacLean B X， Ting Y S， Canterbury J D， Marsh D M， Kellmann M， Zabrouskov V， Wu C C， MacCoss M J. Nat. Methods， 2013， 10（8）： 744-746

10 Senko M W， Remes P M， Canterbury J D， Mathur R， Song Q， Eliuk S M， Mullen C， Earley L， Hardman M， Blethrow J D， Bui H， Specht A， Lange O， Denisov E， Makarov A， Horning S， Zabrouskov V. Anal. Chem.， 2013， 85（24）： 11710-11714

Quantification Analysis of Targeted Proteins in Complex

Sample by Novel Data Independent Acquisition

ZHANG Wei1， Reiko Kiyonami2， JIANG Zheng*1， CHEN Wei1

1（Thermo Fisher Scientific， Shanghai 201206， China）

2（Thermo Fisher Scientific， San Jose， CA， USA）

Abstract Data independent acquisition （DIA） is a novel MS scan mode for quantitative proteomics， acquiring all precursors as well as fragments without any loss of low abundant ions， and breaks the throughput limitation of product ion quantification by highresolution MS. Here we developed three DIA methods on quadrupolelinear ion trapOrbitrap （QqITOT） Tribrid MS， classic DIA， as well as novel wide isolation window SIM scan （WiSIM）DIA and full scanDIA （Full MSDIA）. Quantitative analysis of 10 low abundant peptides spiked in Hela cell digest was performed by the three methods for linearity， reproducibility and sensitivity evaluation. The results showed that the LOQs reached amol level （14-435 amol） with good linearity and effective MS/MS confirmation. WiSIMDIA utilizes ultrahigh resolution SIM scan for quantification complementary with classic DIA. The isolation window of Full MSDIA was down to 3 amu， and the data could be directly used for database searching， thus realizing the integration of data dependent acquisition （DDA） and DIA， and avoiding the limitation of using spectra library.

Keywords Orbitrap； Data independent acquisition； Proteomics； Absolute quantification

（Received 24 April 2014； accepted 4 July 2014）