小麥SnRK2.2基因克隆、表達載體構建及轉化

張照貴+李冰+王佳佳+張桂芝+李斯深

摘 要：SnRK2基因家族成員參與蛋白質的磷酸化，在植物抵御非生物脅迫方面發(fā)揮重要的作用。本研究以水稻SAPK2基因序列為基礎，通過RT-PCR技術克隆得到一個新的小麥SnRK2基因，命名為TaSnRK2.2，并提交到GenBank（登錄號：KJ850253）。TaSnRK2.2基因全長4 118 bp，由9個外顯子和8個內含子組成，包含一個1 026 bp的開放閱讀框，編碼341個氨基酸。SnRK2.2基因序列在禾本科植物中高度保守，TaSnRK2.2與水稻SAPK2以及玉米SnRK2.2親緣關系較近。TaSnRK2.2基因編碼的蛋白質分子量為38.64 kD，理論等電點為5.45，含有SnRK2基因家族典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶保守結構域和多處磷酸化位點。構建了TaSnRK2.2基因過表達載體，轉化擬南芥，獲得轉基因植株，通過RT-PCR方法檢測到TaSnRK2.2基因在擬南芥中穩(wěn)定表達。

關鍵詞：小麥；非生物脅迫；TaSnRK2.2；克隆；轉基因

中圖分類號：S512.1+Q785 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）11-0001-07 小麥是世界上最重要的糧食作物之一，全世界約有35%的人口以小麥為主食，在中國糧食消費總量中，小麥占43%以上。我國地理環(huán)境復雜，自然災害多發(fā)，干旱、鹽堿以及極端溫度等環(huán)境因素嚴重影響小麥產量，威脅小麥糧食生產安全。植物在長期的進化過程中形成了一系列應對復雜多變環(huán)境、抵御逆境脅迫的調控機制，眾多的調控和防御類基因構成了植物應答和抵御逆境脅迫的分子生物學基礎[1～3]。

研究表明，蔗糖非發(fā)酵相關蛋白激酶（Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase， SnRK）參與蛋白質的磷酸化，在植物激素信號傳導、抵御非生物脅迫和調節(jié)植物生長發(fā)育等方面發(fā)揮重要的作用[4～6]。根據(jù)序列相似性和結構域特點，高等植物SnRK基因家族被分為3個亞族：SnRK1、SnRK2、SnRK3[7]。SnRK1基因已經(jīng)從不同的植物中分離和鑒定，其參與植物氮元素、蔗糖以及脂質的代謝、器官發(fā)育與衰老等過程[8～11]。SnRK3基因又稱類鈣調磷酸酶B亞基互作蛋白激酶（calcineurin B-like protein interacting protein kinase， CIPK）基因[12，13]，能夠介導Ca2+信號的傳遞和提高植物的抗逆性[14～17]。SnRK2基因數(shù)目較少，編碼植物特有的蛋白激酶，主要參與植物應對逆境脅迫、養(yǎng)分利用和生長發(fā)育等過程，到目前為止已經(jīng)鑒定了10個家族成員，統(tǒng)一命名為SnRK2.1～SnRK2.10[18]。

在小麥中，多個SnRK2基因家族成員已經(jīng)被克隆并進行了功能驗證。PKABA1是第一個被克隆的SnRK2家族成員，可被水分脅迫和脫落酸（Abscisic acid， ABA）誘導表達[19，20]。TaSnRK2.3可被聚乙二醇（Polyethylene glycol， PEG）、ABA、NaCl以及冷脅迫誘導，轉TaSnRK2.3基因的擬南芥植株失水率下降，光合作用增強，細胞內脯氨酸含量增加，提高了對干旱、鹽漬以及冷害的耐受性[21]。轉TaSnRK2.4基因擬南芥植株較對照增加了對干旱、鹽分以及冷脅迫的抵抗能力，同時種子萌發(fā)延緩、初生根增長以及生物量增加，表明TaSnRK2.4在植物抗逆性和生長發(fā)育方面發(fā)揮作用[22]。轉TaSnRK2.7基因的擬南芥同樣增加了對多種逆境脅迫的抗性，但其活性不被ABA誘導，說明TaSnRK2.7參與非ABA信號轉導通路[23]。轉TaSnRK2.8基因的擬南芥除增強了對逆境抗性外，其可溶性糖含量降低，說明TaSnRK2.8在碳水化合物的代謝中發(fā)揮作用[24]。小麥W55a也屬于SnRK2家族成員，該基因受干旱等非生物脅迫的誘導[25]。以上研究表明，小麥SnRK2基因在抵御非生物脅迫方面發(fā)揮重要作用，并且參與植物的生長發(fā)育和碳水化合物的代謝過程。

隨著植物基因工程技術的發(fā)展，利用分子生物學方法克隆小麥抗逆相關基因，研究其生物學功能，探索植物抗旱分子機理是近來研究的熱點。水稻SAPK2基因是植物SnRK基因家族成員之一，本研究利用水稻SAPK2基因通過同源克隆的方法得到一個新的小麥SnRK2基因家族成員——TaSnRK2.2，并構建該基因的植物過表達載體，轉化擬南芥，為進一步研究該基因的功能及在逆境條件下的表達特征奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 小麥品種魯麥21用于TaSnRK2.2基因cDNA及gDNA的克隆和序列分析。Columbia型擬南芥用于遺傳轉化。

1.1.2 菌株和載體 大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans1-T1和克隆載體pEASY-T1購自北京全式金生物技術有限公司，農桿菌菌株GV3101和表達載體PBI121由本實驗室保存。

1.1.3 酶、試劑盒及其他耗材 LA Taq酶、限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶以及dNTP購自寶生物工程（大連）有限公司。反轉錄試劑盒The RevertAidTM Premium First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司。RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司。普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。其它化學藥品為國產分析純。

1.1.4 引物和測序 本試驗所用PCR引物合成及DNA測序工作由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA、gDNA提取和第一鏈cDNA合成 小麥總RNA提取步驟按照TRIzol試劑說明書進行。小麥gDNA的提取參照改良的CTAB法[26]進行。第一鏈cDNA的合成參照The RevertAidTM Premium First Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行。

1.2.2 目的基因的克隆 以水稻SAPK2基因（GenBank登錄號：AB125303）的mRNA序列為探針搜索小麥EST數(shù)據(jù)庫，選取與探針序列相似性高的小麥EST，經(jīng)DNAMAN軟件拼接組裝成TaSnRK2.2的電子克隆序列。利用NCBI中ORF finder程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）進行開放閱讀框（open reading frame， ORF）預測。用Primer Premier 5.0軟件在ORF兩側設計引物Sn1，上游引物Sn1-F：5′-ATGGAGCGGTACGAGGTG-3′；下游引物Sn1-R：5′-CACGCCTGCTCGTCACAA-3′

利用Sn1引物對小麥cDNA和gDNA進行PCR擴增。PCR反應體系為20 μL：10×PCR buffer 2 μL，dNTPs（各2.5 mmol/L）1.6 μL，LA Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，Sn1-F（10 μmol/L）和Sn1-R（10 μmol/L）各1 μL，cDNA或gDNA 1 μL（100 ng），ddH2O 13.2 μL。反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性35 s，56℃退火35 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段?；厥债a物與pEASY-T1載體于25℃連接15 min，并轉化Trans1-T1感受態(tài)細胞。轉化產物均勻涂布在含100 mg/L氨芐青霉素（Ampicillin， Amp）的LB平板上，37℃條件下培養(yǎng)12～16 h。隨機挑選菌斑，在含有100 mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)4～5 h，取1 μL菌液進行PCR檢測。挑選陽性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.3 基因的生物信息學分析 運用DNAMAN軟件對測序結果進行比對，確定基因結構，并與其他物種的序列進行相似性分析。利用ProtParam程序（http：//web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸序列的理化性質。利用NetPhos2.0 Server程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預測蛋白序列中的磷酸化位點。利用MEGA 6.0軟件進行序列比對和進化分析。功能區(qū)域和活性位點分析通過在線程序PROSITE（http：//expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html）進行。利用SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和Swiss-Model 程序（http：//swissmodel.expasy.org/）對蛋白質二級結構和高級結構進行分析。

1.2.4 表達載體的構建和農桿菌轉化 參照質粒小提試劑盒說明書的步驟，提取pEASY-T1-TaSnRK2.2和PBI121質粒。設計引物Sn2，上游引物Sn2-F：5′-TAGGATCCATGGAGCGGTACGAGGTG-3′（下劃線標注的堿基代表BamH Ⅰ內切酶識別位點）；下游引物Sn2-R：5′-AT-GAATTCCACGCCTGCTCGTCACAA-3′（下劃線標注的堿基代表EcoRⅠ內切酶識別位點）。利用Sn2引物對pEASY-T1-TaSnRK2.2質粒進行PCR擴增。PCR產物和PBI121質粒用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，回收目的片段，用T4 DNA連接酶連接，構建CaMV 35S啟動子驅動的正義35S∶ TaSnRK2.2過表達載體。

將構建好的表達載體轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)培養(yǎng)后提取質粒，采用凍融法轉化農桿菌GV3101。將轉化后的農桿菌菌液加到含有50 mg/L 利福平（Rifampicin， Rif）和50 mg/L卡那霉素（Kanamycin， Kan）的YEP固體培養(yǎng)基上，在28℃條件下培養(yǎng)2～3天。轉化子長出后挑取單菌落于YEP液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，提取質粒進行酶切和測序驗證。

1.2.5 擬南芥的侵染和轉基因植株的鑒定 將驗證正確的農桿菌接種于含有50 mg/L Rif的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)至菌液渾濁。按照1∶ 100的體積比將菌液轉接到50 mL含有50 mg/L Rif 的YEP液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6。5 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，用等體積含有5%蔗糖和0.02% Silwet L-77的侵染液重懸菌體，即可用于擬南芥的轉化。采用花序浸染法轉化擬南芥，侵染時將擬南芥平放，使花序浸到浸染液中約10 s左右，然后將擬南芥平放到培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)24 h后正常培養(yǎng)。

將收獲的擬南芥種子在超凈臺中用70%乙醇滅菌5 min，2.6%次氯酸鈉消毒10 min，用滅菌水沖洗干凈。將滅菌的種子鋪到含有50 mg/L Kan的1/2 MS培養(yǎng)基上，4℃條件下春化2天。轉移到正常條件下培養(yǎng)7天后，轉化植株幼苗能夠在含有Kan的培養(yǎng)基上正常生長，葉片呈綠色，非轉化幼苗則會呈現(xiàn)黃化狀態(tài)。將轉基因幼苗移植到基質中培養(yǎng)，植株長成后提取RNA進行RT-PCR檢測，引物為Sn3，上游序列Sn3-F：5′-GCGAGAATGAGGCTAGGTTC-3′；下游序列Sn3-R：5′-CGTCGTCTATGTCGTCCAG-3′。

2 結果與分析

2.1 TaSnRK2.2基因克隆

以水稻SAPK2基因為探針篩選小麥EST數(shù)據(jù)庫，選取2條序列相似性高且相互重疊的EST片段，CJ785127和DR741853。利用DNAMAN軟件拼接，得到長度為1 359 bp的電子克隆序列，預測包含一個長度為1 026 bp的ORF。在ORF兩側設計引物Sn1對小麥cDNA和gDNA進行PCR擴增，產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后顯示大小約為1 000 bp和4 000 bp（圖1）。

測序結果表明，TaSnRK2.2基因的cDNA全長1 038 bp，包含長度為1 026 bp的ORF，編碼341個氨基酸，與預期結果基本一致。與cDNA相對應的gDNA序列全長（從ATG到TGA）4 118 bp，包含9個外顯子和8個內含子（圖2），基因結構與水稻、玉米以及擬南芥的SnRK2.2相同，并且不同物種外顯子大小和序列保守性較內含子強。序列已提交至GenBank（登錄號：KJ850253）。

2.2 TaSnRK2.2基因的生物信息學分析

TaSnRK2.2基因編碼的蛋白質分子量為38.64 kD，理論等電點為5.45。PROSITE程序分析表明（圖3A），蛋白序列中含有絲氨酸/蘇氨酸基因家族典型的保守結構域（第4～260位的氨基酸）、ATP結合位點（第10～33位的氨基酸）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點（第119～131位的氨基酸）。NetPhos2.0 Server程序分析蛋白序列中含有7處絲氨酸（Serine， Ser）、1處蘇氨酸（Threonine， Thr）和5處酪氨酸（Tyrosine， Tyr）磷酸化位點（圖3C）。運用SOPMA和Swiss-Model對TaSnRK2.2蛋白質序列的高級結構進行預測，TaSnRK2.2基因編碼的蛋白質含有38.12%的α螺旋、37.2%的無規(guī)則卷曲、8.21%的β轉角以及16.42%的擴展鏈，具有和SnRK2基因家族類似的蛋白質三級結構（圖3B）。

TaSnRK2.2基因與水稻、玉米和擬南芥SnRK2.2基因核苷酸序列的相似性分別為87.23%、85.48%和60.24%，氨基酸序列的相似性分別為91.20%、89.44%和66.76%。將TaSnRK2.2與水稻、玉米、擬南芥SnRK2基因家族成員做聚類分析，結果表明，SnRK2基因分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個亞族，TaSnRK2.2屬于Ⅱ亞族，與SAPK2和ZmSnRK2.2親緣關系較近（圖4）。

2.3 表達載體的構建和鑒定

用Sn2引物擴增質粒pEASY-T1-TaSnRK2.2，PCR產物與PBI121-GUS質粒（約14.7 kb）同時進行BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切（圖5）?；厥諑в忻盖形稽c的TaSnRK2.2片段（1 026 bp）和PBI121載體雙酶切片段（約12.7 kb），經(jīng)T4 DNA連接酶連接，構建由CaMV 35S啟動子驅動的、正義35S∶ TaSnRK2.2過表達載體（圖6）。將構建好的載體轉化大腸桿菌感受態(tài)，培養(yǎng)后提取質粒，采用凍融法轉化農桿菌菌株GV3101，酶切鑒定陽性克?。▓D7）。

2.4 擬南芥的轉化及RT-PCR檢測

采用花序浸染法轉化擬南芥，收獲T1代轉基因擬南芥的種子，經(jīng)適當干燥并消毒后平鋪在含有Kan的1/2 MS培養(yǎng)基上。PBI121載體帶有Kan抗性基因，轉基因擬南芥幼苗在含有 Kan的培養(yǎng)基上生長正常，而非轉基因幼苗生長不正常，發(fā)生黃化（圖8）。利用RT-PCR檢測目標基因在T1代轉基因植株中的表達情況，結果如圖9，非轉基因擬南芥植株中無TaSnRK2.2基因表達，而在轉基因植株中檢測到TaSnRK2.2基因的表達。

3 討論與結論

蛋白質的可逆磷酸化由蛋白激酶和蛋白磷酸酶共同調控，廣泛參與植物對逆境脅迫和病蟲害刺激的應答、植物體內能量代謝和信號轉導過程[27， 28]。大量的植物蛋白激酶已被分離和鑒定，許多蛋白激酶處于植物對逆境脅迫感知和響應的中心環(huán)節(jié)[29]。植物SnRK2屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，各成員以不同的調控方式參與多種逆境脅迫應答，在擬南芥、水稻、玉米、大豆、高粱、煙草等植物中已經(jīng)進行了廣泛的研究和報道[30～35]。在小麥中，克隆了6個SnRK2基因并進行了功能分析，其在小麥抵御逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。

本研究通過同源克隆結合RT-PCR方法克隆得到一個新的小麥SnRK2基因——TaSnRK2.2。TaSnRK2.2基因由9個外顯子和8個內含子組成，包含一個1 026 bp的ORF，編碼341個氨基酸。序列比對和進化分析表明，SnRK2.2基因在禾本科植物中高度保守，TaSnRK2.2與水稻SAPK2以及玉米SnRK2.2親緣關系較近。SAPK2和ZmSnRK2.2受NaCl和高滲脅迫誘導表達[29，36]，推測TaSnRK2.2可能具有相同的生物學功能。TaSnRK2.2編碼蛋白質含有SnRK2基因家族典型的絲氨酸/蘇氨酸保守結構域，具有ATP結合位點和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點，同時含有絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點。由此推測，TaSnRK2.2基因可能參與蛋白質的磷酸化，介導信號轉導，參與小麥應對滲透脅迫的反應。

為了研究TaSnRK2.2基因在逆境脅迫中的作用，構建了TaSnRK2.2基因的植物過表達載體，采用花序浸染法轉化擬南芥，獲得了轉TaSnRK2.2基因的擬南芥植株。通過RT-PCR方法檢測到TaSnRK2.2基因在擬南芥中穩(wěn)定表達，為該基因進一步的功能分析奠定了基礎，以期為小麥抗逆分子育種提供優(yōu)良的候選基因資源。

參 考 文 獻：

[1] Bartels D， Sunkar R. Drought and salt tolerance in plants[J]. Critical Reviews in Plant Sciences， 2005， 24： 23-58.

[2] Ingram J， Bartels D. The molecular basis of dehydration tolerance in plants [J]. Annual Review of Plant Biology， 1996， 47： 377-403.

[3] Ramanjulu S， Bartels D. Drought and desiccation induced modulation of gene expression in plants [J]. Plant， Cell and Environment， 2002， 25： 141-151.

[4] Fujii H， Zhu J K. Osmotic stress signaling via protein kinases [J]. Cellular and Molecular Life Sciences， 2012， 69： 3165-3173.

[5] Kulik A， Wawer I， Krzywińska E， et al. SnRK2 protein kinases-key regulators of plant response to abiotic stresses [J]. OMICS： A Journal of Integrative Biology， 2011， 15： 859-872.

[6] Shukla V， Mattoo A K. Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase 2 （SnRK2）： a family of protein kinases involved in hyperosmotic stress signaling [J]. Physiology and Molecular Biology of Plants， 2008， 14： 91-100.

[7] Hrabak E M， Chan C W， Gribskov M， et al. The Arabidopsis CDPK-SnRK superfamily of protein kinases [J]. Plant Physiology， 2003， 132： 666-680.

[8] Alderson A， Sabelli P A， Dickinson J R， et al. Complementation of snf1， a mutation affecting global regulation of carbon metabolism in yeast， by a plant protein kinase cDNA [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，1991，88：8602-8605.

[9] Halford N G， Hey S， Jhurreea D， et al. Metabolic signalling and carbon partitioning： role of Snf1-related （SnRK1） protein kinase [J]. Journal of Experimental Botany， 2003， 54： 467-475.

[10] Muranaka T， Banno H， Machida Y. Characterization of tobacco protein kinase NPK5， a homolog of Saccharomyces cerevisiae SNF1 that constitutively activates expression of the glucose-repressible SUC2 gene for a secreted invertase of S. cerevisiae [J]. Molecular and Cellular Biology， 1994， 14： 2958-2965.

[11] Purcell P C， Smith A M， Halford N G. Antisense expression of a sucrose non-fermenting-1-related protein kinase sequence in potato results in decreased expression of sucrose synthase in tubers and loss of sucrose-inducibility of sucrose synthase transcripts in leaves [J]. The Plant Journal， 1998， 14： 195-202.

[12] Kim K N， Cheong Y H， Gupta R， et al. Interaction specificity of Arabidopsis calcineurin B-like calcium sensors and their target kinases [J]. Plant Physiology， 2000， 124： 1844-1853.

[13] Shi J， Kim K N， Ritz O， et al. Novel protein kinases associated with calcineurin B-like calcium sensors in Arabidopsis [J]. The Plant Cell， 1999， 11： 2393-2405.

[14] Liu J， Zhu J K. A calcium sensor homolog required for plant salt tolerance [J]. Science， 1998， 280： 1943-1945.

[15] Qiu Q S， Guo Y， Dietrich M A， et al. Regulation of SOS1， a plasma membrane Na+/H+ exchanger in Arabidopsis thaliana， by SOS2 and SOS3 [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2002， 99： 8436-8441.

[16] Qiu Q S， Barkla B J， Vera-Estrella R， et al. Na+/H+ exchange activity in the plasma membrane of Arabidopsis [J]. Plant Physiology， 2003， 132： 1041-1052.

[17] Shi H， Ishitani M， Kim C， et al. The Arabidopsis thaliana salt tolerance gene SOS1 encodes a putative Na+/H+ antiporter [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2000， 97： 6896-6901.

[18] Hrabak E M， Chan C W， Gribskov M， et al. The Arabidopsis CDPK-SnRK superfamily of protein kinases [J]. Plant Physiology， 2003， 132： 666-680.

[19] Anderberg R J， Walker-Simmons M. Isolation of a wheat cDNA clone for an abscisic acid-inducible transcript with homology to protein kinases [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1992， 89： 10183-10187.

[20] Holappa L D， Walker-Simmons M. The wheat abscisic acid-responsive protein kinase mRNA， PKABA1， is up-regulated by dehydration， cold temperature， and osmotic stress [J]. Plant Physiology， 1995， 108： 1203-1210.

[21] Tian S， Mao X， Zhang H， et al. Cloning and characterization of TaSnRK2.3， a novel SnRK2 gene in common wheat [J]. Journal of Experimental Botany， 2013， 64： 2063-2080.

[22] Mao X， Zhang H， Tian S， et al. TaSnRK2.4， an SNF1-type serine/threonine protein kinase of wheat （Triticum aestivum L.）， confers enhanced multistress tolerance in Arabidopsis [J]. Journal of Experimental Botany， 2010， 61： 683-696.

[23] Zhang H， Mao X， Jing R， et al. Characterization of common wheat （Triticum aestivum L.） TaSnRK2.7 gene involved in abiotic stress responses [J]. Journal of Experimental Botany， 2011， 62： 975-988.

[24] Zhang H， Mao X， Wang C， et al. Overexpression of a common wheat gene TaSnRK2.8 enhances tolerance to drought， salt and low temperature in Arabidopsis [J]. PLoS One， 2010， 5： e16041.

[25] Xu Z S， Liu L， Ni Z Y， et al. W55a encodes a novel protein kinase that is involved in multiple stress responses [J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2009， 51： 58-66.

[26] Van der Beek J， Verkerk R， Zabel P， et al. Mapping strategy for resistance genes in tomato based on RFLPs between cultivars： Cf9 （resistance to Cladosporium fulvum） on chromosome 1 [J]. Theoretical and Applied Genetics， 1992， 84： 106-112.

[27] Cohen P. Review Lecture： Protein phosphorylation and hormone action [J]. Biological Sciences， 1988， 234： 115-144.

[28] Knight H. Calcium signaling during abiotic stress in plants [J]. International Review of Cytology， 1999， 195： 269-324.

[29] Kobayashi Y， Yamamoto S， Minami H， et al. Differential activation of the rice sucrose nonfermenting1-related protein kinase2 family by hyperosmotic stress and abscisic acid [J]. The Plant Cell， 2004， 16： 1163-1177.

[30] Boudsocq M， Barbier-Brygoo H， Laurière C. Identification of nine sucrose non-fermenting 1-related protein kinases2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana [J]. Journal of Biological Chemistry， 2004， 279： 41758-41766.

[31] Kelner A， Pkala I， Kaczanowski S， et al. Biochemical characterization of the tobacco 42-kD protein kinase activated by osmotic stress [J]. Plant Physiology， 2004， 136： 3255-3265.

[32] Kolukisaoglu ， Weinl S， Blazevic D， et al. Calcium sensors and their interacting protein kinases： genomics of the Arabidopsis and rice CBL-CIPK signaling networks [J]. Plant Physiology， 2004， 134： 43-58.

[33] Li L B， Zhang Y R， Liu K C， et al. Identification and bioinformatics analysis of SnRK2 and CIPK family genes in sorghum [J]. Agricultural Sciences in China， 2010， 9： 19-30.

[34] Xiang Y， Huang Y， Xiong L. Characterization of stress-responsive CIPK genes in rice for stress tolerance improvement [J]. Plant Physiology， 2007， 144： 1416-1428.

[35] Zou H， Zhang X， Zhao J， et al. Cloning and characterization of maize ZmSPK1， a homologue to nonfermenting1-related protein kinase2 [J]. African Journal of Biotechnology， 2006， 5： 490-496.

[36] Huai J， Wang M， He J， et al. Cloning and characterization of the SnRK2 gene family from Zea mays [J]. Plant Cell Reports， 2008， 27： 1861-1868. 山 東 農 業(yè) 科 學 2014，46（11）：8～11，14

[29] Kobayashi Y， Yamamoto S， Minami H， et al. Differential activation of the rice sucrose nonfermenting1-related protein kinase2 family by hyperosmotic stress and abscisic acid [J]. The Plant Cell， 2004， 16： 1163-1177.

[30] Boudsocq M， Barbier-Brygoo H， Laurière C. Identification of nine sucrose non-fermenting 1-related protein kinases2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana [J]. Journal of Biological Chemistry， 2004， 279： 41758-41766.

[31] Kelner A， Pkala I， Kaczanowski S， et al. Biochemical characterization of the tobacco 42-kD protein kinase activated by osmotic stress [J]. Plant Physiology， 2004， 136： 3255-3265.

[32] Kolukisaoglu ， Weinl S， Blazevic D， et al. Calcium sensors and their interacting protein kinases： genomics of the Arabidopsis and rice CBL-CIPK signaling networks [J]. Plant Physiology， 2004， 134： 43-58.

[33] Li L B， Zhang Y R， Liu K C， et al. Identification and bioinformatics analysis of SnRK2 and CIPK family genes in sorghum [J]. Agricultural Sciences in China， 2010， 9： 19-30.

[34] Xiang Y， Huang Y， Xiong L. Characterization of stress-responsive CIPK genes in rice for stress tolerance improvement [J]. Plant Physiology， 2007， 144： 1416-1428.

[35] Zou H， Zhang X， Zhao J， et al. Cloning and characterization of maize ZmSPK1， a homologue to nonfermenting1-related protein kinase2 [J]. African Journal of Biotechnology， 2006， 5： 490-496.

[36] Huai J， Wang M， He J， et al. Cloning and characterization of the SnRK2 gene family from Zea mays [J]. Plant Cell Reports， 2008， 27： 1861-1868. 山 東 農 業(yè) 科 學 2014，46（11）：8～11，14

[29] Kobayashi Y， Yamamoto S， Minami H， et al. Differential activation of the rice sucrose nonfermenting1-related protein kinase2 family by hyperosmotic stress and abscisic acid [J]. The Plant Cell， 2004， 16： 1163-1177.

[30] Boudsocq M， Barbier-Brygoo H， Laurière C. Identification of nine sucrose non-fermenting 1-related protein kinases2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana [J]. Journal of Biological Chemistry， 2004， 279： 41758-41766.

[31] Kelner A， Pkala I， Kaczanowski S， et al. Biochemical characterization of the tobacco 42-kD protein kinase activated by osmotic stress [J]. Plant Physiology， 2004， 136： 3255-3265.

[32] Kolukisaoglu ， Weinl S， Blazevic D， et al. Calcium sensors and their interacting protein kinases： genomics of the Arabidopsis and rice CBL-CIPK signaling networks [J]. Plant Physiology， 2004， 134： 43-58.

[33] Li L B， Zhang Y R， Liu K C， et al. Identification and bioinformatics analysis of SnRK2 and CIPK family genes in sorghum [J]. Agricultural Sciences in China， 2010， 9： 19-30.

[34] Xiang Y， Huang Y， Xiong L. Characterization of stress-responsive CIPK genes in rice for stress tolerance improvement [J]. Plant Physiology， 2007， 144： 1416-1428.

[35] Zou H， Zhang X， Zhao J， et al. Cloning and characterization of maize ZmSPK1， a homologue to nonfermenting1-related protein kinase2 [J]. African Journal of Biotechnology， 2006， 5： 490-496.

[36] Huai J， Wang M， He J， et al. Cloning and characterization of the SnRK2 gene family from Zea mays [J]. Plant Cell Reports， 2008， 27： 1861-1868. 山 東 農 業(yè) 科 學 2014，46（11）：8～11，14