余明興 詹文輝 江松洪 謝榮敏

（1.福建省浦城縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 363400；2.福建省南平市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 353000）

A型口蹄疫是由A型口蹄疫病毒引起偶蹄動(dòng)物（尤其是豬、牛均可以發(fā)生）的急性、熱性、接觸性動(dòng)物傳染病（目前沒有關(guān)于羊發(fā)生A型口蹄疫的報(bào)道），我國(guó)將其列為一類傳染病，一旦發(fā)生，對(duì)畜牧業(yè)將造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重影響人民生活和畜產(chǎn)品貿(mào)易。為控制撲滅該病將要耗費(fèi)大量人力、物力和財(cái)力，更嚴(yán)重的是，如果該病流行將給畜牧業(yè)造成致命影響，間接經(jīng)濟(jì)損失將遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過直接經(jīng)濟(jì)損失。因此，做好該病的預(yù)防和控制非常重要，特別是做好該病的免疫預(yù)防尤為重要。因?yàn)椋庖呤穷A(yù)防動(dòng)物疫病十分重要也是十分必要的有效手段。

1 檢測(cè)材料準(zhǔn)備

5～50 μL移液器、0.2～10 μL移液器、50～200 μL移液器、50～300μL 12道移液器各一把；移液器槍尖（若干）；96孔一次性抗原抗體反應(yīng)板；無離子水或蒸餾水；口蹄疫A型液相阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒；規(guī)模場(chǎng)乳牛血清40份。

2 操作步驟

1）用包被緩沖液稀釋口蹄疫A型病毒兔抗血清至工作濃度，在酶標(biāo)板上加50μL孔，振蕩，封板或置濕盒內(nèi)，室溫過夜。

2）抗原抗體（對(duì)照血清及待檢血清）反應(yīng)：根據(jù)不同的需要，選擇圖1-圖2中(試劑盒說明書)的一種布局在抗原抗體反應(yīng)板上操作，圖1抗體滴度測(cè)定（定量）檢測(cè)10份樣品布局圖；圖2為抗體滴度測(cè)定（定量）檢測(cè)20份樣品布局圖。稀釋血清：以圖1為例操作，在96孔血清/病毒抗原反應(yīng)板上，以50μL孔的量用PBST兩倍連續(xù)稀釋被檢血清，從1∶4 至 1∶512。 同時(shí)稀釋陽性對(duì)照血清， 從 1∶16～1∶2048；稀釋陰性對(duì)照血清，從 1∶2～1∶4；將病毒抗原用PBST稀釋至工作濃度，以50μL孔的量加入被檢血清、陰性陽性對(duì)照血清至每一稀釋孔內(nèi)，4孔病毒抗原對(duì)照孔僅加入100μL孔稀釋至工作濃度的病毒抗原，振蕩，2～8℃過夜加入等量的病毒抗原后，血清的稀釋度加倍，變?yōu)?1∶8～1∶1024。

圖1 96孔酶標(biāo)板檢測(cè)10份樣品布局圖

圖2 96孔酶標(biāo)板檢測(cè)20份樣品布局圖

3）用PBST連續(xù)洗酶標(biāo)板5次，在洗水紙上甩干，再將抗原抗體混合物從抗原抗體反應(yīng)板上按次序轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)板上的對(duì)應(yīng)孔，50μL/孔，封板，37℃溫育60 min。

4）同上洗板5次，甩干。用豚鼠抗血清稀釋液將口蹄疫A型病毒豚鼠抗血清稀釋至工作濃度，加50μL孔，封板，37℃溫育60 min。

5）同上洗板5次，甩干。用PBST將兔抗豚鼠ⅠgG-辣根過氧化物酶結(jié)合物稀釋至工作濃度，加50 μL/孔，封板，37 ℃溫育 60 min。

6）同上洗板5次，甩干。在洗水紙上甩干，加50μL孔底物溶液 （底物溶液務(wù)必要加雙氧水，每1 mL加10μL本試劑盒配備的3%雙氧水），37℃孵育15 min。15 min后每孔再加50μL終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)板上讀取D492nm值。

3 檢測(cè)結(jié)果判定方法

1）每塊板設(shè)病毒抗原對(duì)照4孔和陰性陽性血清對(duì)照，病毒抗原對(duì)照不加任何血清，直接用PBST稀釋至工作濃度，與血清/病毒抗原復(fù)合物同步加入酶標(biāo)板孔，50μL/孔。病毒抗原對(duì)照至少2個(gè)孔的D492nm值在 1.0～2.0； 陰性對(duì)照血清抗體效價(jià)應(yīng)＜1∶8；陽性對(duì)照抗體效價(jià)應(yīng)在1∶1024±1個(gè)滴度范圍內(nèi)。

2）以病毒抗原對(duì)照平均D492nm值的50%為臨界值，被檢血清D492nm值大于臨界值的孔為陰性孔，小于等于臨界值的孔為陽性孔。某份血清系列稀釋中，陽性孔的最高稀釋倍數(shù)為被檢血清的抗體效價(jià)，若臨界值處于兩個(gè)稀釋孔D492nm值之間，抗體效價(jià)取相鄰陽性孔和陰性孔稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)中間值，如處于1∶64（1og10 的對(duì)數(shù)值為 1.8）與 1∶128（1og10 的對(duì)數(shù)值為2.1）之間，則判定該份血清的抗體效價(jià)為1∶90（1og10的對(duì)數(shù)值為 1.95）。

3）抗體效價(jià)大于或等于1∶128判為口蹄疫A型抗體陽性；1∶64～1∶128 時(shí)，判為可疑；小于或者等于1∶64，判定為陰性。對(duì)于可疑血清樣品，可以復(fù)測(cè)，復(fù)測(cè)抗體效價(jià)大于或等于1∶128，判為陽性，小于1∶128判為陰性。

4 檢測(cè)結(jié)果

共檢測(cè)40份乳牛血清，38份抗體陽性，2份抗體陰性，免疫抗體合格率達(dá)95%。

5 結(jié)果分析

1）檢測(cè)結(jié)果表明，浦城縣乳牛A型口蹄疫免疫抗體合格率較高，超過農(nóng)業(yè)部的要求。這與浦城縣采取的一系列防疫措施確保動(dòng)物免疫質(zhì)量提升密不可分。一是加大宣傳力度，使乳牛場(chǎng)業(yè)主意識(shí)到A型口蹄疫的危害性，提高思想認(rèn)識(shí)，自覺做好A型口蹄疫的免疫工作。二是加強(qiáng)督查指導(dǎo)，不定期到乳牛場(chǎng)進(jìn)行技術(shù)指導(dǎo)，督促乳牛場(chǎng)將消毒制度、免疫制度、用藥制度真正落實(shí)到位。三是強(qiáng)化疫苗儲(chǔ)運(yùn)管理，確保疫苗質(zhì)量。四是規(guī)范免疫操作程序，確保免疫效果。

2）造成免疫效果不到位的原因很多。一是疫苗因素：免疫劑量是否正確、接種疫苗毒株與當(dāng)?shù)亓餍卸局暄逍头隙?、疫苗保管是否到位。二是免疫程序和技術(shù)人員操作因素。三是飼養(yǎng)管理和畜群健康水平情況的影響。要根據(jù)免疫抗體檢測(cè)情況，查找問題、分析原因，加大免疫檢測(cè)工作力度，掌握浦城縣A型口蹄疫疫情動(dòng)態(tài)，及時(shí)提出預(yù)警預(yù)報(bào)。