高效陰離子交換色譜積分脈沖安培法測(cè)定藍(lán)藻細(xì)胞培養(yǎng)液中的蔗糖和甘油葡糖苷*

梁文輝，法蕓，王明林

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018；2.中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所，生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266101)

在小分子糖類碳源中，蔗糖可由高等植物通過(guò)光合作用直接合成，被認(rèn)為是自然界最豐富的二糖；同時(shí)蔗糖結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，很多微生物可以利用，是一種較為理想的碳源。又因?yàn)樗{(lán)藻具有高光效，生長(zhǎng)速度快，遺傳操作體系相對(duì)成熟，適用于大通量的基因工程改造等一系列優(yōu)勢(shì)，通過(guò)代謝工程改造藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)蔗糖并提供給大腸桿菌等微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料，必將加速整個(gè)生物燃料的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，相關(guān)的研究意義重大［1，2］。

在藍(lán)細(xì)菌相關(guān)研究中，蔗糖、甘油葡糖苷（GG）等組分的準(zhǔn)確測(cè)定是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。蔗糖的測(cè)定方法較多，如近紅外光譜法［3］、高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法［4］等。測(cè)定GG的方法包括核磁共振碳譜［5］，氣液色譜［6］和酶技術(shù)［7］等。以上方法或者操作復(fù)雜，或者使用毒性較大的淋洗液。高效液相色譜在分離含有低濃度蔗糖和GG的樣品時(shí)，RPC柱和IMPC柱的分離能力受到限制；氨基鍵合硅膠填料的色譜柱和乙腈–水作流動(dòng)相能夠?qū)G和二糖很好地分離，但是無(wú)法分離一些重要的己糖［8］。

高效陰離子交換色譜脈沖安培檢測(cè)法是糖類檢測(cè)的有效方法，適用于單糖、二糖、小分子寡糖的測(cè)定［9］，具有靈敏度高、選擇性好等特點(diǎn)。這種方法已被廣泛用于食品中糖類的測(cè)定［10–17］、煙草［18］和藥物中糖類的測(cè)定［19］。筆者對(duì)離子色譜脈沖安培檢測(cè)法測(cè)定藍(lán)藻細(xì)胞培養(yǎng)液中的蔗糖和GG進(jìn)行了研究。該方法前處理簡(jiǎn)單、選擇性好、靈敏度高。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

離子色譜儀：ICS–3000型，配備雙泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、電化學(xué)檢測(cè)器，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；

超純水制備儀：Milli-Q?Advantage A10型，法國(guó)Millipore公司；

氫氧化鈉溶液：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%，比利時(shí)Acros Organics公司；

蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品：純度不小于99.5%，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)研究中心；

GG標(biāo)準(zhǔn)品：純度不小于99.5%，德國(guó)Bitop AG公司；

藍(lán)藻培養(yǎng)液樣品：自制；

實(shí)驗(yàn)用水為電阻率18 MΩ·cm的超純水，進(jìn)樣前經(jīng)過(guò)0.22 μm水相濾膜過(guò)濾。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

準(zhǔn)確稱取0.01 g（精確至0.001 g）經(jīng)過(guò)干燥至恒重的蔗糖，用超純水定容于10 mL容量瓶中，制得1 000 mg／L的蔗糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。同法配制相同濃度的GG標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

用移液槍分別準(zhǔn)確吸取1，5，10，20，50，100，200，500，1000 μL上述兩種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用超純水定容于10 mL容量瓶中，質(zhì)量濃度分別為0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 mg／L。

1.3 樣品前處理

經(jīng)過(guò)600 mmol／L NaCl鹽脅迫后每隔24 h取樣2 mL藍(lán)藻培養(yǎng)液，以12 000 r／min速度離心5 min，取上清液。將上清液稀釋10倍后取約10 mL溶液用0.22 μm水相濾膜過(guò)濾，過(guò)IC–RP柱除去蛋白、色素等有機(jī)雜質(zhì)。

IC–RP柱（1.0 mL，Agela Technologies）使用前須先經(jīng)5 mL甲醇、10 mL水活化，放置20 min后使用。當(dāng)樣品溶液通過(guò)該柱時(shí)，前面3 mL棄去，后面溶液待檢測(cè)。

1.4 色譜條件

色譜柱：CarboPac MA1分析柱和保護(hù)柱(美國(guó)Thermo Scientific公司)；淋洗液：800 mmol／L氫氧化鈉溶液等度洗脫；進(jìn)樣體積：25 μL；流量：0.4 mL／min；柱溫：30℃；利用Chromeleon 6.8 色譜軟件自動(dòng)控制和數(shù)據(jù)處理。積分脈沖安培檢測(cè)；金工作電極；Ag／AgCl參比電極；檢測(cè)電位波形見(jiàn)表1。

表1 檢測(cè)電位波形

2 結(jié)果與討論

2.1 淋洗液濃度的選擇

分別考察300，500，800，1 000 mmol／L氫氧化鈉淋洗液對(duì)蔗糖和GG分離效果的影響，結(jié)果表明：淋洗液濃度在300，500 mmol／L時(shí)，蔗糖和GG已經(jīng)能夠分開(kāi)，但分離時(shí)間較長(zhǎng)（超過(guò)1 h）；淋洗液濃度為800 mmol／L時(shí)，蔗糖與GG可在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離；淋洗液濃度為1 000 mmol／L時(shí)，蔗糖與GG分離效果不理想。所以選擇800 mmol／L的氫氧化鈉溶液作為淋洗液。

2.2 色譜柱的選擇

使用HPLC在分離含有低濃度蔗糖和GG的樣品時(shí)，RPC柱和IMPC柱的分離能力受到限制［8］。CarboPac PA10色譜柱能分開(kāi)蔗糖和GG，但檢測(cè)實(shí)際樣品時(shí)，有雜峰和蔗糖的色譜峰重合，干擾了蔗糖檢測(cè)。利用CarboPac MA1柱分離效果較好，檢測(cè)實(shí)際樣品時(shí)，蔗糖和其它未知組分無(wú)共淋洗現(xiàn)象發(fā)生。蔗糖和GG標(biāo)準(zhǔn)品的分離情況如圖1 所示。

圖1 蔗糖和GG標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

2.3 線性方程與檢出限

逐級(jí)稀釋蔗糖、GG標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別得到0.10，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00，20.00，50.00 mg／L的蔗糖和GG混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣量為25 μL，以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度與對(duì)應(yīng)的色譜峰面積進(jìn)行線性回歸得線性方程。線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限（S／N=3）見(jiàn)表2。由表2可知，蔗糖和GG線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9，檢出限分別為0.15 mg／L和0.03 mg／L。

表2 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.4 方法精密度

用2 mg／L的蔗糖和GG混合標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)進(jìn)樣8次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，蔗糖和GG 8次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.755%和1.694%，表明本法測(cè)量精密度較高。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取藍(lán)藻培養(yǎng)液樣品，按照1.3方法處理，在1.4色譜條件下測(cè)定，然后在樣品中分別加入1.0，10.0，20.0 mg／L的蔗糖和GG混合標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，蔗糖和GG的平均加標(biāo)回收率為99.13%和94.23%，表明本法測(cè)量準(zhǔn)確度較高。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.6 樣品測(cè)定

應(yīng)用此方法測(cè)定5種不同時(shí)間間隔取樣的藍(lán)藻細(xì)胞培養(yǎng)液中的蔗糖和GG，樣品中蔗糖和GG的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5，樣品色譜圖如圖2所示。由圖2可見(jiàn)，蔗糖和GG相互之間及其與樣品基底成分分離良好，測(cè)定無(wú)干擾。

表5 不同藍(lán)藻培養(yǎng)液樣品中的蔗糖和GG含量 mg／L

3 結(jié)語(yǔ)

離子色譜脈沖安培檢測(cè)法測(cè)定藍(lán)藻培養(yǎng)液中的蔗糖和GG，最低檢測(cè)限分別達(dá)到0.03 mg／L和0.15 mg／L，比高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定蔗糖的最低檢測(cè)線14 mg／L要低［4］。測(cè)量精密度和準(zhǔn)確度滿足要求，可用于藍(lán)藻細(xì)胞培養(yǎng)液中蔗糖和GG的同時(shí)測(cè)定。

圖2 不同藍(lán)藻細(xì)胞培養(yǎng)液中蔗糖和GG的色譜圖

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