陳聽(tīng)宜 楊國(guó)玲 劉建雯 劉金鵬 張芳芳 趙曉宣

RNA干擾技術(shù)對(duì)犬小孢子菌PQ-LRP基因沉默的研究

陳聽(tīng)宜 楊國(guó)玲 劉建雯 劉金鵬 張芳芳 趙曉宣

目的構(gòu)建犬小孢子菌PQ-LRP基因RNA干擾載體,探討RNA干擾載體對(duì)犬小孢子菌PQLRP基因表達(dá)的影響。方法用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入突變技術(shù),加入多克隆位點(diǎn),引入潮霉素抗性基因,先后構(gòu)建PUC-PLULT、PCB309-PLULT載體。應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)PCB309-PLULT載體對(duì)犬小孢子菌PQ-LRP基因表達(dá)的干擾作用。結(jié)果構(gòu)建了中間載體PUC-PLUT、PUC-PLULT,并通過(guò)PCR、基因測(cè)序進(jìn)行鑒定。成功構(gòu)建了長(zhǎng)為8 825 bp的干擾載體PCB309-PLULT,并通過(guò)酶切測(cè)定為該目的載體;篩選出犬小孢子菌轉(zhuǎn)化子的潮霉素最佳濃度為300 mg/L;用實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)犬小孢子菌PQ-LRP基因干擾前后表達(dá)量進(jìn)行鑒定:以干擾前PQ-LRP相對(duì)表達(dá)量1.0為標(biāo)準(zhǔn),干擾后PQ-LRP相對(duì)表達(dá)量為0.39,干擾后下調(diào)61%。結(jié)論干擾載體PCB309-PLULT可以明顯抑制犬小孢子菌PQ-LRP基因的表達(dá)。

犬小孢子菌;RNA干擾;基因,PQ-LRP;基因沉默

犬小孢子菌(Microsporum canis)是較常見(jiàn)的致病性淺部真菌,易致兒童白癬和膿癬。對(duì)頭癬流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),主要致病菌為犬小孢子菌［1］。本課題組前期運(yùn)用抑制消減雜交技術(shù)(SSH)構(gòu)建了犬小孢子菌差異基因文庫(kù)［2］,通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析得到PQ loop repeat protein(PQ-LRP),并用半定量PCR證實(shí)PQ-LRP基因在兒童頭皮組織中的高表達(dá)可能與犬小孢子菌的生長(zhǎng)和致病性密切相關(guān)［3］;后期采用cDNA末端快速擴(kuò)增法(RACE)獲取PQ-LRP基因的cDNA全長(zhǎng)序列,其全長(zhǎng)為1 522 bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)?1 080 bp,編碼 359個(gè)氨基酸序列［4］。 基于此,本實(shí)驗(yàn)用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的T-DNA(transfer DNA)插入突變技術(shù),對(duì)現(xiàn)有的植物雙元表達(dá)載體進(jìn)行修飾改造,加入多克隆位點(diǎn),引入潮霉素(hygromycin)抗性基因,使其在間隔序列兩側(cè)加上目的基因的正反向干擾序列。構(gòu)建并優(yōu)化根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的犬小孢子菌遺傳轉(zhuǎn)化體系,通過(guò)基因定量分析確定構(gòu)建的轉(zhuǎn)化體系對(duì)犬小孢子菌PQ-LRP基因的抑制作用。

材料和方法

一、材料

1.主要試劑:潮霉素,哈爾濱賽拓生物公司生產(chǎn);質(zhì)粒PCB309、PUC-PUT、根癌農(nóng)桿菌EHA105來(lái)自本科室;DH5α,XbaⅠ、XhoⅠ、SpeⅠ、SacⅠ、KpnⅠ、BglⅢ、HindⅢ等限制性內(nèi)切酶,T4DNA連接酶、Taq酶、T載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;標(biāo)準(zhǔn)參照物(MarkerⅢ)、質(zhì)粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

2.菌株:犬小孢子菌膿癬株1株來(lái)自本科真菌室,分離自我科門(mén)診就診的5歲頭癬男孩,經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)及ITS段PCR電泳鑒定為犬小孢子菌。

二、方法

1.引物設(shè)計(jì):①擴(kuò)增PQ-LRP基因引物:PQLRP正向:5'-CGGGGTACCCTCGAGCTTCAACATT ATCGGAGCGG-3',酶切位點(diǎn):KpnⅠ,XhoⅠ;反向:5'-GAAGATCTAAGCTTTAACTGAGGGATTCGGCT AC-3',酶切位點(diǎn):BglⅢ,HindⅢ;②PUC-PUT 質(zhì)粒中間間隔序列引物:CUT正向:5'-TACCCACTGGAG ATTTGTTGG-3',反向:5'-CAACAAATCTCCAGTGG GTAC-3'。

2.參照RNAisoTMPlus試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA［4］,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280比值為1.9～2.0(正常為1.8～2.0),電泳鑒定提取RNA的片段大小。然后將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為PCR擴(kuò)增的模板。

3.RNA干擾載體PCB309-PLULT的構(gòu)建及根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化:①構(gòu)建中間載體PUC-PLUT:以cDNA為模板,用引物PQ-LRP擴(kuò)增PQ-LRP基因的干擾序列,得到片段長(zhǎng)度約600 bp(反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性1 min;94℃變性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán);72℃后延伸10 min);分別將PUC-PUT和純化回收的上述PCR片段用XhoⅠ和HindⅢ雙酶切(37℃、3 h),將酶切后純化回收的PCR片段與PUC-PUT載體進(jìn)行連接(22℃、2 h),得到PUC-PLUT載體,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α,提質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證;②構(gòu)建中間載體PUC-PLULT:分別將PUC-PLUT和純化回收的上述PCR片段用BglⅢ和KpnⅠ雙酶切(條件同上),將酶切后純化回收的PCR片段與PUC-PLUT載體進(jìn)行連接(條件同上),得到PUC-PLULT,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α,提質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證;③構(gòu)建載體PCB309-PLULT:將質(zhì)粒PUC-PLULT和PCB309分別用SpeⅠ和SacⅠ雙酶切,酶切后再分別純化回收,將從PUC-PLULT酶切并純化的PLULT片段(3.4 kb)與酶切后純化的PCB309載體進(jìn)行連接,得到PCB309-PLULT,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α,挑取單菌落,提質(zhì)粒,SpeⅠ和SacⅠ雙酶切驗(yàn)證。用電轉(zhuǎn)化方法,將干擾載體從DH5α供體菌中轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中,并用PCR鑒定干擾載體是否轉(zhuǎn)入。

4.犬小孢子菌對(duì)潮霉素的敏感試驗(yàn)、犬小孢子菌的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選:分別配置潮霉素濃度為0、100、150、200、250、300、350、400 mg/L 的沙氏固體培養(yǎng)基,將犬小孢子菌懸液(分段菌絲濃度1×105～5×105個(gè)/ml)涂于培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)6～7 d,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,確定潮霉素的篩選濃度為300 mg/L。取1 mlA600nm為0.6～0.8的根癌農(nóng)桿菌與5×105個(gè)/ml分段菌絲1 ml混合;將200 μl混合液分別涂于添加和未添加乙酰丁香酮(AS 200 μmol/L)的誘導(dǎo)平板上,25 ℃避光培養(yǎng) 24、36、48、60、72 h［5］。 將共培養(yǎng)的含有根癌農(nóng)桿菌和犬小孢子菌分段菌絲的混合物轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)平板上(含300 mg/L潮霉素、200 μmol/L頭孢噻肟鈉);25℃培養(yǎng)4 d,直至菌落出現(xiàn);將具有潮霉素抗性的犬小孢子菌轉(zhuǎn)接于無(wú)潮霉素的沙氏培養(yǎng)基,連續(xù)傳代5次后,轉(zhuǎn)移至含有300 mg/L潮霉素的篩選平板上進(jìn)行檢測(cè),由此獲得穩(wěn)定的含有干擾載體PCB309-PLULT的犬小孢子菌干擾株。

5.犬小孢子菌PQ-LRP基因mRNA表達(dá)量:用SYBR GreenⅠ熒光染料嵌合法,以干擾前犬小孢子菌的總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別對(duì)各樣品的PQ-LRP基因和管家基因18S用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行定量分析,通過(guò)對(duì)管家基因的校正,對(duì)各樣品PQ-LRP基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

結(jié) 果

一、總RNA提取結(jié)果

提取的犬小孢子菌膿癬株總RNA用瓊脂糖凝膠電泳得到完整帶型(圖1),適宜用于反轉(zhuǎn)錄。

二、RNA干擾載體PCB309-PLULT的構(gòu)建

①PUC-PLUT質(zhì)粒PCR鑒定:用引物PQ-LRP正向引物、CUT反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳鑒定,可見(jiàn)約600 bp的目的片段,證明目的片段連接到PUC-PUT載體中得到載體PUC-PLUT(圖2),后經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確;②PUC-PLULT質(zhì)粒PCR鑒定:以引物L(fēng)RP正向、CUT正向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定,可見(jiàn)約600 bp的目的片段,證明目的片段連接到PUC-PLUT中,得到載體PUCPLULT(圖3),并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證:與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比照,與PQ-LRP基因序列相同;③酶切片段PLULT與PCB309 PCR鑒定:載體PCB309-PLULT構(gòu)建前酶切片段PLULT(3.4 kb)與 PCB309(5.4 kb)的 PCR鑒定,與預(yù)期結(jié)果相符(圖5)。

圖1 犬小孢子菌膿癬株總RNA提取電泳圖 M:標(biāo)準(zhǔn)參照物;1,2:犬小孢子菌膿癬株RNA

圖2 PUC-PLUT質(zhì)粒PCR鑒定圖M:標(biāo)準(zhǔn)參照物;1:陰性對(duì)照;2:PUC-PLUT

圖3 PUC-PLULT質(zhì)粒PCR鑒定圖 M:標(biāo)準(zhǔn)參照物;1:陰性對(duì)照;2:PUC-PLUTL

圖4 PCB309-PLULT質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化鑒定圖 M:標(biāo)準(zhǔn)參照物;1:陰性對(duì)照;2:PCB309-PLULT

圖5 酶切片段PLULT與PCB309的PCR鑒定結(jié)果 M:標(biāo)準(zhǔn)參照物;1:PLULT(3.4 kb)與PCB309(5.4 kb)

三、PCB309-PLULT質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化結(jié)果

構(gòu)建的PCB309-PLULT質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)到根癌農(nóng)桿菌EHA105中,對(duì)陽(yáng)性克隆用引物L(fēng)RP正向、CUT正向引物進(jìn)行PCR鑒定,可見(jiàn)到約600 bp的片段,證明載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中(圖4)。

四、利用實(shí)時(shí)PCR方法對(duì)犬小孢子菌PQ-LRP基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析,結(jié)果可見(jiàn),干擾后組PQ-LRP基因表達(dá)水平發(fā)生變化,以干擾前PQ-LRP相對(duì)表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)1,干擾后PQ-LRP相對(duì)表達(dá)量為0.39(表1)。

表1 犬小孢子菌PCB309-PLULT干擾前、后PQ-LRP基因相對(duì)表達(dá)量

討 論

我們用RNA干擾技術(shù)對(duì)犬小孢子菌PQ-LRP基因進(jìn)行了研究。RNA干擾技術(shù)具有高效、特異、周期短、操作簡(jiǎn)單、高通量等特點(diǎn),已漸成為對(duì)真菌進(jìn)行遺傳改造的一種新手段［6-8］。1992年,Romano和Macino首次在粗糙脈胞菌中發(fā)現(xiàn)真菌中存在RNA干擾現(xiàn)象(當(dāng)時(shí)稱此現(xiàn)象為“基因壓制”),之后Vermout等運(yùn)用聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系對(duì)犬小孢子菌基因SUB3及DPPIV干擾后進(jìn)行功能研究［9］。但由于真菌細(xì)胞多為多倍體且細(xì)胞壁含有較多的多糖及多糖蛋白等成分,使得干擾技術(shù)用于真菌研究過(guò)程中也存在干擾效率低、有脫靶效應(yīng)等問(wèn)題。所以選擇適當(dāng)?shù)倪z傳轉(zhuǎn)化方法并制備合適的轉(zhuǎn)化載體,才能夠更高效地導(dǎo)入siRNA,有效延長(zhǎng)RNA干擾的作用時(shí)間,進(jìn)而提高靶基因抑制效率,更好地對(duì)真菌進(jìn)行基因研究。

RNA干擾技術(shù)中載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化是本實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵部分。已報(bào)道的載體構(gòu)建方法有多種,本研究采用本真菌室設(shè)計(jì)的絲狀真菌基因RNA干擾載體,構(gòu)建了載體PCB309-PLULT,證明PCB309-PLULT載體適用于皮膚癬菌基因的RNA干擾研究,該方法也是首次在皮膚癬菌中得到應(yīng)用。與Vermout等［9］構(gòu)建載體的方法相比優(yōu)點(diǎn)為:能夠?qū)⒍鄶?shù)研究中使用的雙元載體改造為較小的雙元載體,加入T-DNA邊界重復(fù)序列,之后加入潮霉素抗性基因以便于篩選。根癌農(nóng)桿菌是一種革蘭陰性土壤桿菌,它能夠?qū)⒛[瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒上的一段T-DNA轉(zhuǎn)移并隨機(jī)整合到宿主基因組中,產(chǎn)生T-DNA插入突變。本研究成功完成了PCB309-PLULT質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化,獲得了干擾載體PCB309-PLULT的犬小孢子菌干擾株,并用實(shí)時(shí)PCR方法對(duì)犬小孢子菌PQ-LRP基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,干擾后其基因表達(dá)水平下調(diào)61%。優(yōu)化的反應(yīng)體系成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)犬小孢子菌PQ-LRP基因表達(dá)的有效干擾,證明由根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入突變技術(shù)具有轉(zhuǎn)化受體類型多、轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

PQ-LRP蛋白家族都是膜綁定蛋白,在真菌其他菌屬中也被發(fā)現(xiàn),但該基因的致病機(jī)理尚未見(jiàn)報(bào)道,本研究結(jié)果干擾載體PCB309-PLULT能夠明顯抑制犬小孢子菌PQ-LRP基因的表達(dá)及犬小孢子菌干擾株的成功獲得,為探討PQ-LRP基因?qū)湫螒B(tài)學(xué)、動(dòng)物模型的建立等奠定了一定基礎(chǔ)。

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PQ-loop repeat protein gene silencing by RNA interference inMicrosporum canis

Chen Xinyi，Yang Guoling，Liu Jianwen，Liu Jinpeng，Zhang Fangfang，Zhao Xiaoxuan.Department of Dermatology and Venereology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116011，China

Yang Guoling，Email:yanggl@medmail.com.cn

Objective To build a RNA interference vector for PQ-loop repeat protein(LRP)gene，and to evaluate the effect of the vector on the expression of PQ-LRP gene inMicrosporum canis.Methods The PUC-PLULT and PCB309-PLULT vectors were constructed sequentially by usingAgrobacterium tumefaciens-mediated T-DNA insertional mutagenesis，adding multiple cloning sites，and introducing the hygromycin-resistance gene.Microsporum caniswas transformed with the PCB309-PLULT vector followed by a series of passages and hygromycin selection.Real-time quantitative PCR was performed to measure the expression of PQ-LRP gene inMicrosporum canisbefore and after transformation.Results The intermediate vectors PUC-PLUT and PUC-PLULT were constructed and identified by PCR and gene sequencing.The 8 825-bp interference vector PCB309-PLULT was successfully built and confirmed by enzyme digestion.The optimum concentration of hygromycin for screening forMicrosporum canistransformants was determined as 300 mg/L.The mRNA expression level of PQ-LRP was decreased by 61%in the transformants as compared with untransformedMicrosporum canis(0.39 vs.1.00).Conclusion The constructed PCB309-PLULT interference vector can effectively inhibit the expression of PQ-LRP gene inMicrosporum canis.

Microsporum canis；RNA interference；Genes，PQ-LRP；Gene silencing

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.007

國(guó)家自然科學(xué)基金(81071330)

116011大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚性病科

楊國(guó)玲,Email:yanggl@medmail.com.cn

2013-11-20)

(本文編輯:吳曉初)