王宏剛，陳成彬，王春國，陳 力，宋文芹，白艷玲，張金紅，劉 方

（南開大學(xué) 生物實驗教學(xué)中心，天津 300071）

細(xì)胞骨架是指存在于真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，主要包括微管、微絲以及中間纖維三類蛋白［1］。細(xì)胞骨架不僅在維持細(xì)胞形態(tài)，承受外力、保持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性方面起重要作用，而且還參與許多重要的生命活動［2－3］。細(xì)胞骨架的重要作用使其已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)乃至生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，也成為生命科學(xué)類專業(yè)學(xué)生所必須掌握的重要知識點(diǎn)。多年來，為了讓學(xué)生更好地掌握細(xì)胞骨架的相關(guān)知識及對細(xì)胞骨架進(jìn)行研究的方法，各個高校都付出了艱辛的努力，進(jìn)行了大量的探索［4］。

目前，在本科生的基礎(chǔ)實驗教學(xué)中，細(xì)胞骨架的觀察經(jīng)常采用的是考馬斯亮藍(lán)染色法，該方法多采用植物細(xì)胞作為實驗材料，取材方便，操作簡單，但也存在諸多缺陷。首先，考馬斯亮藍(lán)并不是細(xì)胞骨架蛋白的特異性染色劑，而是利用Triton X－100處理細(xì)胞后可以保留細(xì)胞骨架蛋白而去除其他蛋白的特性來對細(xì)胞骨架蛋白進(jìn)行染色。因此，考馬斯亮藍(lán)染色法不能夠?qū)μ禺愋缘貐^(qū)分細(xì)胞骨架的具體組分。其次，Triton X－100處理后如有其他蛋白質(zhì)殘留就會對實驗結(jié)果造成影響。因此，我們決定對其進(jìn)行改進(jìn)，采用間接免疫熒光法特異地顯示微管，采用甲基羅丹明－鬼筆環(huán)肽熒光標(biāo)記法特異地顯示微絲，并針對學(xué)生基礎(chǔ)實驗教學(xué)的特點(diǎn)設(shè)計了教學(xué)方案［5－7］。

1 實驗材料和試劑

材料：倉鼠卵巢CHO細(xì)胞（以下簡稱CHO）系、人胚腎T細(xì)胞293T細(xì)胞（以下得稱293T）系、人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞（以下簡稱HeLa）系。

試劑：1640培養(yǎng)基、小牛血清、0.25%胰蛋白酶、雙抗、PBS緩沖液（以下簡稱PBS）、2%BSA （PBS緩沖液配制）、4%多聚甲醛、甲醇、0.1%TritonX－100（PBS緩沖液配制）、小鼠抗人tubulin的單克隆抗體、FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠的熒光二抗、甲基羅丹明－鬼筆環(huán)肽、防熒光淬滅封片劑（含DAPI）。

2 實驗方法

2.1 間接免疫熒光標(biāo)記法顯示微管

在3.5cm培養(yǎng)皿中放入無菌的蓋玻片，加入細(xì)胞（本文為CHO）培養(yǎng)至融合度為80%；吸去培養(yǎng)基，加入37℃預(yù)溫的PBS洗滌3次，每次5min；吸去PBS，加入預(yù)冷的甲醇固定15min；吸去甲醇，PBS洗滌3次，每次5min；吸去PBS，用濾紙輕輕吸去片子上的液體，滴加20μL、2%BSA封閉液，蓋上培養(yǎng)皿蓋，室溫下封閉15min；吸去封閉液，滴加20μL、1∶200稀釋的小鼠抗人tubulin的單克隆抗體，蓋上封口膜和培養(yǎng)皿蓋，37℃孵育20min；用PBS洗滌3次，每次5 min；用濾紙小心吸去片子上的液體，滴加20μL、1∶500稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光二抗，蓋上封口膜和培養(yǎng)皿蓋，37℃孵育20min；PBS洗滌3次，每次5min；孵育結(jié)束后用蒸餾水洗滌片刻，將蓋片風(fēng)干；在干凈載玻片上滴加3μL含有DAPI的防熒光淬滅劑，將長有細(xì)胞的蓋玻片從培養(yǎng)皿中取出，反扣于淬滅劑上；使用熒光顯微鏡觀察，并用冷CCD拍照。

2.2 鬼筆環(huán)肽熒光標(biāo)記法顯示微絲

細(xì)胞（293T和HeLa）培養(yǎng)方法同2.1節(jié)，當(dāng)細(xì)胞融合度為80%時加入37℃預(yù)溫的PBS洗滌3次，每次5min；吸去PBS，加入4%多聚甲醛溶液固定15 min；吸去多聚甲醛，加入用37℃預(yù)溫的0.1%TritonX－100處理5min；PBS洗滌3次，每次5min；吸去PBS，用濾紙輕輕吸去片子上的液體，滴加20μL、2%BSA封閉液，蓋上蓋，室溫下封閉15min；吸去封閉液，PBS洗滌3次，每次5min；滴加10μL、1∶30稀釋的甲基羅丹明－鬼筆環(huán)肽，蓋上封口膜，放入濕盒中，室溫染色15min；PBS洗滌3次，每次5min；用蒸餾水沖洗片刻，在潔凈載玻片上滴加3μL含有DAPI的防熒光淬滅劑，將蓋玻片從培養(yǎng)皿中取出，反扣于淬滅劑上；在熒光顯微鏡下觀察，并用冷CCD拍照。

3 實驗結(jié)果

3.1 間接免疫熒光標(biāo)記法顯示微管

在熒光顯微鏡下，DAPI染色后CHO細(xì)胞核經(jīng)紫外線激發(fā)而發(fā)出藍(lán)色熒光，F(xiàn)ITC標(biāo)記的微管經(jīng)藍(lán)光激發(fā)后發(fā)出綠色熒光，見圖1和圖2。

圖1 CHO細(xì)胞中的微管（100×，示間期）

圖2 CHO細(xì)胞中的微管（100×，示有絲分裂后期）

3.2 甲基羅丹明－鬼筆環(huán)肽熒光標(biāo)記法顯示微絲

在熒光顯微鏡下，DAPI染色后的293T和HeLa細(xì)胞核經(jīng)紫外線激發(fā)發(fā)出藍(lán)色熒光，甲基羅丹明－鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的微絲經(jīng)綠光激發(fā)后發(fā)出紅色熒光，見圖3和圖4。

圖3 293T細(xì)胞中的微絲（100×）

4 討論

4.1 實驗材料的選擇

圖4 HeLa細(xì)胞中的微絲（100×）

該實驗中，在選擇細(xì)胞時應(yīng)考慮：（1）應(yīng)盡量選用貼壁生長的細(xì)胞株系，這樣可以簡化實驗步驟，節(jié)省實驗所需的時間；（2）應(yīng)盡量選用貼壁牢固的細(xì)胞株系，以防學(xué)生在操作時應(yīng)動作不夠輕柔而造成細(xì)胞的丟失；（3）應(yīng)盡量選用體積較大、鋪展較好的細(xì)胞株系，以便在觀察時得到較好的效果。

4.2 教學(xué)的組織

本科生基礎(chǔ)實驗課最大的特點(diǎn)是課時相對固定，要求學(xué)生在一次實驗課（約4～5學(xué)時）中完成一個相對完整的實驗內(nèi)容。我們通過大量的預(yù)實驗，對細(xì)胞固定的時間、抗體孵育的時間、PBS洗滌的時間及次數(shù)等實驗環(huán)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化，以保證大部分學(xué)生可以在約3個半小時內(nèi)完成整個實驗。在教學(xué)實踐中，也可以根據(jù)自身的實際情況對這些環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化，以保證在不影響授課效果的前提下用合適的時間來完成實驗教學(xué)。實驗內(nèi)容方面也可以根據(jù)實際情況進(jìn)行調(diào)整。例如只安排微管與微絲中一種細(xì)胞骨架組分的觀察就可以保證學(xué)生在較短的時間內(nèi)在視覺上對細(xì)胞骨架形成有一定程度的認(rèn)識。

5 結(jié)束語

基礎(chǔ)實驗教學(xué)是生命科學(xué)類專業(yè)本科生培養(yǎng)過程中最重要的環(huán)節(jié)之一。在基礎(chǔ)實驗教學(xué)的過程中，不但要讓學(xué)生通過親自動手操作來進(jìn)一步掌握在理論課上學(xué)到的基礎(chǔ)知識，更要訓(xùn)練學(xué)生的基本實驗技能與操作，提高學(xué)生的動手能力和思維能力［8－10］。細(xì)胞骨架的觀察是一個很經(jīng)典、很重要的實驗。這次探索希望能提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，幫助其加深對細(xì)胞骨架組分中微管、微絲的認(rèn)識。更重要的是，能幫助學(xué)生掌握間接免疫熒光和熒光標(biāo)記染色的實驗方法，提高學(xué)生的科研能力，為學(xué)生將來的發(fā)展奠定扎實的基礎(chǔ)［11－13］。

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