余 勁 ，曾朝蓉 ，藍(lán) 嵐 ，蔣忠榮 ，胡延春

（1.四川省甘孜州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 康定 626000；2.動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014；3.四川省雅安市雨城區(qū)人民醫(yī)院，四川 雅安 625014；4.四川省甘孜州畜牧業(yè)科學(xué)研究所，四川 康定 626000）

微量元素是指生物體內(nèi)含量不足萬(wàn)分之一的元素，它們?cè)趧?dòng)物體內(nèi)雖然含量極小，但在機(jī)體正常生命活動(dòng)中起著重要作用。到目前為止，已被確認(rèn)與人和哺乳動(dòng)物的健康和生命有關(guān)的必需微量元素有16種：鐵、銅、鋅、鈷、錳、鉻、硒、碘、鎳、氟、鑰、釩、錫、硅、鍶、硼。大量研究表明，微量元素對(duì)動(dòng)物機(jī)體激素的合成、酶的活性、繁殖機(jī)能、機(jī)體免疫力等都有重要的影響。缺乏微量元素或者微量元素不平衡均會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體內(nèi)分泌功能紊亂，激素和酶的生物活性降低，抵抗力下降。淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中的核心細(xì)胞，淋巴細(xì)胞增殖和分化是機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中的一個(gè)重要階段，常作為測(cè)定細(xì)胞免疫功能的一個(gè)指標(biāo)。為了探討微量元素對(duì)高原型藏羊細(xì)胞免疫功能的影響，本試驗(yàn)測(cè)定了肌肉注射微量元素制劑后高原型藏羊的淋巴細(xì)胞增殖率，以期為臨床應(yīng)用及進(jìn)一步闡明微量元素制劑增強(qiáng)免疫功能的機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物。體重13kg±1kg的高原型藏羊24只，甘孜州畜牧科學(xué)研究所提供。

1.1.2 試驗(yàn)藥品。復(fù)方微量元素注射液，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室提供，主要成分為葡萄糖酸鋅（C12H22O14Zn）、亞硒酸鈉（Na2SeO·35H2O）、硫酸銅（CuSO4·5H2O）、氯化鉻（CrC13·6H2O）、偏釩酸鈉（Na－VO3·2H2O）、檸檬酸鐵（C6H5FeO7·5H2O）、氯化鈷（Co－Cl·26H2O）、硫酸錳（MnSO·4H2O）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)器材。高壓滅菌鍋、光學(xué)顯微鏡、數(shù)顯恒溫水浴鍋、離心機(jī)、電子天平、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、微量加樣槍等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及用藥。將24頭藏羊隨機(jī)分成4組，每組6頭，每組初始體重?zé)o顯著性差異（P>0.05）。其中，I組分點(diǎn)肌肉注射生理鹽水（0.2mL/kg，作為對(duì)照組），II組（低劑量組）、III組（中劑量組）、IV組（高劑量組）分別按0.1、0.2、0.4mL/kg劑量分點(diǎn)肌肉注射復(fù)合微量元素注射液（作為試驗(yàn)組），隔1d注射1次，共注射2次。

1.2.2 血清采集及處理。在注射復(fù)合微量元素制劑后 0、15、30、45、60 d，頸靜脈無(wú)菌采血 3 mL，肝素抗凝，用于測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖率。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率測(cè)定（MTT法）

1.3.1.1 淋巴細(xì)胞懸液制備。取對(duì)照組（I組）藏羊的血樣2mL與等體積D-Hanks液混勻，無(wú)菌吸取淋巴細(xì)胞分離液4mL置于15mL離心管中，將稀釋血液在距分離液界面上1cm處沿離心管壁緩慢加至分離液面上，保持二者界面清晰，勿使血液混入分離液內(nèi)，室溫下以2000r/min離心20min，吸取白色淋巴細(xì)胞層，移入另一離心管，再加入5倍體積的經(jīng)37℃預(yù)熱的D-Hanks液，混勻，1000r/min離心 15～20min，棄去上清液，如此洗滌2次。用0.6%臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，保證活細(xì)胞數(shù)達(dá)95%以上。將淋巴細(xì)胞用不含血清的RPMI-1640血清培養(yǎng)液配制成濃度為5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。

1.3.1.2 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和測(cè)定。取無(wú)菌96孔微量培養(yǎng)板，每孔加入上述細(xì)胞懸液100μL和CoA 100μL（濃度為2.5μg/mL），每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置1個(gè)對(duì)照組（淋巴細(xì)胞懸液200 μL）和1個(gè)空白組（不含淋巴細(xì)胞的RPMI-1640血清培養(yǎng)液200 μL），置于37℃、5%CO2下培養(yǎng)48h，吸出上清液，加入MTT應(yīng)用液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)6h，然后各孔加入100μL DMSO（二甲基亞砜）裂解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)每孔的OD570值，以刺激指數(shù)（SI）判斷淋巴細(xì)胞的增殖功能。

SI=（試驗(yàn)組OD570值-空白組OD570值）/（對(duì)照孔組OD570值-空白組OD570值）

1.4 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)測(cè)定結(jié)果采用生物學(xué)統(tǒng)計(jì)法分析，以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并用t檢驗(yàn)檢測(cè)其差異顯著性。

2 結(jié)果

測(cè)定結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的增加，對(duì)照組的淋巴細(xì)胞增殖率差異不顯著（P>0.05）；而試驗(yàn)組的淋巴細(xì)胞增殖率顯著升高（P<0.05），30 d達(dá)到最高值，差異極顯著（P<0.01），隨后緩慢降低。其中，III組（即中劑量）組的效果最佳。具體結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖試驗(yàn)SI值

3 分析

3.1 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低可以反映機(jī)體免疫機(jī)能的狀態(tài)，是測(cè)定機(jī)體免疫功能的指標(biāo)之一。細(xì)胞免疫缺陷者，其淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低于正常值，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率升高，則說(shuō)明其免疫力增強(qiáng)。

趙金香（2005）研究表明，在日糧中添加酵母鐵（150mg/kg）可顯著提高仔豬T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，增強(qiáng)仔豬的免疫力。李秀霞等（2005）發(fā)現(xiàn)，缺銅能降低小鼠組織器官中的銅濃度和細(xì)胞免疫功能，而在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上添加4.5mL/kg蛋氨酸銅和硫酸銅均能顯著提高T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)脾臟發(fā)育。徐迪雄等（1995）研究發(fā)現(xiàn)，適量補(bǔ)充鋅可促進(jìn)胸腺、脾臟生長(zhǎng)，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞活性，提高免疫力。張慶東等（2006）研究表明，飼糧中添加2.0mg/kg鉻可顯著提高雞胸腺重量和T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（P<0.01）。本試驗(yàn)在注射復(fù)方微量元素制劑后，T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著升高，這是由于復(fù)方微量元素制劑中多種微量元素協(xié)同作用的結(jié)果。

3.2 本試驗(yàn)在注射復(fù)方微量元素制劑后第30d，淋巴細(xì)胞增殖率達(dá)到最高值，第30d后緩慢降低，但仍顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。這可能是由于微量元素在體內(nèi)代謝過(guò)程中被逐漸消耗掉，而飼糧中的微量元素仍然處于缺乏狀態(tài)所造成的。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，中劑量組的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著高于低劑量組和高劑量組（P<0.05），極顯著高于對(duì)照組（P<0.01），而低、高劑量組之間差異不顯著（P>0.05）。故臨床上應(yīng)選擇中劑量注射為宜。

[1]丁光，陳振昆，李梅，等.魚腥草或枳實(shí)對(duì)草魚淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率影響的比較研究[J].水產(chǎn)科學(xué)，2005，24（6）:4-6.

[2]黃其春，楊小燕，林淑慧，等.銀杏葉提取物對(duì)肉仔雞淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子水平的影響[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（14）:23-26.

[3]齊遵利，張秀文，谷子林.復(fù)方中草藥超微粉添加劑對(duì)草魚T-淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（21）:11152-11153.

[4]王德云，胡元亮，孔祥峰，等.中藥成分對(duì)培養(yǎng)的雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，36（11）:1210-1214.

[5]劉曉宇，孫成新，李杰，等.兩性殼聚糖的制備及其對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響[J].東北師大學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，42（2）:110-114.

[6]趙金香.酵母鐵對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能、理化指標(biāo)及免疫機(jī)能的影響[D].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2005.

[7]李秀霞，許麗.不同銅源對(duì)小鼠抗氧化酶活性和細(xì)胞免疫功能影響的研究[J].河南畜牧獸醫(yī)，2005，26（2）:10-12.

[8]徐迪雄，吳嘉惠，魏文，等.鋅對(duì)大鼠胸腺、脾臟淋巴細(xì)胞增殖功能影響的研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，17（4）:322-325.

[9]張慶東，羅緒剛，王永軍，等.鉻對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能、免疫功能和胴體品質(zhì)的影響[J].中國(guó)畜牧雜志，2006，42（9）:19-21.