李士林， 王宜君， 張薄博， 湯朝起， 許贛榮*

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，上海 200082）

我國的煙草種植面積、年產(chǎn)量均居世界首位，然而每年也會(huì)產(chǎn)生大量的低次煙葉。低次煙葉淀粉、蛋白質(zhì)等的大分子物質(zhì)含量過高，化學(xué)成分不協(xié)調(diào)，導(dǎo)致吸食品質(zhì)差，只能用于低檔卷煙的配方中，或者直接丟棄，這不僅嚴(yán)重影響了企業(yè)和國家的經(jīng)濟(jì)利益，也造成了大量的材料浪費(fèi)。探索出一種改善低次煙葉品質(zhì)的方法，是一個(gè)值得研究的課題[1-3]。

目前，煙廠處理煙葉的主要方法是以自然陳化為主，人工發(fā)酵為輔[4]。自然陳化的溫度隨著當(dāng)?shù)販囟鹊淖兓兓?，最高溫度一般不?huì)超40℃。人工發(fā)酵的溫度大約在45～55℃[5]。自然陳化和人工發(fā)酵中，為了防止煙葉發(fā)霉，煙葉的水分都限制在質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%以下。由于煙葉水分很低，煙葉發(fā)酵速度緩慢，所以兩者的發(fā)酵周期一般都較長[6-7]。如果提高煙葉水分，可以加速煙葉的發(fā)酵。本實(shí)驗(yàn)旨在探索低次煙葉在高水分發(fā)酵過程中微生物和化學(xué)成分的變化，為探索高水分發(fā)酵低次煙葉提供一定的理論基礎(chǔ)。

煙葉人工發(fā)酵的溫度主要是常溫發(fā)酵（30℃左右）和高溫發(fā)酵（45～55℃），本實(shí)驗(yàn)中也采用常溫（30℃）和高溫（50℃）對(duì)煙葉進(jìn)行好氧和厭氧發(fā)酵，并對(duì)發(fā)酵過程中煙葉微生物數(shù)量和化學(xué)成分進(jìn)行測定和研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

上部低次煙葉，由上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司提供，為2012年福建煙葉；牛肉膏、魚粉蛋白胨、孟加拉紅瓊脂、濃硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、冰醋酸，均購自中國國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司。H2-2型電熱恒溫振蕩水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司制造；UV3000型紫外-可見光分光光度計(jì)，日本Hitachi公司制造；FA1004型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司制造；PL602-S電子天平，METTLER TOLEDO儀器上海儀器有限公司制造；PB-10型 pH計(jì)，SartoriUs公司制造；YHG-300BS型鼓風(fēng)恒溫干燥箱，上?？德穬x器設(shè)備有限公司制造；Sartorius MA-40型紅外線水分測試儀，德國賽多利斯公司制造；PYX-XHS-405型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠制造；SW-CJ-IFD超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)公司制造；紅外智能8孔消化爐，上海沛歐分析儀器有限公司制造。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備 將發(fā)酵前后的上部低次煙葉樣品剪成碎片，取煙葉碎片1.0 g置于盛有100 mL無菌水的三角瓶中37℃振蕩20 min，制成菌懸液，用于菌落計(jì)數(shù)。

1.2.2 好氧細(xì)菌平板計(jì)數(shù)法 在超凈臺(tái)中將菌懸液稀釋成一定濃度，取200 μL均勻涂在肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板中，于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.3 厭氧細(xì)菌雙層平板計(jì)數(shù)法 在超凈臺(tái)中取稀釋一定濃度的菌懸液200 μL，均勻涂在肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板中，再倒入一層40℃左右未凝固的肉湯培養(yǎng)基，待冷卻凝固后于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.4 酵母和霉菌平板計(jì)數(shù)法 在超凈臺(tái)中取稀釋一定濃度的菌懸液200 μL，均勻涂在孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基平板中，于培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)2～4 d[8-9]。

式（1）中：Ny為煙葉菌落數(shù)，Np為平板中菌落數(shù)，單位cfu/g；n為稀釋倍數(shù)；w為煙葉中含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)；5數(shù)字代表200 μL換算成1 mL的系數(shù)。

1.3 固態(tài)發(fā)酵方法

取50 g煙葉，根據(jù)含水量的設(shè)置安排，加入一定量的蒸餾水，裝入500 mL的三角瓶中，在培養(yǎng)箱中，分別于30℃和50℃溫度下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后取少許樣品測定微生物數(shù)量，其余樣品于鼓風(fēng)恒溫干燥箱烘干后測化學(xué)成分。

1.4 分析方法

1.4.1 煙葉水分的測定 取待測煙葉0.5～1.0 g，放入紅外快速水分測定儀中進(jìn)行測定。

1.4.2 淀粉的測定 采用DNS法：取煙樣，粉碎，過80目篩，準(zhǔn)確稱取煙葉粉末0.6 g，用50 mL體積分?jǐn)?shù)80%酒精浸泡12 h，80℃水浴30 min，過濾，所得到的濾渣用50 mL蒸餾水沖入250 mL的燒杯中，加入7 mL鹽酸溶液（濃鹽酸與蒸餾水體積比為5∶4），于烘箱中105 ℃處理 2.5 h，用 NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH至中性后定容到100 mL，即為淀粉待測液，按照文獻(xiàn)[10]的方法對(duì)淀粉待測液進(jìn)行測定。

1.4.3 蛋白質(zhì)的測定 采用凱氏定氮法：準(zhǔn)確稱取0.500 g 80目煙樣粉末（精確至0.001 g），置于250 mL的燒杯中，加入50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%醋酸，加熱煮沸15 min，迅速用定量濾紙真空抽濾，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%醋酸沖洗錐形瓶和沉淀物至濾液無色，然后將濾紙和殘?jiān)D(zhuǎn)移至消化管中，加入0.4 g硫酸銅、10 g硫酸鉀及10 mL濃硫酸，于紅外消化爐中進(jìn)行高溫消化，待液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，取下冷卻，加入20 mL水，此為蛋白質(zhì)待測液。具體測定方法見文獻(xiàn)[11]。

公式（2）（3）中：rs為淀粉降解率，ws1為原煙葉淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)，ws2為發(fā)酵后煙葉淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)；rp為蛋白質(zhì)降解率，wp1為原煙葉蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，wp2為發(fā)酵后煙葉蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。煙葉淀粉和蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為煙葉干基中淀粉和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 上部低次煙葉30℃好氧發(fā)酵過程中微生物數(shù)量和化學(xué)成分的變化

在常溫好氧發(fā)酵過程中，煙葉中微生物數(shù)量、淀粉和蛋白質(zhì)的變化及煙葉水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和發(fā)酵時(shí)間有著密切的關(guān)系，作者所在實(shí)驗(yàn)室中煙葉水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別設(shè)為30%、40%、50%、60%，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵過程中定期取樣。當(dāng)煙葉水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%和40%時(shí)，發(fā)酵到第3天煙葉發(fā)霉，遂停止發(fā)酵。當(dāng)煙葉水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%和60%時(shí)，發(fā)酵到第2天煙葉發(fā)霉，遂停止發(fā)酵。因此煙葉水分含量較高時(shí)，易長霉。這也是煙葉常溫下一般控制在低水分條件下的原因。

2.1.1 上部低次煙葉30℃下好氧發(fā)酵過程中微生物數(shù)量的變化 本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、30℃下好氧發(fā)酵上部低次煙葉過程中微生物數(shù)量進(jìn)行取樣檢測，結(jié)果如表1和表2所示。

由表1可見，在30℃好氧發(fā)酵上部低次煙葉過程中，酵母隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而大量繁殖。發(fā)酵水分對(duì)酵母的生長有較大促進(jìn)作用，發(fā)酵水分越高，酵母繁殖越快；好氧細(xì)菌的數(shù)量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而降低。煙葉物料水分對(duì)好氧細(xì)菌有明顯的影響，好氧細(xì)菌數(shù)量隨著煙葉物料水分的增多而遞減。好氧細(xì)菌隨著發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸減少，而酵母和霉菌（見表2）則隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而快速繁殖。細(xì)菌的變化和酵母、霉菌的變化呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，可能是酵母和霉菌的大量繁殖，抑制了細(xì)菌的繁殖。

表1 上部低次煙葉30℃下好氧固態(tài)發(fā)酵過程中好氧細(xì)菌和酵母數(shù)量的變化Table 1 Changes of the amount of aerobic bacteria and yeast in tobacoo during aerobic fermentation in 30℃cfu/g

表2 上部低次煙葉30℃下好氧固態(tài)發(fā)酵過程中霉菌數(shù)量的變化Table 2 Changes of mould amount in tobacoo during aerobic fermentation in 30℃ cfu/g

由表2可見，在30℃好氧發(fā)酵上部煙葉過程中，霉菌大量繁殖。發(fā)酵水分越高，越利于霉菌的生長。當(dāng)煙葉物料水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%～40%時(shí)，煙葉發(fā)酵到第3天開始發(fā)霉，出現(xiàn)霉菌斑點(diǎn)，用肉眼可以清晰地看出。當(dāng)發(fā)酵煙葉水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%～60%時(shí)，煙葉發(fā)霉時(shí)間提前到第2天。由數(shù)據(jù)和觀察現(xiàn)象可見，當(dāng)煙葉中霉菌的數(shù)量達(dá)到104cfu/g時(shí)，便出現(xiàn)霉菌斑點(diǎn)，用肉眼就可以發(fā)現(xiàn)。

2.1.2 上部低次煙葉30℃下好氧固態(tài)發(fā)酵過程中化學(xué)成分的變化 對(duì)30℃下好氧發(fā)酵上部低次煙葉發(fā)酵過程中煙葉的淀粉和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行定期取樣檢測，結(jié)果如圖1所示?？梢?，在30℃下好氧固態(tài)發(fā)酵上部低次煙葉過程中，煙葉中淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而逐漸降低；當(dāng)煙葉物料水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%～40%時(shí)，煙葉中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而逐漸降低；當(dāng)煙葉物料水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過40%時(shí)，煙葉中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而出現(xiàn)先降低后不變的趨勢。這可能是當(dāng)煙葉物料水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過40%時(shí)，酵母大量繁殖，酵母菌體蛋白質(zhì)增多，從而間接增加了煙葉中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖1 上部低次煙葉30℃好氧固態(tài)發(fā)酵過程中煙葉淀粉和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig.1 Changes of the content of starch and protein in tobacoo during aerobic fermentation in 30℃

2.2 上部低次煙葉30℃下厭氧發(fā)酵過程中微生物數(shù)量和化學(xué)成分的變化

煙葉厭氧發(fā)酵，霉菌生長受到抑制，故可以適當(dāng)延長發(fā)酵時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)煙葉發(fā)酵水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%，發(fā)酵溫度為30℃，在第4天、第8天、第12天取樣測微生物數(shù)量和煙葉淀粉和蛋白質(zhì)等化學(xué)成分。

2.2.1 上部低次煙葉30℃下厭氧固態(tài)發(fā)酵過程中微生物數(shù)量的變化 對(duì)30℃下厭氧固態(tài)發(fā)酵上部低次煙葉過程微生物數(shù)量定期取樣檢測，見如表3。

表3 上部低次煙葉30℃下厭氧固態(tài)發(fā)酵過程中厭氧細(xì)菌和酵母數(shù)量的變化Table 3 Changes of the amount of anaerobic bacteria and yeast in tobacoo during anaerobic fermentation in 30℃cfu/g

由表3可見，在30℃下厭氧固態(tài)發(fā)酵上部低次煙葉過程中，煙葉厭氧細(xì)菌的數(shù)量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長呈緩慢下降的趨勢。煙葉物料水分對(duì)厭氧細(xì)菌的生長有明顯促進(jìn)作用，發(fā)酵水分越高，厭氧細(xì)菌數(shù)量越多；當(dāng)煙葉發(fā)酵水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過40%，發(fā)酵前4 d，酵母大量出現(xiàn)，但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，酵母的數(shù)量增加很慢，基本趨于平衡。這可能是由于自封袋的發(fā)酵環(huán)境剛開始會(huì)存在少量空氣，酵母利用這些少量的氧氣進(jìn)行繁殖。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過4 d以后，酵母的數(shù)量不再有明顯增長，說明發(fā)酵環(huán)境中的氧氣被酵母完全消耗而進(jìn)入?yún)捬醐h(huán)境。酵母進(jìn)行厭氧發(fā)酵，繁殖減慢。

2.2.2 上部低次煙葉30℃下厭氧固態(tài)發(fā)酵過程中化學(xué)成分的變化 對(duì)30℃下厭氧固態(tài)發(fā)酵上部低次煙葉過程中煙葉淀粉和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行定期檢測，結(jié)果如圖2所示。可見，在30℃下厭氧固態(tài)發(fā)酵上部低次煙葉過程中，煙葉淀粉和蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而降低。煙葉物料水分的提高會(huì)加快煙葉淀粉和蛋白質(zhì)的降解。由表3可知，煙葉物料水分的增加會(huì)促進(jìn)厭氧微生物繁殖，這可能是煙葉淀粉和蛋白質(zhì)的降解加速的原因之一。

2.3 上部低次煙葉50℃下好氧固態(tài)發(fā)酵過程中微生物數(shù)量和化學(xué)成分的變化

50℃發(fā)酵時(shí)，霉菌已經(jīng)不再生長，故可以延長發(fā)酵時(shí)間。50℃也不是大多數(shù)細(xì)菌生長的適宜溫度，50℃固態(tài)發(fā)酵上部低次煙葉必然會(huì)對(duì)煙葉中的微生物產(chǎn)生明顯的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)發(fā)酵溫度為50℃，發(fā)酵水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%，在第4天、第8天、第12天取樣測微生物數(shù)量和煙葉的化學(xué)成分。

圖2 上部低次煙葉30℃厭氧固態(tài)發(fā)酵過程中煙葉淀粉和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig.2 Changes of the content of starch and protein in tobacoo during anaerobic fermentation in 30℃

2.3.1 上部低次煙葉50℃下好氧固態(tài)發(fā)酵過程中微生物數(shù)量的變化 對(duì)50℃下好氧固態(tài)發(fā)酵上部低次煙葉過程微生物數(shù)量定期檢測，見表4。

表4 上部低次煙葉50℃下好氧固態(tài)發(fā)酵過程中好氧細(xì)菌和霉菌數(shù)量的變化Table 4 Changes of the amount of aerobic bacteria and mould in tobacoo during aerobic fermentation in 50℃ cfu/g

由表4可見，在50℃下好氧固態(tài)發(fā)酵上部低次煙葉過程中，好氧細(xì)菌的數(shù)量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而迅速減少。煙葉物料水分的提高不利于好氧細(xì)菌的生長代謝，隨著煙葉物料水分的增加，好氧細(xì)菌的數(shù)量逐漸減少；霉菌還是會(huì)少量生長，但數(shù)量較少，煙葉表面也沒有觀察到霉菌菌落，如此少量的霉菌尚不能影響煙葉的吸食品質(zhì)。由此可見，發(fā)酵溫度為50℃時(shí)可以較好地解決高水分發(fā)酵煙葉過程中霉菌的生長問題；50℃好氧固態(tài)發(fā)酵上部低次煙葉過程中，酵母已經(jīng)不再生長繁殖，故表4沒有列出?？梢姡瑹熑~中自帶的酵母在50℃厭氧固態(tài)發(fā)酵過程中無法生長繁殖。

2.3.2 上部低次煙葉50℃下好氧固態(tài)發(fā)酵過程中化學(xué)成分的變化 對(duì)50℃好氧發(fā)酵上部低次煙葉過程中煙葉淀粉和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行定期檢測，結(jié)果如圖3所示。

圖3 上部低次煙葉50℃下好氧固態(tài)發(fā)酵過程中淀粉和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig.3 Changes of the content of starch and protein in tobacoo during aerobic fermentation in 50℃

由圖3可見，在50℃好氧固態(tài)發(fā)酵上部低次煙葉過程中，煙葉淀粉和蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而降低。煙葉物料水分的增加會(huì)加快煙葉淀粉和蛋白質(zhì)的降解。50℃可能是煙葉本身自帶復(fù)合酶的適合溫度，水分的提高會(huì)提高復(fù)合酶水解淀粉和蛋白質(zhì)的效果。

2.4 上部低次煙葉50℃下厭氧固態(tài)發(fā)酵過程中微生物數(shù)量和化學(xué)成分的變化

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)發(fā)酵溫度為50℃，煙葉物料水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%，厭氧發(fā)酵第4天、第8天、第12天取樣測微生物數(shù)量和煙葉淀粉和蛋白質(zhì)等化學(xué)成分。

2.4.1 50℃下厭氧固態(tài)發(fā)酵上部低次煙葉過程中微生物數(shù)量的變化 對(duì)50℃下厭氧固態(tài)發(fā)酵上部低次煙葉過程中微生物數(shù)量進(jìn)行定期檢測，結(jié)果如表5所示。由表5可見，在50℃下厭氧固態(tài)發(fā)酵上部低次煙葉過程中，煙葉厭氧細(xì)菌的數(shù)量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長呈緩慢下降的趨勢。煙葉物料水分對(duì)厭氧菌有明顯抑制作用，煙葉物料水分越多，厭氧細(xì)菌數(shù)量越少；在此條件下酵母沒有生長繁殖，故沒有在表5列出，結(jié)合表4分析可見，煙葉中自帶的酵母在50℃下無法生長繁殖。

表5 上部低次煙葉50℃厭氧固態(tài)發(fā)酵過程中煙葉厭氧細(xì)菌和酵母數(shù)量的變化Table 5 Changes of the amount of anaerobic bacteria and yeast in tobacoo during anaerobic fermentation in 50℃ cfu/g

2.4.2 上部低次煙葉50℃下厭氧固態(tài)發(fā)酵過程中煙葉化學(xué)成分的變化 由圖4可見，在50℃下厭氧固態(tài)發(fā)酵上部低次煙葉過程中，煙葉淀粉和蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著時(shí)間的增長而逐漸降低。

圖4 上部低次煙葉50℃厭氧固態(tài)發(fā)酵過程中煙葉淀粉和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig.4 Changes of the content of starch and protein in tobacoo during anaerobic fermentation in 50℃

煙葉物料水分越高，淀粉和蛋白質(zhì)的降解率越高。50℃可能是煙葉本身自帶復(fù)合酶的適合溫度，水分的增加會(huì)提高復(fù)合酶水解淀粉和蛋白質(zhì)的效果。

3 結(jié)語

研究了高水分固態(tài)發(fā)酵上部煙葉過程中煙葉微生物數(shù)量和化學(xué)成分的變化。結(jié)果表明：在常溫好氧發(fā)酵中，煙葉發(fā)酵到第二三天開始發(fā)霉，發(fā)酵被迫終止。發(fā)酵過程中好氧細(xì)菌逐漸減少，酵母和霉菌大量繁殖；常溫厭氧發(fā)酵過程中，厭氧細(xì)菌小幅度減少，酵母數(shù)量發(fā)酵前期迅速增加，發(fā)酵到第4天后數(shù)量趨于穩(wěn)定；高溫好氧和厭氧發(fā)酵過程中，酵母和霉菌不再生長，好氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌均大幅度減少。常溫和高溫發(fā)酵過程中，煙葉淀粉和蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均隨著時(shí)間的延長而逐漸降低。

通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，高溫高水分條件下發(fā)酵煙葉在防止霉菌生長的同時(shí)，大幅度地降低了低次煙葉中淀粉和蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。這為下一步利用高溫高水分發(fā)酵低次煙葉來改善低次煙葉的品質(zhì)，提供了一定的研究基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)僅僅研究了煙葉在高水分發(fā)酵過程中煙葉微生物、淀粉和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化，煙葉其他化學(xué)成分的變化，以及對(duì)煙葉吸食品質(zhì)的影響，則有待于進(jìn)一步的研究。

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