超聲波提取含羞草種子中總黃酮工藝條件優(yōu)化研究*

郭莎，葉伶菊，閆正

（河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002）

含羞草為豆科多年生草本或亞灌木，主要分布在我國華東、華南、西南等地，具有清熱利尿、化痰止咳、安神止痛、涼血止血之功效。含羞草中含有大量對(duì)人體有益的活性物質(zhì)，包括黃酮類、酚類、生物活性多糖、氨基酸類、有機(jī)酸類和其它微量元素。其中黃酮類化合物具有顯著的生理活性，如抗衰老、清除自由基、抗腫瘤、抗菌抑菌、增強(qiáng)免疫力等［1］。

含羞草中黃酮類物質(zhì)的提取方法主要有索氏提取、回流提取、微波提取及超聲波提取等。索氏提取和回流提取因提取時(shí)間較長、溶劑用量較大及溶液長時(shí)間受熱導(dǎo)致黃酮成分可能發(fā)生變化并流失等問題，現(xiàn)在已經(jīng)很少使用；微波提取雖有快速高效的優(yōu)點(diǎn)，但微波輻射所引起的高溫同樣會(huì)對(duì)其中的熱敏性黃酮成分產(chǎn)生影響［2–3］；超聲提取法提取效率較高，節(jié)省溶劑和能源，提取的黃酮成分不易被破壞。已有文獻(xiàn)報(bào)道含羞草總黃酮的提取工藝［1］，筆者在此基礎(chǔ)上對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究，并且消除了超聲時(shí)溫度升高對(duì)提取效率帶來的影響。方法改進(jìn)后操作簡單，提取效率高。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

紫外可見分光光度計(jì)：4802型，上海尤尼克儀器有限公司；

超聲波清潔器：SK5200H，上?？茖?dǎo)清潔有限公司；

自動(dòng)雙重純水蒸餾器：SZ–93型，上海亞榮生化儀器廠；

粉碎機(jī)：規(guī)格為10 000 r／min，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩：規(guī)格為250 μm (60目)，浙江上虞市華豐五金儀器有限公司；

架盤藥物天平：精度為0.1 g，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

移液器：規(guī)格為1 000～5 000 μL；

循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限公司；

微型布氏漏斗；

含羞草種子采自海南三亞；

蘆丁對(duì)照品：中國藥品生物制品鑒定所；

乙醇、亞硝酸鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%）、硝酸鋁（質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%）、氧氧化鈉溶液（1 moL／L）：分析純，天津華東試劑廠；

實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)含羞草種子的預(yù)處理。將含羞草種子自然烘干后于10 000 r／min粉碎機(jī)下粉碎，然后過標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩，備用。

(2)提取過程。稱取處理好的含羞草種子3.0 g，分別加入體積分?jǐn)?shù)為40%，50%，60%，70%，80%的乙醇溶液，浸泡后分別在30～34，40～44，50～54，55 ～58，58～60℃下超聲，然后真空抽濾，洗滌2次，合并洗滌液，定容至25.00 mL，搖勻，待測。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。蘆丁是黃酮化合物中比較有代表性的一種，因此本實(shí)驗(yàn)選擇蘆丁作為對(duì)照品。

蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取烘干至恒重的蘆丁對(duì)照品，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.122 0 g／L的蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取蘆 丁 對(duì) 照 品 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL于6支10 mL容量瓶中，各加30%乙醇至5 mL，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉，搖勻，放置6 min后，然后加入10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，放置6 min后，再加入1 mol／L的氧氧化鈉溶液4 mL，混勻，用蒸餾水稀釋至標(biāo)線。15 min后，于510 nm下測定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，吸光度(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：Y=10.772 83X+0.057 78，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，線性范圍為0.012 2～0.073 2 g/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑組成對(duì)黃酮提取率的影響

分別稱取5份處理好的含羞草種子樣品于100 mL具塞錐形瓶中，每份3.0 g，分別加入40%，50%，60%，70%，80%乙醇溶液各18 mL，浸泡1 h，在30～40℃水溫下超聲30 min，抽濾，用相應(yīng)溶劑洗滌，余同1.2(2)，平行測定3次，結(jié)果見表1。

由表1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，黃酮提取率先增加后減小，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，提取率最大，之后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，黃酮類化合物溶解度變小，提取率降低。因此初步選擇乙醇的體積分?jǐn)?shù)為50%。

表1 溶劑組成對(duì)黃酮提取率的影響

2.2 配料比對(duì)黃酮提取率的影響

分別稱取4份處理好的含羞草種子樣品于100 mL具塞錐形瓶中，每份3.0 g，分別加入50%乙醇溶液18，21，24，27 mL，配料比（g∶mL）分別為1∶6，1∶7，1∶8，1∶9，浸泡1 h，在30～40℃水溫下超聲30 min，抽濾，用50%乙醇洗滌，余同1.2(2)，平行測定3次，結(jié)果見表2。

表2 配料比對(duì)黃酮提取率的影響

由表2可知，隨著溶劑量的增加，黃酮提取率先增加后減小，當(dāng)配料比為1∶8時(shí)，提取率最大，之后提取率減小，這可能因?yàn)橐堰_(dá)到了黃酮提取率的最大限度。

2.3 浸泡時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

分別稱取4份處理好的含羞草種子樣品于100 mL具塞錐形瓶中，每份3.0 g，各加入50%乙醇24 mL，分別浸泡1，2，3，4 h，在30～40℃水溫下超聲30 min，抽濾，用50%乙醇洗滌，余同1.2(2)，平行測定3次，結(jié)果見下表3。

表3 浸泡時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

由表3可知，隨著浸泡時(shí)間的增長，黃酮提取率并未提高，即浸泡時(shí)間長短，對(duì)黃酮提取率影響不大。為提高黃酮提取效率，實(shí)驗(yàn)選擇浸泡時(shí)間為1 h，且此因素不參與后面的正交試驗(yàn)。

2.4 超聲溫度對(duì)黃酮提取率的影響

分別稱取5份處理好的含羞草種子樣品于100 mL具塞錐形瓶中，每份3.0 g，各加入50%乙醇24 mL，浸泡1 h，分別在30～34，40～44，50～54，55～58，58～60℃（因無法精確控制水溫，本試驗(yàn)選擇在一定溫度范圍內(nèi)測定黃酮的提取率）水溫下，超聲30 min，抽濾，用50%乙醇洗滌，余同1.2(2)，平行測定3次，結(jié)果見表4。

表4 超聲溫度對(duì)黃酮提取率的影響

由表4可知，隨著溫度的上升，黃酮的提取率逐漸增加，最后趨于一定值，已達(dá)到黃酮提取的最大限度。

2.5 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

分別稱取5份處理好的含羞草種子樣品于100 mL具塞錐形瓶中，每份3.0 g，各加入50%乙醇24 mL，浸泡1 h，在30～34℃水溫下超聲，為避免溫度對(duì)試驗(yàn)的影響，本試驗(yàn)采用先分別超聲10 min，加入冷卻水，待溫度回到始溫時(shí)，進(jìn)行第2次超聲，以此類推，待5次超聲完畢后，抽濾，用50%乙醇洗滌，余同1.2(2)，平行測定3次，結(jié)果見表5。

表5 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

由表5可知，隨著超聲時(shí)間的增加，黃酮提取率先增加后減小，當(dāng)超聲時(shí)間為40 min時(shí)，提取率達(dá)到最大，之后提取率下降。此方法可以消除溫度對(duì)提取率帶來的影響，但過程較繁瑣，若采用恒溫循環(huán)水式超聲波清潔器，效果會(huì)更佳。

2.6 正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇4因素3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)［4］，結(jié)果見表6。

對(duì)表6中正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，得知影響含羞草種子中黃酮提取率的因素主次順序?yàn)锳＞D＞B＞C，從提取黃酮的含量考慮，提取條件A3B2C1D3效果最佳，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，配料比為1∶8，超聲溫度為40～44℃，超聲時(shí)間為50 min。

表6 提取工藝條件正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語

通過對(duì)含羞草種子中黃酮類物質(zhì)的超聲提取工藝研究，得出了最佳提取工藝條件，該提取方法操作簡單，提取時(shí)間短，提取效率較高。

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