RNAi 和GroEL 介導(dǎo)的雙價(jià)轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)TYLCV的抗性

楊瑪麗， 張保龍， 郭佳茹， 趙統(tǒng)敏， 余文貴， 趙麗萍， 王銀磊

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，江蘇 南京210014;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，江蘇 南京210014)

番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)，是一類具有孿生顆粒形態(tài)的植物單鏈DNA 病毒，變異頻率較高［1-6］。由該病毒引起的番茄黃化曲葉病(TYLCD)是目前番茄生產(chǎn)上最為嚴(yán)重的病害之一，已在世界上40 多個(gè)國(guó)家大面積暴發(fā)并逐年加重，給當(dāng)?shù)剞r(nóng)民均造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［7-12］。該病害暴發(fā)突然、擴(kuò)展迅速、危害性極強(qiáng)，一旦發(fā)生化學(xué)方法難以防治。另外，對(duì)雙生病毒的抗性資源的相對(duì)匱乏，抗性遺傳機(jī)制不明確等因素，又增加了利用常規(guī)育種手段進(jìn)行植物雙生病毒抗性改良的難度［13］。近年來(lái)，隨著番茄基因工程技術(shù)的發(fā)展，為利用外源基因提高番茄對(duì)TYLCV 的抗性提供了一條有效途徑。目前主要是通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)病毒蛋白(病毒外殼蛋白、復(fù)制相關(guān)蛋白和運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白)［14-16］、RNAi 或反義RNA 技術(shù)［17-19］、利用煙粉虱體內(nèi)的GroEL分子伴侶蛋白［20-21］等策略來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)雙生病毒的抗性。

然而，利用上述策略提高植物對(duì)雙生病毒的抗性均存在一定的局限性。比如，植物表達(dá)病毒復(fù)制酶基因需要轉(zhuǎn)基因植株的高表達(dá)、復(fù)制酶同時(shí)對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育的干擾及其抗性機(jī)制的不明確都限制了復(fù)制酶基因在抗雙生病毒中的實(shí)際應(yīng)用［22-23］。雙生病毒是DNA 病毒，通過(guò)RNAi 技術(shù)并不能從根本上降解病毒，從而降低了利用RNAi 抗病毒的效果［24］。為了尋找新的有效防治TYLCVD 的策略，本研究根據(jù)RNAi 和GroEL基因抗性機(jī)制的不同，將實(shí)驗(yàn)室前期利用煙粉虱體內(nèi)共生菌GroEL基因構(gòu)建的SUC2-GroEL植物表達(dá)載體，及利用TYLCV 的AC1和AC2反向重復(fù)序列構(gòu)建的植物表達(dá)載體pBI121-AC1-AC2，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法共轉(zhuǎn)化番茄，以期得到含單個(gè)基因和雙基因的抗病再生植株，為番茄抗TYLCV 改良提供新的種質(zhì)資源。

1 材料與方

1.1 材料

1.1.1 植物材料及病毒源 有限生長(zhǎng)類型番茄CT9210 自交系由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。含有侵染性克隆PTYj01 的農(nóng)桿菌EHA105 由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所季英華老師提供。

1.1.2 菌株及載體 大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、根 瘤 農(nóng) 桿 菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105、質(zhì)粒pBIl21 均為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所提供。TA 克隆載體PMD20-T 載體購(gòu)自TaKaRa 公司，載體iHp［25］和pBI121 由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所提供。

1.1.3 試劑 T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶(Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、SacⅠ、XhoⅠ)、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)均購(gòu)自TaKaRa 公司，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，組織基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN 生物公司，質(zhì)粒提取試劑盒、PCR 清潔試劑盒、DNA 片段快速純化/回收試劑盒購(gòu)于AXYGEN 公司。

1.2 方法

1.2.1 植物表達(dá)載體圖譜 反向重復(fù)序列表達(dá)載體pBI121-AC1-AC2及SUC2-GroEL由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所提供，構(gòu)建圖譜見圖1。

圖1 反向重復(fù)序列表達(dá)載體(A)及標(biāo)記載體SUC2-GroEL(B)構(gòu)建圖譜Fig.1 The construction of inverted repeat sequence express vector pBI121-AC1-AC2(A)and plant expression vector SUC2-GroEL(B)

1.2.2 RNAi 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化番茄及轉(zhuǎn)基因植株鑒定

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化番茄。櫻桃番茄感病自交系CT9210 種子用70%乙醇浸泡30 s，然后用10%次氯酸鈉消毒15 min，期間不斷搖動(dòng)，隨后用無(wú)菌水沖洗3 遍，接種于1/2 MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d;取番茄無(wú)菌苗的子葉或下胚軸為外植體，用OD600=0.3 左右的農(nóng)桿菌菌液浸泡感染外植體5 min。取出外植體，置于無(wú)菌干燥濾紙上吸干殘留菌液，轉(zhuǎn)入MS+IAA 0.2 mg/L+6-BA 2.0 mg/L培養(yǎng)基上黑暗處共培養(yǎng)48 h，然后轉(zhuǎn)入MS + IAA 0.2 mg/L+6-BA 2.0 mg/L +頭孢霉素500 mg/L +卡那霉素50 mg/L篩選培養(yǎng)基上，25 ℃、18 h(光)/6 h(暗)的光照周期進(jìn)行培養(yǎng)。每3 周換1 次培養(yǎng)基。約40 d 左右分化出綠色芽點(diǎn);待再生芽長(zhǎng)到3 ～4 cm時(shí)切下并轉(zhuǎn)入1/2MS+IBA 1.0 mg/L+頭孢霉素400 mg/L生根培養(yǎng)基中培養(yǎng);根系發(fā)達(dá)后移栽至土壤。

用CTAB 法提取番茄再生植株葉片總DNA，用引物GroELF496/GroELR1058(表1)驗(yàn)證SUC2-Gro-EL載體，內(nèi)含子特異引物FAD-intronF/FAD-intronR驗(yàn)證pBI121-AC1-AC2載體。PCR 擴(kuò)增程序如下:95℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72℃延伸50 s，30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

選擇PCR 檢測(cè)所得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因番茄再生植株和對(duì)照植株，用Trizol 試劑盒提取植株葉片總RNA。以反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA 為模板，以引物NPTF/NPTR 驗(yàn) 證pBI121-AC1-AC2載 體，以Gro-ELF496/ GroELR1058 驗(yàn)證SUC2-GroEL載體。取10 μl PCR 產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

表1 引物序列及擴(kuò)增片段Table 1 Primer sequences and the sizes of amplified fragments

1.2.3 抗性鑒定 采用TYLCV 侵染性克隆農(nóng)桿菌注射接種法對(duì)3 ～4 葉期苗齡的非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行接種，接種時(shí)用1 ml 一次性注射器吸取TYLCV 侵染性克隆農(nóng)桿菌(OD600=0.5 ～0.6)，在距離根部1 ～2 cm 處取3 點(diǎn)進(jìn)行韌皮部注射，接種植株置于防蟲溫室，在25 ℃、18 h(光)/6 h(暗)的光照周期下培養(yǎng)。提取農(nóng)桿菌注射接種后30 d 的番茄葉片DNA，用引物AV494/COPR［26］進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR 擴(kuò)增程序如下:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的獲得

2.1.1 轉(zhuǎn)基因植株的再生 在轉(zhuǎn)化前，對(duì)番茄外植體進(jìn)行卡那霉素臨界濃度測(cè)定，結(jié)果顯示最佳臨界篩選濃度為90 mg/L。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化番茄CT9210 子葉和下胚軸外植體，篩選獲得卡那霉素抗性番茄植株(圖2)，總計(jì)19 株。

2.1.2 再生番茄植株的PCR 檢測(cè) 提取全部再生植株的總DNA，以引物GroELF496/GroELR1058 檢測(cè)SUC2-GroEL載體，內(nèi)含子特異引物FAD-intronF/FAD-intronR 檢測(cè)pBI121-AC1-AC2載體，以非轉(zhuǎn)基因番茄植株DNA 為對(duì)照。電泳檢測(cè)結(jié)果顯示:利用GroEL基因引物擴(kuò)增，有11 株番茄再生植株能擴(kuò)增出562 bp 的目的條帶(圖3A)，利用RNAi 載體的FAD 引物擴(kuò)增，有9 株能擴(kuò)增出約800 bp 的目的條帶(圖3B)，非轉(zhuǎn)基因植株用兩對(duì)引物均沒(méi)有擴(kuò)增到特異條帶，初步推斷GroEL外源基因和AC1、AC2的反向重復(fù)序列已經(jīng)導(dǎo)入番茄基因組中，其中轉(zhuǎn)SUC2-GroEL載體的有2、3、6、9、11、14、15、17 號(hào)植株，轉(zhuǎn)pBI121-AC1-AC2載體的有1、4、5、8、10、13 號(hào)植株，轉(zhuǎn)SUC2-GroEL和pBI121-AC1-AC2雙載體的有3 株(7、12、19 號(hào)植株)。

2.1.3 轉(zhuǎn)基因番茄植株的RT-PCR 檢測(cè) 以引物GroELF496/GroELR1058、NPTF/NPTR 分別對(duì)PCR 檢測(cè)呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株做RT-PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示:11 株轉(zhuǎn)SUC2-GroEL載體的陽(yáng)性苗中，有7 株能擴(kuò)增出562 bp 的目的條帶(圖4A);9 株轉(zhuǎn)pBI121-AC1-AC2載體陽(yáng)性苗中有5 株能擴(kuò)出約600 bp 的目的條帶(圖4B)，轉(zhuǎn)SUC2-GroEL和pBI121-AC1-AC2雙載體的有2 株(7、12 號(hào))。說(shuō)明GroEL外源基因與AC1和AC2的反向重復(fù)序列成功在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。其中轉(zhuǎn)SUC2-GroEL載體的有5 株(2、6、9、14、17 號(hào))，轉(zhuǎn)pBI121-AC1-AC2載體的有3 株(4、10、13 號(hào))。

圖2 番茄的遺傳轉(zhuǎn)化Fig.2 Genetic transformation of tomato

圖3 再生植株［SUC2-GroEL 載體(A)和pBI121-AC1-AC2 載體(B)］的PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The amplification of regenerated tomato plants via SUC2-GroEL vector (A)and pBI121-AC1-AC2 vector (B)by PCR

圖4 再生陽(yáng)性植株［SUC2-GroEL 載體(A)和pBI121-AC1-AC2 載體(B)］的RT-PCR 檢測(cè)Fig.4 The amplification of transgenic tomato plants via SUC2-GroELvector (A)and pBI121-AC1-AC2 vector (B)by RT-PCR

2.2 轉(zhuǎn)基因植株抗病性鑒定

2.2.1 T0代轉(zhuǎn)基因植株抗病性鑒定 提取接種病毒后30 d 的非轉(zhuǎn)基因番茄植株和在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的單/雙價(jià)轉(zhuǎn)基因番茄植株葉片的總DNA，用TYLCV 病毒特異引物AV494/COPR 做PCR 檢測(cè)。結(jié)果如圖5 所示，接種病毒后的非轉(zhuǎn)基因植株能擴(kuò)增出570 bp 的病毒條帶，轉(zhuǎn)基因植株中有3 株擴(kuò)出微弱條帶，7 株未擴(kuò)出條帶。其中轉(zhuǎn)SUC2-GroEL載體的植株中，2 號(hào)和14 號(hào)擴(kuò)出570 bp 的病毒條帶，而6、9、17 號(hào)未擴(kuò)出570 bp 的病毒條帶;轉(zhuǎn)pBI121-AC1-AC2基因的植株中，10 號(hào)擴(kuò)出570 bp 的病毒條帶，4號(hào)和13 號(hào)未擴(kuò)出570 bp 的病毒條帶;轉(zhuǎn)SUC2-Gro-EL/ pBI121-AC1-AC2雙價(jià)載體的7 號(hào)和12 號(hào)植株均未擴(kuò)增出570 bp 的病毒條帶。發(fā)病情況調(diào)查結(jié)果，非轉(zhuǎn)基因番茄植株在接種20 d 時(shí)開始表現(xiàn)癥狀，接種30 d 新葉邊緣黃化、卷曲，葉片皺縮，植株嚴(yán)重矮化，發(fā)病癥狀嚴(yán)重;轉(zhuǎn)基因番茄植株中檢測(cè)到病毒條帶的2、14 號(hào)植株，接種20 d 時(shí)有輕微癥狀，接種30 d 時(shí)的葉片邊緣黃化，卷曲，植株輕度矮化;而檢測(cè)到病毒條帶的10 號(hào)植株在接種20 d 時(shí)沒(méi)有任何癥狀，接種30 d 時(shí)葉片表現(xiàn)輕微黃化，卷曲不明顯;未檢測(cè)到病毒條帶的轉(zhuǎn)基因番茄植株(4、6、7、9、12、13、17 號(hào))均生長(zhǎng)正常，未表現(xiàn)發(fā)病癥狀。

圖5 轉(zhuǎn)基因番茄植株病毒引物PCR 分析Fig.5 The analysis of transgenic tomato plants by PCR with virus primers

2.2.2 T1代轉(zhuǎn)基因番茄的抗病性鑒定 轉(zhuǎn)SUC2-GroEL、pBI121-AC1-AC2、SUC2-GroEL/ pBI121-AC1-AC2不同載體的3 類轉(zhuǎn)基因番茄中，每類選取2 個(gè)T0代未擴(kuò)出病毒條帶株系，每個(gè)株系隨機(jī)挑選10株陽(yáng)性植株進(jìn)行接種。30 d 后對(duì)這些植株提DNA檢測(cè)病毒含量并統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，結(jié)果顯示:在T1代非轉(zhuǎn)基因植株能擴(kuò)增到570 bp 的病毒條帶(圖6);轉(zhuǎn)SUC2-GroELT0代未擴(kuò)出病毒條帶的2 個(gè)株系20個(gè)植株中有7 株擴(kuò)出病毒條帶，帶毒率35%;轉(zhuǎn)pBI121-AC1-AC2T0代未擴(kuò)出病毒條帶的2 個(gè)株系20 個(gè)植株中有5 株擴(kuò)出病毒條帶，帶毒率25%;轉(zhuǎn)SUC2-GroEL/pBI121-AC1-AC2T0代未擴(kuò)出病毒條帶的2 個(gè)株系20 個(gè)植株中有3 株擴(kuò)出病毒條帶，帶毒率是15%(表2)。

圖6 部分轉(zhuǎn)基因番茄植株(T1 代)病毒引物的PCR 分析Fig.6 The analysis of some transgenic tomato plants by PCR with virus primers

表2 T1 代轉(zhuǎn)基因番茄TYLCV 侵染性克隆農(nóng)桿菌注射30 d 后病毒檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection of TYLCV in T1 transgenic tomato 30 d after injection of infections clone

發(fā)病情況調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種30 d 后，非轉(zhuǎn)基因植株已明顯矮化，葉片邊緣黃化、卷曲、皺縮;擴(kuò)出病毒條帶的轉(zhuǎn)基因植株中部分植株的新葉有輕微卷曲，部分植株不表現(xiàn)病癥;未擴(kuò)出病毒條帶的轉(zhuǎn)基因植株均表型正常，表現(xiàn)一定的抗性。

3 討論

通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因?qū)胫参矬w內(nèi)，能夠提高植株的抗病能力，但是在高選擇壓下或病毒發(fā)生變異的情況下，只將單個(gè)基因?qū)胫参铽@得的抗病性還不能達(dá)到滿意的效果，而將多個(gè)與抗病相關(guān)的基因轉(zhuǎn)入到同一個(gè)植物中可能會(huì)提高轉(zhuǎn)基因植物的抗病毒能力。GroEL基因是煙粉虱體內(nèi)共生菌編碼的基因，通過(guò)在轉(zhuǎn)基因植物韌皮部特異表達(dá)GroEL 蛋白，使病毒粒子被包裹在GroEL 蛋白中，抑制病毒的復(fù)制和移動(dòng)，從而達(dá)到轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)TYLCV 的抗性［20］。我們前期研究中構(gòu)建SUC2-GroEL載體并轉(zhuǎn)化番茄，同樣證實(shí)了利用基因GroEL提高番茄黃化曲葉病毒抗性具有可行性［21］。RNA 干擾(RNA interference，RNAi)是動(dòng)植物抗病毒的一種防衛(wèi)機(jī)制，正在被應(yīng)用于作物遺傳改良和抗病毒分子育種。利用RNAi 抗病毒可通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)病毒dsRNA 來(lái)實(shí)現(xiàn)，當(dāng)出現(xiàn)dsRNA 時(shí)，核糖核酸酶III 家族中特異識(shí)別雙鏈RNA 的dicer酶切割dsRNA，并將RNA 降解為21 ～25 bp 的雙鏈小分子干擾RNA［27］。本研究前期研究中采集番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)毒源，利用重疊PCR 技術(shù)獲得TYLCV 的AC1-AC2融合基因片段，構(gòu)建了RNAi 植物表達(dá)載體，同時(shí)沉默了TYLCV 的2 個(gè)目標(biāo)基因。本研究根據(jù)GroEL基因和RNAi 抗性機(jī)制的不同，將構(gòu)建的SUC2-GroEL和pBI121-AC1-AC2兩個(gè)載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，成功獲得了含單基因和雙基因的抗病再生植株，為番茄抗TYLCV 改良提供新的種質(zhì)資源。本研究中對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行TYLCV 侵染性克隆農(nóng)桿菌注射接種鑒定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)SUC2-GroELT0代未擴(kuò)出病毒條帶的2 個(gè)株系植株平均帶毒率35%，轉(zhuǎn)pBI121-AC1-AC2T0代未擴(kuò)出病毒條帶的2 個(gè)株系植株帶毒率25%，轉(zhuǎn)SUC2-GroEL/pBI121-AC1-AC2T0代未擴(kuò)出病毒條帶的2 個(gè)株系植株帶毒率15%，可見，相比轉(zhuǎn)單個(gè)基因的植株，轉(zhuǎn)雙基因的番茄植株中抗病單株的比例更高，發(fā)病單株的癥狀明顯較輕，而利用引物AV494/COPR 進(jìn)行病毒檢測(cè)時(shí)擴(kuò)出的病毒條帶也較弱，因此初步推斷轉(zhuǎn)雙基因的植株抗病能力要優(yōu)于轉(zhuǎn)單基因植株抗病能力。在今后工作中，將進(jìn)一步利用T2代同時(shí)含有RNAi和GroEL的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行TYLCV 接種，研究其抗性的遺傳穩(wěn)定性。

番茄黃化曲葉病自近年在我國(guó)廣東、浙江、江蘇等地發(fā)生以來(lái)，自南向北迅速蔓延至我國(guó)大部分地區(qū)，而不同地區(qū)的病毒變異較大［28-32］，因此，有必要利用各地區(qū)相應(yīng)病毒(番茄黃化曲葉病毒、番木瓜曲葉病毒、中國(guó)番茄黃化曲葉病毒、煙草曲葉病毒等)的侵染性克隆接種鑒定，對(duì)本研究所得轉(zhuǎn)基因材料的抗性進(jìn)行系統(tǒng)研究，確定其是否具備廣譜抗性。

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