潮霉素
- 杏鮑菇原生質(zhì)體制備、再生及其遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
。同時(shí)，通過(guò)對(duì)潮霉素濃度篩選和轉(zhuǎn)化方式的優(yōu)化，建立穩(wěn)定有效的杏鮑菇原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化體系，以期為杏鮑菇的菌種改良和優(yōu)良品種選育提供參考。1 材料與方法1.1 材料與試劑杏鮑菇菌株GIM5.344、質(zhì)粒4：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王杰教授課題組構(gòu)建；溶壁酶1（≥200 U/mg）：廣東省微生物研究所；溶壁酶2（≥200 U/mg）：北京索萊寶科技有限公司；纖維素酶（≥200 U/mg）、甘露醇、聚乙二醇4000、氯化鈣、順丁烯二酸、順丁烯二酸二鈉、三羥甲基氨基甲
食品研究與開(kāi)發(fā) 2023年21期2023-11-10
- 潮霉素B對(duì)擬南芥種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響
570228)潮霉素B(以下簡(jiǎn)稱(chēng)潮霉素)作為氨基糖苷類(lèi)正糖霉素族Ⅱ類(lèi)抗生素[1]的代表之一,被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域,常作為轉(zhuǎn)化的選擇劑[2],具有重要的應(yīng)用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。潮霉素在20世紀(jì)50年代被發(fā)現(xiàn),它主要通過(guò)靶向細(xì)菌中的30 S核糖體亞基[3]和真核細(xì)胞中的核糖體[4],從而阻礙蛋白質(zhì)的合成[5],最終致使細(xì)胞逐漸褐化直至死亡[6]。潮霉素具有抑菌、殺蟲(chóng)功能,可作為生物學(xué)研究過(guò)程中遺傳操作選擇劑[7],被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)和生物工程中。擬南芥(Arab
種子 2023年4期2023-06-19
- 海濱雀稗以hpt與bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的轉(zhuǎn)化體系比較研究
和hpt基因（潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，具有潮霉素抗性）的pCAMBIA1305.2和內(nèi)含GUS和bar基因（膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，具有草丁膦抗性）的pCAMBIA3301；轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株AGL1中，作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的菌液。圖1 植物表達(dá)載體圖譜Fig.1 Map of plant expression vector1.3 不同類(lèi)型的培養(yǎng)基在再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系中，使用的培養(yǎng)基類(lèi)型及配方見(jiàn)表1。如圖3
草業(yè)學(xué)報(bào) 2023年1期2023-02-07
- 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的山蒼子遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建
長(zhǎng)影響較小，而潮霉素能顯著殺死未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞組織，大幅降低假陽(yáng)性的產(chǎn)生，這兩種抗生素被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化[20-22]。然而，如抗生素濃度使用過(guò)度，會(huì)影響愈傷組織的正常生長(zhǎng)和分化，甚至造成已轉(zhuǎn)化成功愈傷組織的死亡，且不同植物對(duì)抗生素忍耐性不同[23]。因此，選擇合適的抗生素濃度能顯著提升遺傳轉(zhuǎn)化的效率。本研究以快繁的無(wú)菌組培苗為試驗(yàn)材料，進(jìn)一步優(yōu)化山蒼子組培再生過(guò)程，研究頭孢霉素和潮霉素對(duì)山蒼子再生的影響，初步建立山蒼子的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為山蒼子種質(zhì)
林業(yè)科學(xué)研究 2022年5期2022-10-12
- 寧夏枸杞潮霉素抗性濃度篩選研究
探索適合枸杞的潮霉素篩選劑量，為枸杞基因功能的研究、遺傳轉(zhuǎn)化提供參考。以寧夏枸杞無(wú)菌苗葉片為外植體，設(shè)置4個(gè)潮霉素濃度梯度，研究其對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織和愈傷組織誘導(dǎo)分化芽的影響，以選出適合枸杞轉(zhuǎn)化體篩選的抗生素劑量。結(jié)果表明，隨著潮霉素濃度的升高，其對(duì)枸杞誘導(dǎo)愈傷組織和愈傷組織誘導(dǎo)芽分化的抑制作用加強(qiáng)。潮霉素濃度越高，枸杞葉片的出愈率越低，愈傷組織的褐化率越高，且葉片逐漸變黃、白化甚至死亡。將潮霉素作為抗性選擇標(biāo)記時(shí)，抗性濃度以2 mg/L為最佳。關(guān)鍵詞：寧夏枸
農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào) 2022年4期2022-07-14
- 芍藥受體再生系統(tǒng)的建立
子葉；抗生素：潮霉素（Hygromycin）、慶大霉素（Gentamicin）、頭孢霉素、羧芐霉素。1.2 選擇抗生素的確定將芍藥試管苗的子葉接種于培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0mg/L+GA30.5mg/L。將芍藥愈傷組織分成大小均勻小塊，接種于培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 2.0mg/L。在以上2 種培養(yǎng)基中，分別添加不同濃度慶大霉素、潮霉素，觀察子葉不定芽生長(zhǎng)情況和愈傷組織分化、褐化情況，確定遺傳轉(zhuǎn)化選擇壓和最佳轉(zhuǎn)化受體。1.3 抑菌抗
現(xiàn)代園藝 2022年7期2022-03-30
- 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的新暗色柱節(jié)孢菌遺傳轉(zhuǎn)化
轉(zhuǎn)化法，將含有潮霉素抗性基因（hyg）和綠色熒光蛋白基因（mGFP）的雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到新暗色柱節(jié)孢菌中，并在陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)，旨在為進(jìn)一步研究新暗色柱節(jié)孢菌的菌絲生長(zhǎng)過(guò)程、形態(tài)特征、致病菌與火龍果之間的互作致病機(jī)制等提供技術(shù)支撐。1 材料與方法1.1 菌株和質(zhì)粒新暗色柱節(jié)孢菌是本實(shí)驗(yàn)室從紅皮紅肉火龍果莖條分離鑒定并保存的。雙元表達(dá)載體pG-Hyg-GFP 是以pCAMBIA1300 為骨架，插入trpC啟動(dòng)子、潮霉素抗性基因（hyg）和
熱帶生物學(xué)報(bào) 2021年4期2022-01-11
- 馬鈴薯品種‘并薯6號(hào)’遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
此載體上攜帶有潮霉素抗性基因Hyg（圖1），并由本課題組保存。圖1 pMDC85載體圖Figure 1 pMDC85 vector1.1.3 培養(yǎng)基及其成分目前，關(guān)于馬鈴薯愈傷組織誘導(dǎo)及再生所用的激素主要包括生長(zhǎng)素類(lèi)（IAA、NAA 和2,4-D）、細(xì)胞分裂素類(lèi)（6-BA 和 ZT）以及 GA3等[15,16]。以已發(fā)表的研究報(bào)道為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了以下的試驗(yàn)。本試驗(yàn)所用的基本培養(yǎng)基為MS（Murashige ＆ Skoog Medium），各種培養(yǎng)基的命名以及
中國(guó)馬鈴薯 2021年5期2021-12-21
- 農(nóng)桿?菌介導(dǎo)葡萄灰葡萄孢遺傳轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化
BIG3C（含潮霉素抗性基因）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 灰葡萄孢分生孢子制備 將灰葡萄孢BcSD3菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，參照李廷剛等［16］報(bào)道的方法進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)孢；使用滅菌水洗脫分生孢子，并用三層滅菌濾紙過(guò)濾去除菌絲等雜質(zhì)；離心收集分生孢子，并調(diào)節(jié)至適宜濃度，保存?zhèn)溆谩?.2.2 根癌農(nóng)桿菌菌液制備 采用熱擊法將pBIG3C質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株中；篩選陽(yáng)性菌斑接種于LB液體培養(yǎng)基（含50μg/mL卡那霉素）中，于28℃
山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年10期2021-11-15
- Fonsecaea monophora聚酮合酶基因的CRISPR-Cas9敲除載體的構(gòu)建
ophora于潮霉素B濃度為0、100、200、300、400 μg/mL的PDA抗性平板上劃線，25℃培養(yǎng)1周后，拍照觀察判斷是否抗性適用于篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。②構(gòu)建含有潮霉素抗性的pFC334-AarⅠ載體：設(shè)計(jì)引物在gRNA骨架前插入兩個(gè)AarⅠ酶切位點(diǎn)(見(jiàn)表1)，pFC334質(zhì)粒作為模板，分別擴(kuò)增相對(duì)應(yīng)的兩個(gè)片段(1號(hào)和2號(hào)片段)，PCR條件：98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 1 kb/min，30 cycles。切膠回收純化后融合成一個(gè)片段
中國(guó)真菌學(xué)雜志 2021年5期2021-11-01
- 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的栓皮櫟體胚遺傳轉(zhuǎn)化初步研究
tII基因編碼潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞后可賦予對(duì)潮霉素的抗性，用于抗性組織的篩選[9]。在櫟類(lèi)樹(shù)種中，Vidal等以Quercus robur的葉片誘導(dǎo)的體胚作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化受體，成功實(shí)現(xiàn)植株再生[10]。álvarez等建立了成齡歐洲栓皮櫟（Quercus suber）的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，獲得了43%的轉(zhuǎn)化率[11]。而栓皮櫟的遺傳轉(zhuǎn)化研究較少。本研究以栓皮櫟體細(xì)胞胚胎發(fā)生為受體系統(tǒng)，研究影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素，為利用基因工程對(duì)栓皮櫟進(jìn)
西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2021年5期2021-10-21
- 抗生素對(duì)刺芹側(cè)耳菌絲生長(zhǎng)的影響
、頭孢噻肟鈉、潮霉素等抗生素的敏感性是運(yùn)用該技術(shù)的關(guān)鍵，而且選擇合適的篩選標(biāo)記基因以及抗生素濃度對(duì)提高轉(zhuǎn)化效率都具有很大的影響。在此背景下，筆者擬在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的刺芹側(cè)耳的遺傳轉(zhuǎn)化研究中，對(duì)常用抗生素對(duì)刺芹側(cè)耳菌絲生長(zhǎng)的影響進(jìn)行研究和探索，以期為進(jìn)一步建立并優(yōu)化根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的刺芹側(cè)耳的遺傳轉(zhuǎn)化體系提供理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)將相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。1 材料與方法1.1 供試菌株和試劑供試菌株為刺芹側(cè)耳“國(guó)森一號(hào)”菌絲體，保藏于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所。供試抗生
上海農(nóng)業(yè)科技 2021年2期2021-04-09
- 雞爪槭金陵丹楓組培再生體系的建立
對(duì)羧芐青霉素和潮霉素的敏感性，篩選獲得羧芐青霉素的臨界值為300～400mg/L，潮霉素的臨界值為2.5mg/L。關(guān)鍵詞：金陵丹楓;再生體系;羧芐青霉素;潮霉素中圖分類(lèi)號(hào)：S792.350.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2021）01-0054-05作者簡(jiǎn)介：朱璐（1987—），女，山東淄博人，博士，助理研究員，研究方向?yàn)殡u爪槭遺傳育種。E-mail：luzhu@jaas.ac.cn。通信作者：李倩中，研究員，研究方向?yàn)殚蕵?shù)新品種選育及種質(zhì)
江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年1期2021-03-15
- 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的少孢節(jié)叢孢菌遺傳轉(zhuǎn)化體系研究
ma公司產(chǎn)品；潮霉素，Roche公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)、誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM)及共培養(yǎng)基(CM)按照常規(guī)方法制備。1.1.3 主要儀器設(shè)備 恒溫?fù)u床(ZHWY-2102C)，PCR儀(TC4000)，真菌培養(yǎng)箱(MJX280)，恒溫培養(yǎng)箱(HIQ-X100)，振蕩培養(yǎng)箱(ZHWY-2102C)，常規(guī)離心機(jī)(Beckmanmicrofuge16)，瓊脂糖水平電泳儀(DYCP-31DN)，凝膠成像儀(Bi
動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 2021年2期2021-02-07
- GFP標(biāo)記的4種鏈格孢菌對(duì)棗樹(shù)的侵染研究
試劑和培養(yǎng)基：潮霉素B、卡那霉素、利福平、氨芐青霉素、鏈霉素的濃度分別為10、50、20、100、100 mg·mL-1，乙酰丁香酮（AS） 0.2 mg·mL-1；以IM 為培養(yǎng)基[28]，以LB 為液體培養(yǎng)基[29]。供試植物：棗樹(shù)，栽培于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃。1.2 方 法1.2.1 4 種鏈格孢菌對(duì)潮霉素B 的敏感性的測(cè)定采用生長(zhǎng)速率法分別測(cè)定供試的4 種鏈格孢菌對(duì)潮霉素B 的敏感性。分別將ZN01、ZN02、ZN03 和ZN-XR 這4 種鏈格孢菌置
經(jīng)濟(jì)林研究 2020年2期2020-07-01
- 小球藻的沼液馴化、抗生素敏感性分析和選擇標(biāo)記篩選
、氨芐青霉素、潮霉素的敏感性，篩選小球藻基因工程選擇標(biāo)記的抗生素。1 實(shí)驗(yàn)1.1 水樣、試劑與儀器按GB/T 1.1-2009方法采集石家莊民心河、邢臺(tái)小黃河、衡水鹽河、保定府河、邯鄲沁河的夏季(6月)水樣。DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒，OMEGA BIO-TEK公司；G418、氨芐青霉素、潮霉素，索萊寶公司。自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，Countstar公司；GeneAmp?9700型PCR儀；DYY-6D型電泳槽，北京六一儀器廠；UV752N型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)
化學(xué)與生物工程 2020年4期2020-05-08
- 黃梁木遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)對(duì)篩選物敏感性研究
物的卡那霉素和潮霉素，以及抑菌劑頭孢霉素，在對(duì)篩選物較敏感的誘導(dǎo)不定芽分化和生根階段，進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，為后續(xù)黃梁木遺傳轉(zhuǎn)化研究特別是為提高黃梁木耐寒、抗蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ)。1 材料和方法1.1 試驗(yàn)材料、農(nóng)桿菌株和試劑飽滿成熟的黃梁木種子，來(lái)源于廣西藥用植物園本草綱目園區(qū)內(nèi)一株20 a 樹(shù)齡的健康植株。在超凈臺(tái)上將種子滅菌，轉(zhuǎn)移到無(wú)激素的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，25 d 后，切取無(wú)菌植株的子葉和胚軸作為不定芽分化誘導(dǎo)材料；生根誘導(dǎo)材料則將無(wú)菌植株莖的下部
- 大群體轉(zhuǎn)基因大麥后代快速篩選研究
摘要：以攜帶有潮霉素標(biāo)記基因的RNAi轉(zhuǎn)基因大麥和常規(guī)大麥為材料，采用葉片涂抹法進(jìn)行了潮霉素篩選濃度確定及轉(zhuǎn)基因大麥T2代和回交后代的篩選和PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，3 000 mg/L潮霉素連續(xù)涂抹3次，5 d后轉(zhuǎn)基因大麥涂抹區(qū)域無(wú)受害癥狀，生長(zhǎng)受害率顯著低于無(wú)涂抹處理。潮霉素涂抹檢測(cè)結(jié)果與其PCR檢驗(yàn)結(jié)果的符合度為96.2%，目的基因篩選準(zhǔn)確率可達(dá)61.8%。表明所建立的活體幼苗潮霉素葉片涂抹法篩選轉(zhuǎn)基因大麥快速，直觀、準(zhǔn)確，具有一定可行性。關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因
甘肅農(nóng)業(yè)科技 2019年8期2019-09-10
- 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物肌肉組織中6種氨基糖苷類(lèi)藥物殘留
素、壯觀霉素和潮霉素B等6種氨基糖苷類(lèi)藥物。該方法操作簡(jiǎn)便，能大幅縮短檢測(cè)周期，靈敏度高，還能有效避免七氟丁酸等離子對(duì)試劑造成的儀器污染及離子抑制等問(wèn)題，為動(dòng)物源性食品中氨基糖苷類(lèi)藥物監(jiān)控提供快速、準(zhǔn)確可靠的定性和定量技術(shù)。1 材料與方法1.1 儀器與試劑1.1.1 儀器Aglient 1290超高效液相色譜儀、配有電噴霧（ESI）離子源的AB Sciex Triple Quad TM 5500質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex公司）、N-EVAP-24型全自動(dòng)
飼料博覽 2019年5期2019-06-01
- 擬輪枝鐮孢ATMT突變體庫(kù)的構(gòu)建及分析
和擬輪枝鐮孢對(duì)潮霉素B（hygromycin B）的敏感濃度；以含有綠色熒光蛋白基因（）、潮霉素抗性基因（）的穿梭質(zhì)粒為載體，通過(guò)ATMT構(gòu)建GFP標(biāo)記的擬輪枝鐮孢突變體庫(kù)；利用潮霉素抗性篩選、的特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)和熒光顯微鏡觀察，檢測(cè)分析T-DNA插入情況及轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性；從突變體庫(kù)中隨機(jī)挑選9個(gè)轉(zhuǎn)化子菌株并進(jìn)行分析，對(duì)其產(chǎn)孢量、分生孢子萌發(fā)率、致病力等進(jìn)行測(cè)定?！窘Y(jié)果】通過(guò)農(nóng)桿菌抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cefo/Amp的濃度為150/150 μg·mL-1時(shí)
中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年8期2019-05-08
- 齒毛菌原生質(zhì)體的制備與轉(zhuǎn)化
株為研究對(duì)象，潮霉素B抗性基因Hyg作篩選標(biāo)記，探究影響齒毛菌原生質(zhì)體制備及再生的多個(gè)重要因素，建立PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系，以獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化菌株.1 材料與方法1.1 材料齒毛菌Cerrenasp.HYB07菌株，由福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏； pCAMBIA1302質(zhì)粒，該質(zhì)粒攜帶有潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hygromycin B phosphotransferase,Hyg)和綠色熒光蛋白(green fluorescent prot
- 虎杖基因PcMYB1真核表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化
n,Kan)，潮霉素(hygromycin,hyg)、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等均購(gòu)于寶生物大連有限公司，所用引物和測(cè)序服務(wù)均由武漢生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。1.2 方法1.2.1PcMYB1基因植物表達(dá)載體構(gòu)建以含有35S啟動(dòng)子的P5002質(zhì)粒為模板，以含有目的基因PcMYB1的1K-5質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)特異引物經(jīng)PCR分別擴(kuò)增虎杖PcMYB1的基因片段與35S啟動(dòng)子片段，回收純化后分別將其克隆至pUC19的BamHⅠ/Pst
- 靈芝轉(zhuǎn)化體系的建立
6靈芝原生質(zhì)體潮霉素抗性篩選對(duì)靈芝原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基中的潮霉素抗性濃度進(jìn)行篩選，分別選取濃度值為15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 mg/mL的潮霉素放入固體MYG培養(yǎng)基中，將制備好的原生質(zhì)體均勻地平鋪到MYG培養(yǎng)基中，5～7 d后觀察原生質(zhì)體再生結(jié)果。1.7PEG介導(dǎo)的靈芝原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化靈芝原生質(zhì)體制備參照試驗(yàn)前期得到的最優(yōu)靈芝原生質(zhì)體制備方法進(jìn)行[14]。取1×106個(gè)靈芝原生質(zhì)體，放入MYG 液體培養(yǎng)基中
安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年26期2018-09-19
- 斜紋夜蛾SlSCP-2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)膽固醇的吸收
3組.1.5 潮霉素B篩選濃度確定在轉(zhuǎn)染前對(duì)CHO細(xì)胞進(jìn)行劑量反應(yīng)分析，以確定潮霉素B的最適濃度.細(xì)胞對(duì)潮霉素B敏感性的測(cè)定分別用0，50，100，250，500，750和1000 mg/L 7個(gè)不同濃度梯度的Hygromycin B處理相同數(shù)目但密度小于25%的CHO細(xì)胞，重復(fù)3組，每隔24 h觀察記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，直到120 h(約第5天)，收集細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色法統(tǒng)計(jì)3組細(xì)胞的死亡率，以殺死所有細(xì)胞的潮霉素B最低濃度(500 mg/L)為篩選濃度.2
- 小分子海洋抗菌肽鱟素Ⅰ里氏木霉表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建
、氨芐青霉素和潮霉素，均購(gòu)自Sigma公司；NotⅠ、SfiⅠ酶和X-gal，均購(gòu)自TaKaRa公司。1.2 方法1.2.1 天然鱟素基因(Tac)序列的人工合成 從GenBank中獲得鱟素Ⅰ的堿基序列，根據(jù)絲狀真菌里氏木霉偏愛(ài)密碼子優(yōu)化其序列：在其5′端和3′端分別加上NotⅠ和SfiⅠ酶酶切位點(diǎn)，并補(bǔ)齊宿主中信號(hào)肽的部分序列，設(shè)計(jì)目的基因序列如下：5′-GGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCTAAGTGGTGCTT-CCGCGTCTGCTAC
江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年14期2018-08-08
- CRISPR/Cas9技術(shù)編輯新疆甜瓜全緣葉基因
的表達(dá)載體帶有潮霉素抗性基因，因此，需要對(duì)甜瓜耐受潮霉素的最大濃度進(jìn)行檢測(cè)，為下一步的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。在植物的遺傳轉(zhuǎn)化中，抗潮霉素基因是最常用的標(biāo)記基因之一，由于HPT基因(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)片段較小，約只有1.1 kb左右,其很容易與沒(méi)有選擇標(biāo)記的目的片段結(jié)合并導(dǎo)入植物基因組[18]。其毒性機(jī)理是通過(guò)干擾植物細(xì)胞葉綠體和線粒體中的核糖體與延長(zhǎng)因子EF-2的結(jié)合，從而對(duì)肽鏈的延長(zhǎng)進(jìn)行抑制。當(dāng)潮霉素抗性基因轉(zhuǎn)化到植株中時(shí)，它使轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞或組織具有對(duì)潮霉素
新疆農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年2期2018-04-17
- Vasorin基因穩(wěn)定敲除HepG2細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)功能研究
/Cas9，將潮霉素B的抗性基因插入VASN基因，從而破壞了VASN的讀框，使VASN蛋白的表達(dá)發(fā)生異常；然后再利用潮霉素B抗性篩選獲得穩(wěn)定敲除VASN的HepG2細(xì)胞株；進(jìn)而，利用穩(wěn)定敲除VASN的HepG2細(xì)胞株研究VASN的生物學(xué)功能和分子機(jī)制。1 材料和方法1.1 材料HepG2細(xì)胞由本室保存；表達(dá)載體pCas-guide和pSilencer2.1-U6hygro由軍事醫(yī)學(xué)研究院鄭曉飛教授惠贈(zèng)；pBackZero-T載體、平末端PCR產(chǎn)物加A試劑盒
生物技術(shù)通訊 2018年2期2018-04-09
- 杉木遺傳轉(zhuǎn)化中抗生素種類(lèi)和濃度的篩選
為材料，探討了潮霉素、卡那霉素和頭孢霉素對(duì)其生長(zhǎng)的影響以及對(duì)農(nóng)桿菌GV3101的抑菌效果?！窘Y(jié)果】潮霉素濃度為40 mg/L和60 mg/L時(shí)，杉木嫩芽和莖段培養(yǎng)42 d存活率分別為8.78%、13.97%和7.05%、5.93%，表現(xiàn)出良好的效果；80 mg/L時(shí)，其生長(zhǎng)完全被抑制?？敲顾貪舛葹?00 mg/L時(shí)，杉木嫩芽和莖段在80 d時(shí)存活率仍高達(dá)75.04%和80.37%。300 mg/L的抗生素抑菌劑頭孢霉素能有效抑制農(nóng)桿菌GV3101生長(zhǎng)，且
- LoxP-Cre重組技術(shù)在構(gòu)建馬鈴薯光呼吸代謝支路中的應(yīng)用
農(nóng)桿菌侵染以及潮霉素篩選，獲得了馬鈴薯轉(zhuǎn)化植株。分子檢測(cè)表明，轉(zhuǎn)基因植株中3個(gè)目的基因在mRNA水平均能得到表達(dá)，但在蛋白水平無(wú)表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植株在表型和微型薯的發(fā)育上與野生型植株無(wú)明顯區(qū)別，可能原因是由于多基因一次性轉(zhuǎn)化與葉綠體定位的雙重要求，增加了馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化及蛋白有效表達(dá)的難度。馬鈴薯；多基因轉(zhuǎn)化；光呼吸在C3植物中，通過(guò)構(gòu)建光呼吸代謝支路以增加碳同化效率，從而提高生物量，這些支路包括Kebeish支路[1]、Maier支路[2]和Carvalho支
- 土壤中盾殼霉雙標(biāo)記平板計(jì)數(shù)法的建立及應(yīng)用
菌轉(zhuǎn)化法構(gòu)建了潮霉素基因和綠色熒光蛋白基因標(biāo)記的雙標(biāo)記盾殼霉菌株,并測(cè)定轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量和菌核致腐能力,初步分析了該方法計(jì)數(shù)土壤盾殼霉的有效性和可行性。結(jié)果顯示,潮霉素基因和綠色熒光蛋白基因可以穩(wěn)定地遺傳和表達(dá),并且部分轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量和菌核致腐能力與出發(fā)盾殼霉菌株JN-CM沒(méi)有顯著差異。加入土壤中的盾殼霉轉(zhuǎn)化子可以在含潮霉素(50 μg/mL)、氯霉素(100 μg/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的PDA平板培養(yǎng),雜菌得到充分抑制,呈
植物保護(hù) 2017年5期2017-10-09
- 中華結(jié)縷草對(duì)潮霉素的敏感性研究
)中華結(jié)縷草對(duì)潮霉素的敏感性研究劉建華1,裴福云1,宋鳳鳴1,雷江麗2*(1.廣東省深圳市鐵漢生態(tài)環(huán)境股份有限公司,廣東 深圳 518040;2.廣東省深圳市中科院仙湖植物園/廣東省深圳市南亞熱帶植物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 深圳 518004)研究了中華結(jié)縷草3種不同外植體對(duì)不同濃度潮霉素溶液的敏感性。結(jié)果表明:中華結(jié)縷草不同外植體對(duì)潮霉素的敏感性存在差異，其中種子經(jīng)50 mg/L潮霉素處理3周后,發(fā)芽率極顯著減少,只有6%;愈傷組織經(jīng)20 mg/L潮霉素
江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2017年9期2017-09-12
- 浮萍遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化*
入抑菌抗生素和潮霉素，再生培養(yǎng)基是在文獻(xiàn)8中的再生培養(yǎng)基中加入抑菌抗生素和潮霉素。1.2.2浮萍轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化使用不同種類(lèi)的農(nóng)桿菌（農(nóng)桿堿型 EHA105、胭脂堿型 GV3101和C58C1）對(duì)浮萍進(jìn)行侵染，統(tǒng)計(jì)侵染3 d后浮萍愈傷的GUS瞬時(shí)表達(dá)率確定哪種農(nóng)桿菌對(duì)浮萍的侵染效率最高。采 用 0、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L的乙酰丁香酮侵染同一批浮萍愈傷，統(tǒng)計(jì)侵染3 d后浮萍愈傷組織的GUS瞬時(shí)表達(dá)率
生物學(xué)通報(bào) 2017年1期2017-04-09
- AtDES1基因在大白菜中的遺傳轉(zhuǎn)化
mg·L-1的潮霉素作為抗性芽和根的抗生素篩選濃度，轉(zhuǎn)化效率較高，轉(zhuǎn)化率為6%。[結(jié)論]抗性植株經(jīng)PCR和qRT-PCR鑒定表明DES1基因已成功整合到大白菜基因組中且表達(dá)量有不同程度的提高。大白菜； 硫化氫； 轉(zhuǎn)化； 轉(zhuǎn)基因植株大白菜(BrassicacampestrisL.ssp.pekinensi)屬于十字花科蕓薹屬，是北方秋冬季主要的蔬菜作物。但近年來(lái)由于環(huán)境的污染，白菜種植遭受到重金屬、干旱和冷凍等多種逆境脅迫的影響，給大白菜生產(chǎn)造成很大損失。運(yùn)
山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版） 2017年3期2017-03-28
- Botryosphaeria dothidea突變體庫(kù)的構(gòu)建及分析
blot證明潮霉素B抗性基因整合到B.dothidea基因組中且可穩(wěn)定遺傳。以B.dothideasdau11-126為對(duì)照，對(duì)526株轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速率和致病性進(jìn)行分析，篩選獲得了8個(gè)變異明顯且穩(wěn)定的突變體，以期為B.dothidea致病基因的分離、克隆和功能鑒定奠定基礎(chǔ)。Botryosphaeria dothidea;農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化（ATMT）;突變體;篩選Botryosphaeria dothidea屬子囊菌門(mén)，葡萄座腔菌屬，是引致林果潰瘍
山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版） 2017年1期2017-03-17
- 金花茶花絲愈傷組織培養(yǎng)及其對(duì)抗生素敏感性研究
究了卡那霉素和潮霉素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)的影響，為下一步開(kāi)展金花茶轉(zhuǎn)基因研究提供技術(shù)參考。1 材料與方法1.1 試驗(yàn)材料供試金花茶種植于廣東省農(nóng)科院環(huán)境園藝研究所山茶種質(zhì)資源圃。1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 外植體表面消毒 試驗(yàn)于2015年1月開(kāi)始進(jìn)行，摘取剛剛金花茶露黃、但尚未開(kāi)放的幼嫩花蕾，在超凈工作臺(tái)上用70%乙醇分別浸泡1、3、5、10、15 min，然后用滅菌水沖洗 3次，用刀片剝掉花瓣和萼片，取出雄蕊，將花絲和花藥分別接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25
廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年11期2017-03-10
- 潮霉素B預(yù)混劑的臨床驅(qū)蟲(chóng)試驗(yàn)研究
318000)潮霉素B預(yù)混劑的臨床驅(qū)蟲(chóng)試驗(yàn)研究費(fèi)陳忠1，蘇世廣2，李貴玉3，許月英2，吳昊1，范超1，肖文龍1，薛飛群1*(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，合肥 230031； 3. 浙江海正藥業(yè)有限公司，臺(tái)州 318000)為了解潮霉素B預(yù)混劑臨床驅(qū)除絳蟲(chóng)線蟲(chóng)的有效性和給藥時(shí)間的合理性，依據(jù)獸藥臨床試驗(yàn)規(guī)范，試驗(yàn)選擇了蠕蟲(chóng)自然感染皖西麻黃雞824只，按要求隨機(jī)分為3組，分別為潮霉素B預(yù)混劑治療
中國(guó)獸藥雜志 2017年1期2017-02-15
- 菟絲子生防菌“魯保一號(hào)”生物學(xué)特性及T-DNA插入突變體庫(kù)的構(gòu)建
繼代6次培養(yǎng)后潮霉素B抗性穩(wěn)定，隨機(jī)挑取的20個(gè)轉(zhuǎn)化子均能PCR克隆出潮霉素基因，轉(zhuǎn)化子是由T-DNA插入引起的，且篩選抗性能夠穩(wěn)定遺傳。以上研究為后期篩選獲得致病力穩(wěn)定的遺傳改良菌株，并進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。魯保一號(hào)；炭疽菌；生物學(xué)特性；突變體菟絲子(Cuscutachinensis)是一類(lèi)惡性寄生雜草[1]，其纖細(xì)的莖蔓纏繞在植物的莖稈上，借吸根從植物體內(nèi)汲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，主要危害大豆(Glycinemax)、牧草和蔬菜等作物[2-4]?！棒敱Ｒ惶?hào)”是山東
草業(yè)學(xué)報(bào) 2017年1期2017-02-15
- 平菇疏水蛋白Po.hyd基因RNAi載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
，該轉(zhuǎn)化子具有潮霉素抗性，且在熒光顯微鏡下可檢測(cè)到綠色熒光信號(hào)，Po.hyd基因的表達(dá)量為野生型的43%，干擾載體T-DNA片段以單拷貝的形式整合在轉(zhuǎn)化子基因組內(nèi)。糙皮側(cè)耳；疏水蛋白；RNAi；根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)疏水蛋白（hydrophobin）是表面活性最高的蛋白之一，具有可在臨界面形成兩性親和蛋白膜的特殊性質(zhì)，在食品生產(chǎn)及保藏領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。2009年Cox等[3]將里氏木霉（Trichoderma reesei）的Ⅱ型疏水蛋白HFBⅡ加
食品科學(xué) 2016年11期2016-11-12
- 不同抗生素對(duì)金發(fā)草愈傷組織生長(zhǎng)分化的影響
類(lèi)(卡那霉素、潮霉素、頭孢噻呋鈉和氨芐青霉素)和濃度對(duì)金發(fā)草愈傷組織生長(zhǎng)分化的影響，來(lái)確定適用于金發(fā)草遺傳轉(zhuǎn)化體系中的抗性篩選劑和抑菌劑。結(jié)果表明：(1)金發(fā)草愈傷組織對(duì)卡那霉素很敏感，且其分化率隨著卡那霉素濃度的增加顯著減少(P=0.01)。當(dāng)卡那霉素濃度為10 mg·L-1時(shí)，金發(fā)草愈傷組織的生長(zhǎng)分化受到明顯抑制，且有大量的白化苗形成，但分化率仍有36.56%；當(dāng)卡那霉素濃度為15 mg·L-1時(shí)，金發(fā)草愈傷組織的分化率為11.94%，只有很少部分的愈
廣西植物 2016年10期2016-11-11
- dGFP-GUS基因標(biāo)記新疆棉花黃萎病原菌的研究
【方法】以帶有潮霉素抗性篩選基因的PUCCATPH載體以及pCAMBIA1304載體作為骨架，構(gòu)建trpc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP-GUS基因的新疆棉花黃萎病菌表達(dá)載體1304-P-ORF，導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101和AGL-1中。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)(ATMT)法分別轉(zhuǎn)入新疆棉花黃萎病原菌VD-1和VD-278中，對(duì)表達(dá)效果進(jìn)行檢測(cè)?！窘Y(jié)果】篩選的潮霉素B濃度為30 μg/mL，農(nóng)桿菌AGL-1對(duì)黃萎病菌的轉(zhuǎn)化效率比GV3101高40%。T0代經(jīng)含有潮霉素B的PDA培養(yǎng)
新疆農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年1期2016-04-13
- PEG-CaCl2介導(dǎo)牛樟芝遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建
l2濃度。利用潮霉素抗性、綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)標(biāo)記和PCR擴(kuò)增驗(yàn)證擬轉(zhuǎn)化子。結(jié)果表明：新鮮的牛樟芝菌絲體在10 mg/mL溶壁酶溶液中，30℃條件下酶解4 h，原生質(zhì)體的獲得率為3.55×105個(gè)/mL；菌絲體和原生質(zhì)體在潮霉素B濃度分別為60 μg/mL和40 μg/mL時(shí)不能生長(zhǎng)，最終確定篩選擬轉(zhuǎn)化子的潮霉素B濃度為60 μg/mL；濃度為20%～40%的PEG均可介導(dǎo)牛樟芝原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，且40%的
貴州農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年4期2016-03-01
- 慢病毒介導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)miR-183的人卵巢癌skov3細(xì)胞系
，經(jīng)嘌呤霉素、潮霉素B篩選后獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，最后用RT-PCR法檢測(cè)miR-183在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。結(jié)果分離培養(yǎng)出穩(wěn)定高表達(dá)和低表達(dá) mirR-183的單克隆細(xì)胞株。結(jié)論實(shí)驗(yàn)成功建立了穩(wěn)定表達(dá)miR-183的 skov3細(xì)胞系，為研究miR-183的生物學(xué)功能提供了有效的細(xì)胞模型。關(guān)鍵詞：慢病毒；skov3細(xì)胞； miR-183；卵巢瘤作者單位：河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南洛陽(yáng) 471003卵巢癌是女性生殖道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，由于其發(fā)病十分隱匿，大多數(shù)
食管疾病 2015年4期2016-01-20
- 羽衣甘藍(lán)下胚軸農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化
化和生根過(guò)程中潮霉素B篩選壓力，最后對(duì)抗性植株進(jìn)行了潮霉素B篩選基因的PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，在MS + 6-BA 5.0 mg/L+AgNO39.0 mg/L培養(yǎng)基中不定芽分化率最高，為84.17%；農(nóng)桿菌侵染濃度OD600值為0.5、侵染5 min時(shí)利于遺傳轉(zhuǎn)化，分化率為69.17%；不定芽分化和生根過(guò)程中潮霉素B篩選壓力分別為4.0 mg/L和30.0 mg/L；潮霉素B篩選基因的PCR鑒定結(jié)果，在預(yù)期的602 bp處出現(xiàn)了條帶，初步證明潮霉素B篩選基
生物技術(shù)通報(bào) 2015年6期2015-10-27
- RNA干擾技術(shù)對(duì)犬小孢子菌PQ-LRP基因沉默的研究
克隆位點(diǎn),引入潮霉素抗性基因,先后構(gòu)建PUC-PLULT、PCB309-PLULT載體。應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)PCB309-PLULT載體對(duì)犬小孢子菌PQ-LRP基因表達(dá)的干擾作用。結(jié)果構(gòu)建了中間載體PUC-PLUT、PUC-PLULT,并通過(guò)PCR、基因測(cè)序進(jìn)行鑒定。成功構(gòu)建了長(zhǎng)為8 825 bp的干擾載體PCB309-PLULT,并通過(guò)酶切測(cè)定為該目的載體;篩選出犬小孢子菌轉(zhuǎn)化子的潮霉素最佳濃度為300 mg/L;用實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)犬小孢子菌PQ-
中華皮膚科雜志 2014年8期2014-12-18
- 不同濃度卡那霉素、潮霉素對(duì)楸樹(shù)試管苗生長(zhǎng)的影響
隆[7-8]。潮霉素是一種常用的抗性篩選藥物，其抗性基因表達(dá)產(chǎn)物是一種蛋白激酶，通過(guò)磷酸化潮霉素使其喪失活性。由于在真核和原核生物中潮霉素篩選假陽(yáng)性率低，重復(fù)性好，現(xiàn)在通過(guò)潮霉素對(duì)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行篩選已被廣泛應(yīng)用[9-12]?？敲顾睾?span id="j5i0abt0b" class="hl">潮霉素是目前遺傳轉(zhuǎn)化體系廣泛應(yīng)用的2 種抗生素。我們進(jìn)行了卡那霉素和潮霉素對(duì)楸樹(shù)無(wú)性系試管苗生長(zhǎng)的影響研究，以確定抗生素對(duì)楸樹(shù)莖段分化和生根的敏感質(zhì)量濃度，建立有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為楸樹(shù)特性良種的選育與轉(zhuǎn)化提供重要理論和實(shí)踐指
生物技術(shù)通訊 2014年6期2014-11-29
- 秈稻R996轉(zhuǎn)Pi9基因純系的篩選及稻瘟病抗性鑒定
因植株后代進(jìn)行潮霉素抗性、GUS染色和PCR檢測(cè)分析，鑒定出Pi9基因陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；經(jīng)稻瘟病抗性鑒定，從T1代符合孟德?tīng)柗蛛x比(1∶2∶1)的分離群體中，成功篩選出轉(zhuǎn)Pi9基因的秈稻R996純系。秈稻R996；Pi9基因；轉(zhuǎn)基因植株；稻瘟病抗性1 材料和方法1.1 材 料R996轉(zhuǎn) Pi9基因植株；含 Pi9基因植株75–1–127；稻瘟病菌生理小種110–2。1.2 方 法1.2.1 潮霉素抗性篩選選擇 T1代符合孟德?tīng)柗蛛x比(1∶2∶1)的轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)
湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版） 2014年6期2014-08-31
- 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的虎杖莖尖轉(zhuǎn)化研究
8 mg/L 潮霉素的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽。利用該體系從 300 塊莖尖外植體中共轉(zhuǎn)化獲得 15株抗性再生植株，經(jīng) PCR 和 Southern 雜交檢測(cè)，有 6 株虎杖的基因組中已整合進(jìn)了目的基因?；⒄?莖尖 根癌農(nóng)桿菌 遺傳轉(zhuǎn)化虎杖（Polygonum cuspidatumSieb. et Zucc.）是蓼科多年生草本植物，根或根莖入藥。虎杖根中含有大量具有治療效用的次級(jí)代謝物，如白藜蘆醇、虎杖苷、蒽醌類(lèi)等。其中白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗衰老、保護(hù)心血管系統(tǒng)
生物技術(shù)通報(bào) 2014年2期2014-04-08
- 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的赭曲霉遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
為受體菌株，以潮霉素B基因作為篩選標(biāo)記，成功建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的赭曲霉遺傳轉(zhuǎn)化體系并對(duì)其轉(zhuǎn)化效率的主要影響因素，如農(nóng)桿菌濃度、孢子濃度、共培養(yǎng)時(shí)間和溫度等進(jìn)行了分析。在最佳條件下，轉(zhuǎn)化效率可以達(dá)到57個(gè)轉(zhuǎn)化子/108個(gè)分生孢子。隨機(jī)挑選的8個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子10代連續(xù)培養(yǎng)結(jié)果表明所獲得的轉(zhuǎn)化子能穩(wěn)定遺傳。該遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立為赭曲霉菌株的定向遺傳改造提供了重要的操作平臺(tái)。赭曲霉 根癌農(nóng)桿菌 轉(zhuǎn)化體系赭曲霉（Aspergillus ochraceus），屬于殼霉
生物技術(shù)通報(bào) 2014年6期2014-03-17
- 向日葵下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化影響因素的研究
計(jì)1.2.1 潮霉素適宜篩選濃度試驗(yàn)將3個(gè)向日葵品種的下胚軸作為外植體，接種到含潮霉素分別為0、5、10、15、20mg／L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每一梯度每一品種接種外植體數(shù)10，各4次重復(fù)。2～3周后調(diào)查下胚軸的分化情況。1.2.2 影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化因素試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中設(shè)置共培養(yǎng)時(shí)間、侵染時(shí)間、農(nóng)桿菌菌液濃度和干燥時(shí)間4個(gè)因子試驗(yàn)，共培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置5個(gè)處理 （1、2、3、4、5d）；侵染時(shí)間設(shè)5個(gè)梯度 （1、5、10、15、20min）；農(nóng)桿菌菌液濃度A600值分別
- 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化Bt（cry1Ab）基因
y1Ab，攜帶潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（Hpt），以玉米的Ubi-1為啟動(dòng)子。1.1.3 試劑 卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）、羧芐青霉素（Car）、乙酰丁香酮（AS）和潮霉素（Hyg）均為Sigma公司產(chǎn)品，Taq DNA聚合酶、dNTP為上海生工產(chǎn)品，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。1.1.4 培養(yǎng)基 甘蔗植株再生及遺傳轉(zhuǎn)化各個(gè)階段的最佳培養(yǎng)基，見(jiàn)表1。表1 甘蔗再生體系建立及遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的組成1.2 方法1.2.1 胚性愈傷的誘導(dǎo)
生物技術(shù)通報(bào) 2013年2期2013-09-13
- 甘藍(lán)枯萎病菌REMI轉(zhuǎn)化體系的建立
將線性化的含有潮霉素抗性基因的pUCATPH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化甘藍(lán)枯萎病菌A6菌株的原生質(zhì)體，摸索獲得轉(zhuǎn)化子最適的潮霉素篩選濃度以及不同限制性內(nèi)切酶和酶量對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響；利用PCR（polymerase chain reaction）技術(shù)對(duì)潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明轉(zhuǎn)化子的最適潮霉素篩選濃度為50μg／mL；轉(zhuǎn)化效率較高的限制性內(nèi)切酶為HindⅢ，并且轉(zhuǎn)化效率最高時(shí)的酶量為20U。利用該轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建了含1 050個(gè)轉(zhuǎn)化子的甘藍(lán)枯萎病菌轉(zhuǎn)化子庫(kù)，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行
植物保護(hù) 2013年3期2013-08-27
- PEG介導(dǎo)的玉米彎孢葉斑病菌遺傳轉(zhuǎn)化
化供體，它具有潮霉素抗性基因（HyB）標(biāo)記和氨芐青霉素抗性基因（Amp）標(biāo)記，有HindⅢ等多種限制酶的單酶切位點(diǎn)。1.2 培養(yǎng)基及緩沖液1.2.1 菌絲培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，酵母膏15g。1.2.2 原生質(zhì)固體再生培養(yǎng)基NaNO32g，K2HPO41g，KCl 52g，MgSO4·7H2O 0.05g，F(xiàn)eSO4·7H2O 10mg，蔗糖20g，瓊脂18g。1.2.3 酶解緩沖液pH 5.6檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液配制的0.7mol／L K
植物保護(hù) 2012年6期2012-09-28
- 穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的nm23-H1表達(dá)缺失人肺腺癌細(xì)胞株的構(gòu)建及其體內(nèi)外活性檢測(cè)
細(xì)胞株中，利用潮霉素B篩選出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株A549/nm23-H1-shRNA-luc。借助活體成像技術(shù)，對(duì)構(gòu)建的細(xì)胞株進(jìn)行體內(nèi)外生物發(fā)光檢測(cè)，為后續(xù)轉(zhuǎn)移相關(guān)的動(dòng)物試驗(yàn)的研究奠定好基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料 nm23-H1表達(dá)缺失的人肺腺癌細(xì)胞株A549（A549/nm23-H1-shRNA）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；細(xì)胞培養(yǎng)基是RPMI-1640（GIBCO）并添加10%的小牛血清（NCS, GIBCO）；質(zhì)粒表達(dá)載體（PGL4.50）購(gòu)自Pro
中國(guó)肺癌雜志 2012年3期2012-09-10
- 轉(zhuǎn)基因及常規(guī)水稻穗期對(duì)潮霉素的敏感性
314016)潮霉素B是一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，可破壞細(xì)胞中核糖體的功能。水稻中潮霉素通過(guò)單鍵細(xì)胞葉綠體和線粒體中的核糖體與延長(zhǎng)因子EF-2的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制肽鏈的延長(zhǎng)，破壞細(xì)胞功能，使敏感組織褐化死亡而呈現(xiàn)毒性癥狀。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)導(dǎo)入水稻后，使細(xì)胞具有了潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)活性，從而可忍耐較高濃度的潮霉素毒性，因此，在水稻轉(zhuǎn)基因育種中，hpt基因已成為最有效的選擇基因之一。先期通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)育的Bt克螟稻都攜帶潮霉素抗性基因Hy
浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年3期2012-07-31
- 導(dǎo)入抗逆基因的轉(zhuǎn)雙抗蟲(chóng)基因741楊的獲得1)
因，篩選標(biāo)記為潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)。1.2 外植體不定芽再生體系的優(yōu)化選取生長(zhǎng)良好、健壯的繼代培養(yǎng)試管苗，用解剖刀剪取葉片，在葉片一側(cè)垂直主脈剪1個(gè)傷口，然后將其接種于附加不同質(zhì)量濃度 6－BA(0.1、0.5、1.0、1.5 mg/L)和 IBA(0.05、0.10、0.20 mg/L)的 MS 培養(yǎng)基中，接種時(shí)葉正面朝上放置，下表皮與培養(yǎng)基接觸。每種培養(yǎng)基接種40個(gè)葉片(4個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿接種10塊片)，培養(yǎng)溫度(25±2)℃，光照強(qiáng)度2
東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2012年1期2012-06-13
- 玉米彎孢葉斑病菌ATMT轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化及轉(zhuǎn)GFP單孢的獲得
［9］，并含有潮霉素B(HyB)和卡那霉素(kan)抗性，由 Marina Franceschetti(john inner Center，UK)惠贈(zèng)。1．2 主要試劑潮霉素B、頭孢噻肟鈉、卡那霉素、乙酰丁香酮、MES購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司;其他所用試劑均購(gòu)于北京萬(wàn)鑫化業(yè)商貿(mào)中心。1．3 方法1．3．1 頭孢噻肟鈉對(duì)農(nóng)桿菌抑菌濃度的測(cè)定 將農(nóng)桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖培至OD600約為0．6后，取100 μL分別涂于含有頭孢噻肟鈉 (0
河北科技師范學(xué)院學(xué)報(bào) 2011年3期2011-10-10
- 一株玉米彎孢葉斑病菌生長(zhǎng)緩慢型突變株獲得及T-DNA右翼序列分析
μg·mL-1潮霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃下震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，得到OD660=0.6的農(nóng)桿菌菌液；然后取農(nóng)桿菌菌液250μL，加到新鮮的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后在液體IM培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，將農(nóng)桿菌菌液濃度調(diào)至OD660=0.2備用。取誘導(dǎo)后的農(nóng)桿菌菌液與萌發(fā)分生孢子懸浮液等體積混合，涂布于IM（10 mM glucose）固體培養(yǎng)基的玻璃紙上，在黑暗條件下培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，然后將IM固體培養(yǎng)基上的
黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào) 2011年3期2011-03-13
- 潮霉素A的生物合成研究進(jìn)展
253023)潮霉素A是一種天然的抗生素，1953年第一次從吸水鏈霉菌NRRL 2388的發(fā)酵產(chǎn)物中被分離得到［1］，由5-脫氫-α-L-巖藻糖、(E-3-(3，4-二羥苯基)-2-甲基丙烯酸和2L-2-氨基-2-脫氧-4，5-O-亞甲基肌醇3個(gè)結(jié)構(gòu)單元組成。早期的研究顯示，潮霉素A具有廣泛的生物學(xué)活性，如抗菌活性［2］(G+、G－)、抗紅細(xì)胞凝聚活性和抗密螺旋體活性［3］及免疫抑制活性［4］等。進(jìn)一步的研究表明，潮霉素A抗菌作用機(jī)理為其通過(guò)與核糖體50S
微生物學(xué)雜志 2011年2期2011-01-11
- 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜蔓枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
。本研究以攜帶潮霉素 B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph) 的pBIG2RHPH2作為轉(zhuǎn)化載體，根癌農(nóng)桿菌C58C1作為轉(zhuǎn)化介體，轉(zhuǎn)化甜瓜蔓枯病菌的強(qiáng)致病菌株DB11。研究發(fā)現(xiàn)，甜瓜蔓枯病菌的最優(yōu)轉(zhuǎn)化體系為：甜瓜蔓枯病菌的分生孢子懸浮液濃度為1×106個(gè)孢子/mL，農(nóng)桿菌懸浮液OD600為0.15，共培養(yǎng)時(shí)間48 h，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加200 μg/mL乙酰丁香酮，選擇培養(yǎng)基添加100 μg/mL潮霉素B、200 μg/mL頭孢噻肟鈉、200 μg/mL氨芐青霉素和2
生物工程學(xué)報(bào) 2010年6期2010-10-11
- 甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化中不同階段潮霉素抗性篩選
因，其選擇試劑潮霉素B（Hygromycin B，簡(jiǎn)稱(chēng)Hyg）與卡那霉素一樣，是一種氨基糖苷類(lèi)抗生素（Gritz and Davis，1983），它來(lái)源于鏈球菌（Streptomyces hygroscopicus），Linda等（1983）從大腸桿菌中克隆出hpt，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌和酵母菌中，得到了潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子[7]。從1989年開(kāi)始hpt基因成為主要的篩選標(biāo)記基因，其編碼的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶可將磷酸基團(tuán)共價(jià)地加到Hyg的第4位上，通過(guò)酶促磷酸化作用而使
中國(guó)糖料 2010年2期2010-09-10