田培潔 李詩(shī)君 張 宇 劉 勇， 張松柏， 張德詠，*

（1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410120；2 湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410125）

番木瓜曲葉病毒（papaya leaf curl virus，PaLCuV）、廣東番茄曲葉病毒（tomato leaf curl Guangdong virus，ToLCGDV）和廣西番茄曲葉病毒（tomato leaf curl Guangxi virus，ToLCGXV）均屬雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus），基因組為單鏈環(huán)狀DNA，長(zhǎng)度為2.5～3.0 kb（Varun et al.，2017）。主要侵染雙子葉植物如番茄（Solanum lycopersicum）、番木瓜（Carica papaya）、西番蓮（Eclipta prostrata）、木薯（Manihot esculentaCrantz）和棉花（Gossypium）（Huang &Zhou，2006；Zhang et al.，2010），以及雜草如田麻（Corchoropsis timentosa）、勝紅薊（Ageratum conyzoidesL.）和金盞菊（Siegesbeckia orientalisL.）等（蔡建和等，2007；Venkataravanappa et al.，2019）。曲葉病毒侵染作物，造成葉片嚴(yán)重卷曲、畸形，植株矮化，嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)（Varun et al.，2017）。

曲葉病毒在自然條件下，僅由煙粉虱傳播，且煙粉虱傳毒效率高、速度快（Guo et al.，2015）。我國(guó)廣西、廣東、河南、云南、海南、福建和四川等省都有曲葉病毒發(fā)生危害的報(bào)道（Zhou et al.，2001；Wang et al.，2004；張魯斌 等，2005；熊艷等，2014；謝麗雪 等，2019），呈現(xiàn)隨傳播介體煙粉虱快速擴(kuò)展而快速擴(kuò)散的趨勢(shì)，因此，急需開(kāi)展雙生病毒在我國(guó)的發(fā)生、分布及其危害程度研究，明確其對(duì)我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)作物的潛在威脅。

本試驗(yàn)于2017—2019 年，采集了我國(guó)5 個(gè)省份（甘肅、廣西、海南、河北和云南）疑似感染曲葉病毒的番茄樣本，采用特異性PCR 及常規(guī)測(cè)序，檢測(cè)鑒定曲葉病毒種類(lèi)，并對(duì)PCR 擴(kuò)增序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育和分子進(jìn)化分析，研究結(jié)果可為曲葉病毒的流行分析和致病性研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2017—2019 年，在甘肅、廣西、海南、河北和云南等省番茄主產(chǎn)區(qū)共采集疑似感染曲葉病毒的病葉168 份。

1.2 葉片總DNA 抽提

葉片總DNA抽提采用CTAB 法（Zhang et al.，2010）。將葉片加入液氮研磨，加入CTAB試劑和氯仿/異戊醇（體積比24∶1）后渦旋振蕩，12 000 r · min-1離心5 min 去除沉淀；將水相轉(zhuǎn)移至新管中，加入異丙醇沉淀總DNA，沉淀用ddH2O 溶解后于-20 ℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

采用蔡建和等（2005）設(shè)計(jì)的特異性引物PA（5 ′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3 ′）和PB（5′-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3′）（其中K=G 或T，W=A 或T，V=A、C 或G，S=C或G，Y=C 或T，R=A 或G，B=C、T 或G），擴(kuò)增雙生病毒基因間隔區(qū)及外殼蛋白基因保守序列之間的DNA-A 部分序列。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 PCR 擴(kuò)增和序列測(cè)定

PCR 擴(kuò)增參照Z(yǔ)hang 等（2010）的方法。PCR反應(yīng)體系（20 μL）包括10 × PCR Buffer 10 μL，上游/下游引物（10 μmol · L-1）各0.5 μL，dNTP Mix 1.0 μL，總DNA 1.0 μL，DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 35 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 1.5 min，35 個(gè) 循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物采用MiniBEST Agarose Gel DNA 純化試劑盒（Takara）純化，純化PCR 片段采用T/A 法克隆到pEASY-T5 載體，重組載體送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.5 序列拼接與分析

序列同源性分析采用Genbank 的nblast 進(jìn)行在線分析（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。采用 MEGA v5 軟件構(gòu)建序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析序列最大可能性堿基替換（Tamura et al.，2011）。序列重組分析采用RDP v4.101 軟件（Martin et al.，2015）進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄植株田間癥狀

5 個(gè)省份田間普查發(fā)現(xiàn)，疑似病毒侵染的番茄植株出現(xiàn)植株嚴(yán)重矮化、葉片向上卷曲、葉片深綠增厚且易脫落、易落花、結(jié)果少等癥狀（圖1）。采集所有疑似病毒侵染的番茄植株癥狀類(lèi)似的頂部葉片，帶回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

2.2 曲葉病毒發(fā)生率檢測(cè)

采集的168 份番茄樣本特異性PCR 檢測(cè)結(jié)果表明（圖2），經(jīng)PCR 擴(kuò)增得到與預(yù)期一致的特異性條帶，大小為600 bp 左右。共有42 份番茄樣本檢出曲葉病毒，平均檢出率為25.00%，其中廣西番茄曲葉病毒檢出率最高，達(dá)到50.91%，甘肅檢出率最低，僅為6.67%（表1）。

表1 5 個(gè)省份番茄樣本感染曲葉病毒檢出率

2.3 序列分析及病毒種類(lèi)鑒定

序列同源性比對(duì)結(jié)果表明，5 個(gè)省份的曲葉病毒序列同源性平均為89.82%。海南省5 個(gè)分離物中，HN1、HN3 和HN5 與ToLCGDV同源性最高，達(dá)到99.68%以上；HN2 和HN4 與PaLCuCNV 同源性最高，達(dá)到97.90%以上。廣西分離物之間的同源性相對(duì)較低，平均為93.41%，其中GX2～GX5、GX6～GX8 之間的同源性高達(dá)99.50%，其他分離物之間的同源性也達(dá)98%以上，但兩組之間的同源性相對(duì)較低。甘肅2 個(gè)分離物GS3 和GS11 的同源性高達(dá)99.85%，與ToLCGDV同源性最高，達(dá)99.21%以上。河北5 個(gè)分離物中，HB1 和HB3 的同源性高達(dá)99.50%，與PaLCuV BS7 同源性最高；HB2、HB4 和HB5 之間同源性達(dá)99.30%以上，與PaLCuV BS6 同源性最高；兩組之間同源性相對(duì)較低，為93.00%以上。云南分離物序列之間的同源性高達(dá)99.50%以上，與ToLCGXV分離物2013 同源性最高，達(dá)到99.60%以上。

2.4 序列系統(tǒng)發(fā)育分析

序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，測(cè)定的曲葉病毒分離物與Genbank 中我國(guó)不同省份曲葉病毒代表性分離物聚為2 個(gè)亞簇，亞簇I 包含河北分離物HB2、HB4 和HB5，廣西分離物GX1～GX8，海南分離物HN2、HN4，云南分離物YN1、YN2，甘肅分離物GS3、GS11 以及下載的曲葉病毒代表性分離物，亞簇Ⅱ包含5 個(gè)省份其他分離物。所有分離物不存在地域依賴性，也沒(méi)有寄主分化特性（圖3）。

2.5 序列重組分析

從表2 可以看出，曲葉病毒共發(fā)現(xiàn)8 個(gè)重組事件；在測(cè)定的序列中，GX9、GX16、GX17、GX20 和GX22 為重組子，其中GX20 的主要序列來(lái)源為海南分離物HN1，次要來(lái)源為廣西分離物GX28，表明我國(guó)不同省份間曲葉病毒存在重組現(xiàn)象。

表2 曲葉病毒重組位點(diǎn)分析

2.6 序列堿基替換分析

Genbank 中曲葉病毒分離物序列突變分析結(jié)果表明，嘌呤（A/G）的替換/轉(zhuǎn)換率（k1）為2.41，嘧啶（C/T）的替換/轉(zhuǎn)換率（k2）為3.27。基因總體的堿基替換/轉(zhuǎn)換率（R）為1.26，以嘧啶（C/T）的替換/轉(zhuǎn)換為主（18.73）（表3）。

表3 曲葉病毒序列堿基替換分析

3 討論

自然界中曲葉病毒僅由煙粉虱傳播，近年來(lái)隨著煙粉虱在我國(guó)的暴發(fā)式擴(kuò)展危害，曲葉病毒也呈現(xiàn)快速擴(kuò)散的趨勢(shì)（肖思 等，2020）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，我國(guó)甘肅、廣西、海南、河北和云南等省的曲葉病毒為PaLCuCNV、ToLCGDV 和ToLCGXV，這幾種病毒已經(jīng)在我國(guó)西北、西南、華南等地區(qū)擴(kuò)散危害，導(dǎo)致植株嚴(yán)重矮化、葉片卷曲、花果易脫落，降低作物產(chǎn)量，且嚴(yán)重影響農(nóng)產(chǎn)品的商品性（Varun et al.，2017）。由煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV），也在我國(guó)大面積發(fā)生危害；曲葉病毒與TYLCV 均為雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus），二者侵染番茄產(chǎn)生的癥狀類(lèi)似，僅憑田間癥狀無(wú)法區(qū)分（王雨蒙 等，2020），因此，急需開(kāi)展曲葉病毒在我國(guó)的分布危害以及致病性等方面的研究，明確其對(duì)我國(guó)主要經(jīng)濟(jì)作物的潛在威脅。

重組和突變?cè)谥参锊《镜倪m應(yīng)性進(jìn)化中發(fā)揮重要作用，也在植物病毒的致病性中發(fā)揮重要作用（Trov?o et al.，2015）。研究表明，侵染廣西和南京地區(qū)番木瓜的PaLCuCNV，與中國(guó)勝紅薊黃脈病毒（ageratum yellow vein China virus，AYVCNV）、辣椒曲葉病毒（pepper leaf curl virus，PepLCV）及煙草曲莖病毒（tobacco curly shoot virus，TbCSV）有較高的氨基酸同源性，推測(cè)這些病毒來(lái)源于共同的祖先（蔡建和 等，2005）。此外，云南番茄分離物PaLCuV 分離物YN678 的重組分析結(jié)果表明，其為T(mén)oLCV 與TYLCV 之間的重組子，重組片段為294～1 295 nt 區(qū)域，包含整個(gè)AV1 及AC3 部分區(qū)域（王玉 等，2010）。據(jù)此推測(cè)，在寄主和環(huán)境因子等選擇壓力下，重組和突變等適應(yīng)性分化普遍發(fā)生在曲葉病毒之間。本試驗(yàn)重組分析結(jié)果表明，曲葉病毒PaLCuV 和ToLCV 之間存在重組現(xiàn)象；且測(cè)定的曲葉病毒序列中，5 個(gè)廣西分離物為重組子，其中分離物GX20 的主要序列來(lái)源為海南分離物HN1，次要來(lái)源為廣西分離物GX28，表明我國(guó)不同省份間曲葉病毒存在重組現(xiàn)象。后續(xù)開(kāi)展我國(guó)不同省份更多曲葉病毒的序列測(cè)定，分析其遺傳進(jìn)化特征，可為分析曲葉病毒對(duì)我國(guó)主要經(jīng)濟(jì)作物的潛在威脅提供科學(xué)依據(jù)。

研究表明，4 種煙粉虱Middle East-Asia minor 1（MEAM1），Mediterranean（MED），Asia1 和Asia7，傳播曲葉病毒的效率都非常高，其中煙粉虱MEAM1 傳毒效率最高（Guo et al.，2015）。近年來(lái)，煙粉虱MEAM1 和MED 在我國(guó)快速擴(kuò)展危害，其傳播的多種病毒在我國(guó)也呈現(xiàn)暴發(fā)式的擴(kuò)展危害（王雨蒙 等，2020）。鑒于煙粉虱MEAM1 傳播曲葉病毒效率最高，因此，應(yīng)監(jiān)測(cè)我國(guó)煙粉虱攜帶曲葉病毒的帶毒率，加強(qiáng)病毒的監(jiān)測(cè)預(yù)警，為曲葉病毒的預(yù)警和防控提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

甘肅、廣西、海南、河北和云南等省份番茄主產(chǎn)區(qū)采集的疑似感染曲葉病毒的番茄病葉中，曲葉病毒平均檢出率為25.00%，其中廣西最高，達(dá)到50.91%。曲葉病毒的種類(lèi)鑒定為PaLCuCNV、ToLCGDV 和ToLCGXV。5 個(gè)省份的曲葉病毒分離物的測(cè)定序列可分為2 個(gè)亞簇，無(wú)明顯的地域特性和寄主依賴性。遺傳進(jìn)化分析表明，5 個(gè)省份的曲葉病毒出現(xiàn)5 個(gè)重組事件，序列中C/T 替換率最高（18.73）。