甜菜基因片段的克隆及序列分析

梁 娜，伍國(guó)強(qiáng)，馮瑞軍，劉左軍，李志忠

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730050）

肌動(dòng)蛋白（Actin）廣泛存在于真核生物體內(nèi)各個(gè)組織細(xì)胞中[1]，是構(gòu)成細(xì)胞骨架中微絲的主要成分，有維持細(xì)胞外表形態(tài)的作用，是植物體組織和個(gè)體正常生長(zhǎng)的基礎(chǔ)[2]。肌動(dòng)蛋白與細(xì)胞的分裂、運(yùn)動(dòng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能密切相關(guān)[3]。高等植物中Actin基因是由多基因編碼的，由一個(gè)相同的基因祖先通過(guò)多輪復(fù)制進(jìn)化而來(lái)，相似度極高[4]。在GenBank中，Actin基因的核苷酸序列非常保守，相似性在70%以上，甚至在有的物種之間達(dá)到了100%[5]。由于Actin基因在各種組織中表達(dá)恒定，因此常常作為比較不同來(lái)源目的基因轉(zhuǎn)錄水平差異的分子內(nèi)標(biāo)[6]。目前，人們已在霸王[6]、鹽地堿蓬[7]、當(dāng)歸[8]、水花生[9]、蕙蘭[10]等高等植物中克隆到Actin基因。

甜菜（Beta vulgaris L.）為藜科（Chenopodiaceae）甜菜屬（Beta）二年生草本植物[11]，廣泛分布于我國(guó)西北、華北、東北等干旱半干旱地區(qū)[12]，既具較強(qiáng)的抗逆性，又有很強(qiáng)的耐貧瘠性[12-13]，是我國(guó)的第二大糖料作物，也是新興的可再生能源作物[14]。甜菜作為一種典型的嗜鈉作物，目前已成為人們重點(diǎn)選擇來(lái)研究抗逆基因資源的材料。然而，有關(guān)甜菜Actin基因的報(bào)道卻很少見。鑒于此，本研究以甜菜幼苗根為材料，提取其總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增克隆Actin基因，為甜菜抗逆基因的表達(dá)分析提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

甜菜（Beta vulgaris L.）品種為“甘糖7號(hào)”，種子由甘肅省武威市三農(nóng)種業(yè)科技有限公司饋贈(zèng)。菌株E.coli DH5α購(gòu)自上海生工。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取 根據(jù)UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒說(shuō)明書（上海生工）提取4周齡甜菜幼苗根的總RNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參考伍國(guó)強(qiáng)等[6]的方法設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并性引物：P1：5'-GTGGTCGTACAAC（A/T）GGTATTGTG-3'，P2：5'-GA（A/C/T）CCTCCAATCCAGACACTG-3'。 引物由上海生工合成。

1.2.3 RT-PCR擴(kuò)增 根據(jù)MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒操作說(shuō)明書（上海生工）合成第一鏈cDNA。根據(jù)PCR擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書（上海生工）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，具體如下：cDNA 2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL， 10 mmol/L P1 1 μL，10 mmol/L P2 1 μL，Taq DNA 聚合酶 （5 U/μL）0.5 μL，dH2O 32.5 μL 。 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃下預(yù)變性 2 min；94℃下變性 30 s、56℃下退火45 s、72℃下延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后在72℃下延伸10 min，4℃下恒溫放置。結(jié)束后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物放置-20℃下保存，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒說(shuō)明書（上海生工）對(duì)目的片段進(jìn)行回收和純化。

1.2.4 陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定 將回收到的PCR產(chǎn)物連接至pUCm-T載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，在含有50 μg/mL氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，質(zhì)粒PCR鑒定陽(yáng)性克隆后，將篩選克隆送至上海生工測(cè)序。

1.2.5 序列的生物信息學(xué)分析 測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast同源性搜索，使用DNAMAN生物軟件對(duì)序列進(jìn)行翻譯和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR擴(kuò)增及膠回收產(chǎn)物純度鑒定

提取4周齡甜菜幼苗根總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA，以其為模板，使用合成好的簡(jiǎn)并性引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，在600 bp左右有單一的條帶，與預(yù)測(cè)的目的片段的大小一致（圖1），其可能是甜菜Actin基因片段。凝膠電泳檢測(cè)膠回收產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)在600 bp左右有一條亮帶，且上下無(wú)雜帶，與RT-PCR結(jié)果一致，表明回收產(chǎn)物純度高。

2.2 陽(yáng)性克隆的鑒定

將回收純化的目的片段連接到pUCm-T載體上，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α。在平板上培養(yǎng)進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取若干個(gè)白斑，進(jìn)行PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)條帶約為 600 bp處（圖2），與 RT-PCR結(jié)果一致，由此說(shuō)明這些克隆為陽(yáng)性克隆。

2.3 測(cè)序結(jié)果及序列分析

圖1 RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖M：DNA marker，1、2：PCR 產(chǎn)物

圖2 陽(yáng)性克隆的 PCR鑒定M:DNA marker，1、2:陽(yáng)性克隆

對(duì)所測(cè)得到的2個(gè)序列（圖3、4）進(jìn)行Blast比較發(fā)現(xiàn)與其他植物Actin基因的同源性在83%以上，說(shuō)明我們獲得的序列為甜菜Actin基因的序列。進(jìn)一步對(duì)這2個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)它們之間的同源性為87%，表明這2個(gè)序列是Actin基因家族不同成員的序列。將其分別命名為BvACT1和BvACT2，在GenBank中注冊(cè)，登錄號(hào)為KF214784和 KF214785。

圖3 BvACT1核苷酸序列及其編碼氨基酸序列

圖4 BvACT2核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列

將翻譯到的甜菜Actin基因的可能氨基酸序列與NCBI中其他植物Actin基因的氨基酸序列進(jìn)行多重比較分析（圖5），結(jié)果發(fā)現(xiàn)他們的保守氨基酸均達(dá)182個(gè)，而非保守氨基酸僅有16個(gè)。這表明我們克隆的片段為Actin基因的高度保守區(qū)域。

由圖 6可見，BvACT1與青葙CaACT的同源性最高可達(dá)100%、與海濱堿蓬SmACT的同源性為99%、與小花堿茅PtACT的同源性最低為92%；BvACT2與鹽地堿蓬 SgACT的同源性最高可達(dá)98%，而與芝麻SiACT的同源性最低可達(dá)93%。

圖5 BvACT1和BvACT2與其他植物Actin基因的氨基酸序列多重比較Actin基因的來(lái)源和GenBank登錄號(hào)：CaACT1（青葙Celosia argentea,HQ844002.1），SmACT（海濱堿蓬 Suaeda maritima,FJ587488.1），PtACT（小花堿茅 Puccinellia tenuiflora,FJ545641.1），SgACT （鹽地堿蓬 Suaeda glauca,EU429457.1），SiACT （芝麻 Sesamum indicum,JQ658353.1）；其中黑色代表的相似度x=100%，紅色代表的相似度x（75%≤x≤99%），綠色代表的相似度x（50%≤x≤75%），白色代表的相似度x（33%≤x≤50%）

3 討論

Actin基因編碼的肌動(dòng)蛋白是植物中的一類普遍存在而又非常重要的結(jié)構(gòu)蛋白。大量研究表明，Actin基因作為一種看家基因在高等植物體內(nèi)的保守性非常高。萼脊蘭[15]、擬南芥等[16]高等植物中含有多個(gè)Actin基因。本研究利用一對(duì)簡(jiǎn)并性引物克隆得到甜菜Actin基因家族的2個(gè)成員BvACT1、BvACT2。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)BvACT1核苷酸序列與其它植物Actin基因核苷酸序列的同源性在86%以上，而氨基酸序列的同源性則在92%以上；BvACT2核苷酸序列與其它植物Actin基因核苷酸序列的同源性在83%以上，而氨基酸序列的同源性則在93%以上。由此可見，Actin是一種高度保守的看家基因。

甜菜作為一種典型的嗜鈉作物，具有較強(qiáng)的抗逆性，蘊(yùn)藏著豐富的抗逆基因資源。而對(duì)這些抗逆基因進(jìn)行深入的研究，往往需要用到內(nèi)參基因。然而，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)甜菜Actin基因序列較少。因此，本研究結(jié)果豐富了Actin基因序列的數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)為甜菜抗逆基因的表達(dá)分析提供了可靠的內(nèi)參基因。

圖6 BvACT1和BvACT2與其他植物Actin基因的氨基酸序列同源性分析

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