草麻黃抗補(bǔ)體組份對(duì)血小板變形及內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用

，，，，(.中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州50006；.贛南醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室)

草麻黃抗補(bǔ)體組份對(duì)血小板變形及內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用

陳健文1，張文平2，周長(zhǎng)華1，黃守堅(jiān)1，陳少銳1
(1.中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510006；2.贛南醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室)

目的從草麻黃中分離抗補(bǔ)體組份并觀察其抗補(bǔ)體依賴性的損傷作用。方法采用柱層析結(jié)合紫外吸收觀察的方法分離抗補(bǔ)體組份；采用比濁法觀察組份對(duì)眼鏡蛇毒因子引起的血小板變形的影響；采用MTT法觀察組份對(duì)異種血清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響。結(jié)果紫外吸收為196 nm的組份具有抗補(bǔ)體作用，麻黃組份能有效抑制眼鏡蛇毒因子引起的血小板變形，高、中、低劑量對(duì)血小板變形的抑制率分別為49.8%±10.7%、32.8%±4.2%、22.5%±6.2%；麻黃組份能有效減輕異種血清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，高、中、低劑量對(duì)補(bǔ)體致內(nèi)皮細(xì)胞損傷抑制率分別為88.1%±7.1%、79.8%±3.3%、65.0%±4.5%。結(jié)論麻黃抗補(bǔ)體組份對(duì)補(bǔ)體依賴性損傷有保護(hù)作用。

草麻黃； 補(bǔ)體； 攻膜復(fù)合物； 補(bǔ)體依賴性損傷

補(bǔ)體系統(tǒng)(complement system)是由30多種蛋白組成的復(fù)雜系統(tǒng)，它由補(bǔ)體固有蛋白、補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白、補(bǔ)體受體組成，補(bǔ)體系統(tǒng)有多種生物學(xué)功能[1]。通常補(bǔ)體系統(tǒng)受到補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的精確調(diào)控不會(huì)引起同源組織損傷，如果補(bǔ)體系統(tǒng)在病理?xiàng)l件下過(guò)度激活，就會(huì)引起依賴補(bǔ)體的組織損傷，引起包括自身免疫性疾病、成人呼吸窘迫綜合癥、非典型性肺炎、移植中的超急性排斥反應(yīng)等[2-3]。補(bǔ)體激活產(chǎn)生的攻膜復(fù)合物C5b6789n(Member Attack Complex,MAC)能引起血小板活化和血管內(nèi)皮的損傷[4-5]，該作用構(gòu)成了補(bǔ)體依賴性損傷的血管內(nèi)凝血機(jī)制。抑制補(bǔ)體的激活可以有效地防止一些免疫性損傷。草麻黃(ephedra sinica)為中國(guó)的傳統(tǒng)中藥，具有廣泛的藥理作用。多個(gè)治療免疫性疾病的方劑中含有麻黃成分[6-7]，研究發(fā)現(xiàn)麻黃的水提物能抑制補(bǔ)體的激活[8]，麻黃的抗補(bǔ)體成分可能參與了免疫性疾病的治療。本研究從麻黃中分離出抗補(bǔ)體組份，研究其抗補(bǔ)體活性，并針對(duì)依賴補(bǔ)體損傷的基本病理過(guò)程(血管內(nèi)凝血機(jī)制)，觀察麻黃組份的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

眼鏡蛇毒因子(Cobra Venom Factor,CVF):實(shí)驗(yàn)室制備，采自華南眼鏡蛇(Naja naja atra)；大鼠、豚鼠、新西蘭白兔由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；新生小牛來(lái)源于廣州奶牛研究所；草麻黃由廣州奇星藥廠生藥部提供；綿羊血由廣州儒林畜牧場(chǎng)提供；Sephadex G-100購(gòu)于Pharmacia；500型Chrono-Log血小板聚集儀購(gòu)于Chrono-Log.USA；810型Aggro/Link電腦接口購(gòu)于Chrono-Log.USA。

1.2 麻黃組份的粗制品的分離

參照文獻(xiàn)[8]的方法加以改進(jìn)：100 g麻黃用1 200 mL蒸餾水浸泡24 h，煮沸1 h，趁熱用四層紗布過(guò)濾得棕黃色液體。待液體降至室溫后，用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)液體的pH為9.0出現(xiàn)大量沉淀，攪拌1 h后2 000 g離心30 min，取沉淀用無(wú)水乙醇洗滌，2 000 g離心30 min取沉淀。沉淀用50 mL蒸餾水重懸后，用1 mol/L的鹽酸調(diào)液體的pH為4.0，攪拌12 h后用冷凝回流燒瓶煮沸1 h(保持液體體積不變)，冷卻至室溫后，1 000 g離心15 min，取上清液。重復(fù)堿沉淀，酸溶解的步驟2次，取上清液,即得粗制品溶液。

1.3 粗制品溶液的層析分離

取Sephdex G-100裝柱，柱高55 cm，內(nèi)徑1.8 cm，凝膠體積140 mL。取5 mL粗制品上柱進(jìn)行層析，洗脫液為pH 4.0的水，操作壓15 cm水柱，每15 min收集1管，每管4.5 mL。以196 nm為監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定吸光度,并定性測(cè)定各管的抗補(bǔ)體活性,收集有抗補(bǔ)體活性的各管,低溫真空干燥保存。

1.4 抗補(bǔ)體活性測(cè)定方法

參照文獻(xiàn)[9]，設(shè)置倍比稀釋的麻黃組分管及對(duì)照管,全溶管，測(cè)定各管在541 nm波長(zhǎng)的吸光度。根據(jù)溶血率Y=樣本管541/全溶管541,以Lg[Y/(1-Y)]為軸,以麻黃組份劑量的常用對(duì)數(shù)為X軸,推算回歸方程。當(dāng)Y/(1-Y)=1時(shí)即50%溶血時(shí)，所對(duì)應(yīng)的劑量即為抑制50%溶血的劑量。

1.5 比濁法測(cè)血小板變形聚集

比濁法測(cè)血小板變形聚集，按文獻(xiàn)方法制備血小板血漿并計(jì)數(shù)[10-11]，調(diào)整血漿血小板數(shù)為(6～7)×1011/L。加樣器取250 μL貧血小板血漿(PPP)和PRP富血小板血漿置于已硅化的玻璃管,PPP 為空白對(duì)照，PRP置于Chrono-Log血小板聚集儀測(cè)定孔并放入硅化攪拌磁棒攪拌(1 000轉(zhuǎn)/分)，37°預(yù)熱3 min。起動(dòng)程序，設(shè)定基線并描記30 sPRP基線后加入CVF 5 μL描記15 min血小板變形，聚集曲線。實(shí)驗(yàn)組同上描記30 s基線后加入體積為25 μL的倍比稀釋的麻黃組份(低劑量組：0.24 g/L、中劑量組：0.36 g/L、高劑量組：0.54 g/L)攪拌3 min后加入CVF 5 μL,描記曲線觀察麻黃組份對(duì)血小板變形聚集的影響。以25 μL的生理鹽水代替麻黃組份作為空白對(duì)照重復(fù)步驟。

1.6 MTT法觀察麻黃組份對(duì)兔血清對(duì)牛內(nèi)皮細(xì)胞的損傷

按文獻(xiàn)方法取材和原代培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞[12]。培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)第八因子(Ⅷ因子)相關(guān)抗原抗體酶聯(lián)免疫法(ABC法染色),鑒定為內(nèi)皮細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)并傳代，實(shí)驗(yàn)用2～5代細(xì)胞。將細(xì)胞懸液配制成1×108/L,接種于24孔板，每孔0.8 mL,待細(xì)胞基本融合進(jìn)行處理。分對(duì)照組、模型組及高、中、低劑量的麻黃組份組(5、2.5、1.25 g/L，每4個(gè)孔為一個(gè)處理組)。對(duì)照組:56 ℃加熱30 min熱滅活的新鮮兔血清用VBS緩沖液1∶4稀釋+PBS緩沖液；模型組:用VBS緩沖液1∶4稀釋新鮮兔血清+PBS緩沖液；高、中、低劑量的麻黃組份組:用VBS緩沖液1∶4稀釋新鮮兔血清+倍比稀釋的麻黃多糖(溶于PBS緩沖液)。在各組中緩沖液或麻黃組份溶液預(yù)先與血清混合，在37°溫箱孵育10 min后加入24孔板中搖勻,置于培養(yǎng)箱中4 h,中途再搖勻一次。處理4 h后,采用MTT法測(cè)定細(xì)胞生存率。在酶標(biāo)儀上測(cè)定光密度值(OD值),測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm,參考波長(zhǎng)為630 nm。以細(xì)胞生存率=處理組OD/對(duì)照組OD ×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS10.0軟件,各組數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單因素方差分析后LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 草麻黃抗補(bǔ)體組份的提取與分離

生藥麻黃經(jīng)水煮后，對(duì)水溶液進(jìn)行乙醇的洗滌，二次的煮沸，以及三次的堿溶液的沉淀、酸溶液的溶解過(guò)程得粗制品溶液。將粗制品經(jīng)Sephedex G-100分子篩層析柱分離，取在196 nm波長(zhǎng)的紫外光有高吸收峰的組分,并用致敏綿羊紅細(xì)胞進(jìn)行抗補(bǔ)體活性測(cè)定。麻黃100 g獲得有196 nm波長(zhǎng)吸收特征的抗補(bǔ)體組份30.2 mg，回收率為0.3%。

2.2 抗補(bǔ)體活性測(cè)定結(jié)果

富含補(bǔ)體的豚鼠血清能使敏化的綿羊紅細(xì)胞溶解。預(yù)先將豚鼠血清與麻黃多糖孵育，能抑制其溶血作用。以系列劑量確定組份的抗補(bǔ)體活性單位，根據(jù)相對(duì)溶血率和抗補(bǔ)體組份劑量，計(jì)算出組份對(duì)豚鼠血清的的IC50為44.8 mg/L。

2.3 麻黃抗補(bǔ)體組份對(duì)眼鏡蛇毒因子致大鼠血小板變形抑制率

眼鏡蛇毒因子引起大鼠血小板顯著變形，預(yù)先加入麻黃組份能有效抑制3 min后加入CVF引起的血小板變形。變形抑制率隨著麻黃組份劑量的增加而增加，呈現(xiàn)量效關(guān)系，見(jiàn)表1。

表1麻黃組份對(duì)CVF引起的血小板變形抑制率(n=5)

組別變形抑制率(%)生理鹽水對(duì)照組9．3±3．2麻黃組份低劑量組(0．24g/L)22．5±6．2麻黃組份中劑量組(0．36g/L)32．8±4．2a麻黃組份高劑量組(0．54g/L)49．8±10．7b

與對(duì)照組比較，a:P<0.05，b:P<0.01

2.4 麻黃抗補(bǔ)體組份對(duì)兔血清對(duì)牛內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響

培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體酶聯(lián)免疫法ABC法染色,鑒定是內(nèi)皮細(xì)胞。 新鮮兔血清能損傷內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞生存率降低。麻黃組份預(yù)先與兔血清37 ℃孵育10 min后,能減輕兔血清對(duì)培養(yǎng)的牛內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，呈現(xiàn)出劑量關(guān)系，見(jiàn)圖1。

圖1 麻黃抗補(bǔ)體組份對(duì)兔血清對(duì)牛內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響1：對(duì)照組；2：模型組；3：低劑量組；4：中劑量組；5：高劑量組. 與模型組比較，*:P<0.05

3 討 論

本文根據(jù)該組分在酸性液中溶解、在堿性液中析出的特點(diǎn),對(duì)煮沸后的麻黃水溶液進(jìn)行多步處理。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,曾對(duì)丟棄的沉淀物及上清液進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)它們不同程度地具有抑制補(bǔ)體對(duì)致敏綿羊紅細(xì)胞的溶解作用,即有抗補(bǔ)體活性。推測(cè)麻黃煮沸水解后產(chǎn)生多種產(chǎn)物，具有不同的化學(xué)性質(zhì)，相當(dāng)多的物質(zhì)由于具有某些活性基團(tuán)而表現(xiàn)出抗補(bǔ)體活性，本文作者采用的方法分離的只是其中的一部分。應(yīng)用分子篩以及活性測(cè)定法來(lái)對(duì)活性組分進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)在196、202 nm有吸收峰組分表現(xiàn)出較高效價(jià)的抗補(bǔ)體活性,其中峰值為196 nm的含量最高。文獻(xiàn)采用的薄板層析分離的方法[8]，需反復(fù)制備薄板，一次上樣量小的缺點(diǎn)，采用分子篩柱層析配合196 nm紫外吸收測(cè)定的方法對(duì)抗補(bǔ)體成分進(jìn)行分離，簡(jiǎn)便實(shí)用，上樣量大，重復(fù)性好，得率較高，能滿足實(shí)驗(yàn)室的需要。

本實(shí)驗(yàn)組利用來(lái)源于華南地區(qū)中華眼鏡蛇(naja naja atra)的眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor,CVF)建立起激活補(bǔ)體旁路引起血小板變形聚集的模型。該蛇毒因子同時(shí)具有激活C3、C5的作用且除激活補(bǔ)體作用外尚未發(fā)現(xiàn)其他直接的生物活性。旁路激活補(bǔ)體作用于大鼠血小板發(fā)生明顯的變形和緩慢的血小板聚集，參與生理性止血或病理性血栓形成。該作用依賴于補(bǔ)體，因?yàn)?6 ℃，30 min處理血漿后(熱滅活補(bǔ)體)變形聚集作用消失[13-14]。麻黃抗補(bǔ)體組份能有效減輕血小板的變形作用，表明該組份對(duì)旁路激活途徑有抑制作用，提示有防治血管內(nèi)凝血的作用。

補(bǔ)體活化能通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)血管內(nèi)凝血的發(fā)生，C5b6789n(攻膜復(fù)合物)能溶解內(nèi)皮細(xì)胞，破壞細(xì)胞間連接，暴露并激活內(nèi)皮下基質(zhì)，基質(zhì)粘附并激活血小板及凝血酶引起凝血反應(yīng)[15]。補(bǔ)體活化產(chǎn)生的過(guò)敏毒素C3a、C5a可結(jié)合并激活炎癥細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)產(chǎn)生氧自由基及彈性蛋白酶影響內(nèi)皮細(xì)胞功能并使硫酸化肝素脫落加強(qiáng)了凝血傾向[16-17]。

異種血清與培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育,建立起超急性排斥的模型已被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究當(dāng)中。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為經(jīng)典激活途徑是超急性排斥反應(yīng)發(fā)生的主要原因[18-20]。由于天然抗體的存在，補(bǔ)體的激活過(guò)程很快,所以補(bǔ)體的細(xì)胞毒作用也很迅速,如C5a促進(jìn)黃嘌呤脫氫酶在5～10 min內(nèi)轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶,促進(jìn)氧自由基的生成[21]。在30～60 min被激活的內(nèi)皮細(xì)胞丟失超過(guò)50%的細(xì)胞表面的硫酸化肝素[22]。 MAC在5 min內(nèi)可在細(xì)胞連接上形成5 μm直徑的小洞[23]。本次實(shí)驗(yàn)將新鮮兔血清與新生小牛胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞孵育4 h能使超急性排斥反應(yīng)充分發(fā)生。麻黃組份預(yù)先與血清溫育10 min后，觀察到其減弱了新鮮血清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用?？赡苁怯捎诖嬖诼辄S組份抑制補(bǔ)體活化，減輕了補(bǔ)體依賴性損傷。本文中發(fā)現(xiàn)麻黃組份能有效地抑制補(bǔ)體引起的血小板激活以及抑制補(bǔ)體損傷內(nèi)皮細(xì)胞，表明該組份可能防止補(bǔ)體依賴性的血管內(nèi)凝血反應(yīng)，為麻黃治療免疫性疾病提供了理論依據(jù)，也為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)麻黃做出了初步探索。

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IsolationofAnti-complementComponentsfromEphedraSinicaanditsProtectiveEffectonComplement-dependentInjury

CHEN Jianwen,ZHANG Wenpin,ZHOU Changhua,et al
(LaboratoryofPharmacologyandToxicology,SchoolofPharmaceuticalSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou，Guangdong510006,China)

ObjectiveTo isolate the anti-complement components from ephedra sinica and investigate its protective effect on complement-dependent injury.MethodsAnti-complement components were seprerated by using column chromatography;turbidimetric assay was used to investigate the effect of anti-complement component on CVF-induced platelet metamorphose;MTT method was used to investigate the effect of anti-complement components on endothelial cells injury caused by rabbit serum.ResultsAnti-complement components effectively reduced CVF-induced platelet metamorphose and attenuated the endothelial cells injury caused by rabbit serum.ConclusionAnti-complement components may have protective effect on complement-dependent injury.

ephedra sinica； complement； member attack complex； complement-dependent injury

2095-1116(2014)05-0436-04

2014-03-18

陳健文，本科，主管技師，研究方向：藥物藥效學(xué)，E-mail：cjw1975@263.net.通訊作者陳少銳，博士，講師，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail：chshaor@mail.sysu.edu.cn.

R967

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(此文編輯：蔣湘蓮)