楊冬冬，張校亮，崔彩娥，譚 慷，李曉春

(太原理工大學(xué) 物理與光電工程學(xué)院，新型傳感器與智能控制教育部與山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030024)

有機(jī)磷農(nóng)藥是我國使用量最大的農(nóng)藥之一，作為殺蟲劑被廣泛應(yīng)用于蔬菜和水果中。農(nóng)藥的過度使用會(huì)導(dǎo)致殘留農(nóng)藥不能徹底降解，最終進(jìn)入人體內(nèi)。有機(jī)磷農(nóng)藥會(huì)抑制人體內(nèi)膽堿酯酶的活性，導(dǎo)致膽堿的大量積累并頻繁刺激神經(jīng)系統(tǒng)，從而對人體神經(jīng)系統(tǒng)造成損害。我國衛(wèi)生部、農(nóng)業(yè)部于2012年發(fā)布了GB2763－2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)、食品中最大農(nóng)藥殘留限量》［1］，對食品中有機(jī)磷農(nóng)藥的最大殘留量做出了明確規(guī)定。因此有必要開發(fā)一種有效便捷的有機(jī)磷農(nóng)殘檢測方法來保障食品安全。

有機(jī)磷農(nóng)殘的檢測方法有氣相色譜法(GC)［2］、高效液相色譜法(HPLC)［3］、氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(GC－MS)［4］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(LC－MS)［5］和QuEChERS提取與超高效液相色譜－電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法［6］等。這些方法具有適用范圍廣、分離效能高、準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但存在儀器設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、耗時(shí)長等不足，因此難以滿足農(nóng)殘現(xiàn)場快速檢測的要求。Ellman等［7］根據(jù)有機(jī)磷農(nóng)藥對酶的抑制作用提出了有機(jī)磷農(nóng)藥的酶抑制檢測法。基于比色分析的有機(jī)磷農(nóng)殘的酶抑制檢測方法是近幾年發(fā)展起來的一種分析方法［8］，與傳統(tǒng)色譜法和光譜法相比，基于比色法分析農(nóng)殘更加直觀，普通用戶可以通過肉眼觀察反應(yīng)溶液的顏色進(jìn)行定性判斷，或者通過對數(shù)字圖片檢測區(qū)域色度的分析實(shí)現(xiàn)定量檢測。

近年來，隨著智能手機(jī)的廣泛普及以及其功能的不斷強(qiáng)大，基于智能手機(jī)的數(shù)字圖片比色分析(Digital image colorimetric，DIC)作為一種新型、快速的定量檢測方法被研究者所重視［9－11］。用手機(jī)采集圖片時(shí)由于光照條件不同，會(huì)對成像質(zhì)量產(chǎn)生很大的影響，最終將直接影響待檢物的定量檢測。為了解決這一問題，研究者們著手從軟件算法和特殊光源光路上進(jìn)行改進(jìn)。Shen等［12］在分析數(shù)字圖片時(shí)通過映射算法將不同光強(qiáng)環(huán)境(熒光3 500 K，日光，陰影，手機(jī)閃光燈)下所得的顏色色度值轉(zhuǎn)化為定值光強(qiáng)(熒光5 000 K)下的色度值，實(shí)現(xiàn)了不同光照強(qiáng)度下顏色的統(tǒng)一;隨后，Hong等［13］分別將熒光、日光以及低照度光強(qiáng)等不同光強(qiáng)下采集到的圖片經(jīng)過顏色校正算法轉(zhuǎn)換為顏色相同的圖片進(jìn)行比色分析。Garcia等［14］在檢測水溶液中鉀離子時(shí)采用了一個(gè)封閉裝置，并使用3個(gè)對稱放置的LED燈珠作為光源;Suzuki等［15］在檢測水中余氯時(shí)采用LED陣列作為光源。在封閉裝置中檢測和使用LED陣列光源均在一定程度上控制了環(huán)境光照的影響。但是，當(dāng)光源的放置位置不合適時(shí)，采集的照片會(huì)有陰影出現(xiàn)，這將很大程度地影響檢測結(jié)果。2013年，Bang－iam等［16］在檢測天然乳膠和醫(yī)用乳膠中的蛋白質(zhì)時(shí)通過實(shí)驗(yàn)證明:只用一個(gè)LED燈珠不能采集到完美的圖片，而放置兩個(gè)與樣品成45°的LED燈則能采集到理想的圖片。

綜上所述，在基于智能手機(jī)的數(shù)字圖片比色法的應(yīng)用中，環(huán)境光照的條件將直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于LED面光源具有較好的光線平行度，將其置于樣品上方時(shí)，手機(jī)能采集到無陰影的圖片。更為重要的是，在圖片采集過程中，較大的光源面積可以實(shí)現(xiàn)樣品區(qū)域的均勻照明，因此無需將光源放置在特定角度的位置。鑒于此，本文采用LED“面光源”作為照明光源，以智能手機(jī)作為圖片采集工具，從而實(shí)現(xiàn)了有機(jī)磷農(nóng)殘的快速、定量檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)液(100 μg/mL，溶于丙酮)購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，使用前置于藥品保存箱(4℃)中保存。有機(jī)磷農(nóng)殘檢測試劑盒(石家莊諾威亞生物試劑有限公司)包括:乙酰膽堿酯酶、硫代乙酰膽堿、顯色劑(二硫代雙硝基苯甲酸)、磷酸鹽緩沖液，干粉狀態(tài)下的試劑使用前置于低溫冰箱(－20℃)中保存，配成溶液后置于藥品保存箱(4℃)中保存。實(shí)驗(yàn)用的黃色墨水為愛普生噴墨打印機(jī)(R270系列)原供黃色墨水。供試蘋果購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

LED面光源(18 cm×18 cm，12 W，佛山飛力照明科技有限公司)，智能手機(jī)(Coolpad8736，Mi2，Samsungi9300)，UV－3100PC紫外可見分光光度計(jì)(上海美普達(dá)科技有限公司)，SK－1快速混勻器(金陵市科析儀器有限公司)，Pipet－LiteXLS手動(dòng)單道移液槍(美國梅特勒托利多公司)，HC－2518高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，石英比色皿(宜興市和橋科化儀器廠)，超純水儀(Gen-Pure UV－TOC/UF with Dispenser，美國賽默飛世爾科技公司)。

1.2 樣品的制備

由于實(shí)驗(yàn)最終產(chǎn)物呈黃色，故選擇黃色墨水作為前期優(yōu)化條件所用樣品。配制4 000 μL黃色墨水樣品，其中墨水的體積分別為0，200，400，600，800，1 000，1 200，1 400，1 600，1 800 μL，用水稀釋至4 000 μL。經(jīng)稀釋后墨水的體積分?jǐn)?shù)(墨水體積與總體積之比)分別為0%，5%，10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%，45%。10個(gè)樣品置于離心管中，并取1 000 μL樣品置于比色皿供手機(jī)拍照以及顏色分析。

將丙酮中的馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)液用水分別稀釋至 0，0.05，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μg/mL，各取500 μL置于離心管中。取乙酰膽堿酯酶、顯色劑各25 μL加至上述馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)液中，在37℃恒溫箱中溫育30 min后，加入25 μL硫代乙酰膽堿制成馬拉硫磷檢測液，取575 μL檢測溶液至比色皿中，待反應(yīng)進(jìn)行15 min后，使用手機(jī)采集圖片并進(jìn)行顏色分析。

將用于樣品測試的蘋果等分為5份，用水清洗干凈后置于通風(fēng)處晾干，分別在每塊蘋果表皮噴灑濃度為0，10，20，30，40 μg/mL的馬拉硫磷溶液。3 h后，分別削取2 mg蘋果表皮置于樣品瓶中，各加入10 mL磷酸鹽緩沖液后用快速混勻器混勻10 min，取上清液500 μL于離心管中，10 000 r/min離心10 min，待用。

1.3 DIC圖片采集裝置及顏色處理

如圖1A所示，LED面光源作為手機(jī)數(shù)字圖片采集時(shí)的照明裝置，置于比色皿正上方，智能手機(jī)置于樣品正前方進(jìn)行圖片采集，整個(gè)裝置置于暗室環(huán)境中，圖片保存格式為.Jpeg格式。采集到的圖片經(jīng)分析軟件(Adobe Photoshop CS6.0)讀取 Y值。Y值是指在CMYK(Cyan，Magenta，Yellow，Black)顏色模型中用來表示圖片所含黃色成分的百分比(范圍為0%～100%)。其中，圖片黃色越深，Y值越大，反之Y值越小，具體讀取方法如圖1B所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測原理及光譜特性

酶抑制法檢測馬拉硫磷的原理［7］見圖2，硫代乙酰膽堿(ATCh)在乙酰膽堿酯酶(AChE)的作用下水解，水解產(chǎn)物硫代膽堿在顯色劑二硫代雙硝基苯甲酸(DTNB)作用下產(chǎn)生黃色物質(zhì)5-硫代2-硝基苯甲酸(TNB)，當(dāng)反應(yīng)溶液中存在有機(jī)磷農(nóng)藥時(shí)，乙酰膽堿酯酶的活性被抑制，水解產(chǎn)物硫代膽堿變少，最終導(dǎo)致黃色物質(zhì)TNB的量變少，檢測液的黃色變淺。為了進(jìn)一步研究有機(jī)磷農(nóng)殘抑制酶的原理，考察了反應(yīng)溶液的紫外－可見吸收光譜特性。反應(yīng)溶液中加入底物之后立即進(jìn)行吸收光譜測量。此后，每隔10 min測1次溶液的吸收光譜，結(jié)果如圖3所示。

圖1 DIC圖片采集裝置(A)與Y值讀取窗口(B)Fig.1 Schematic diagram of DIC device(A)and the window for Y value reading(B)

圖2 馬拉硫磷酶抑制法的檢測原理Fig.2 Principle of malathion detection based on enzyme inhibition method

圖3 每隔10 min測得的反應(yīng)溶液的光譜特性Fig.3 UV－Vis spectra of the detecting solution obtained for every 10 min

由圖3A可知，在未加馬拉硫磷的條件下，吸收光譜在250～550 nm范圍內(nèi)有兩個(gè)明顯的吸收峰。且隨著時(shí)間的推移，320 nm處的吸光度逐漸下降，而412 nm處的吸光度逐漸增加，直至反應(yīng)進(jìn)行約1 h后，吸光度達(dá)到飽和。值得注意的是，412 nm處的吸收峰為反應(yīng)的最終黃色產(chǎn)物TNB的吸收峰，隨著其含量的增加，412 nm處的吸光度逐漸增加，約1 h后達(dá)到飽和。圖3B為加入8 μg/mL馬拉硫磷后溶液的光譜特性，與圖3A相比，兩個(gè)吸收峰的位置未發(fā)生移動(dòng)，但達(dá)到飽和的時(shí)間增加到2 h。說明馬拉硫磷抑制了酶的活性，進(jìn)而降低了反應(yīng)速度。

2.2 DIC圖片采集裝置測試

為考察所用LED面光源在圖片采集裝置中的可靠性，使用Coolpad8736智能手機(jī)對10個(gè)體積分?jǐn)?shù)均為15%的黃色墨水(編號(hào)1～10)在自然光和LED面光源下分別進(jìn)行圖片采集，并做結(jié)果分析(如圖4)。由圖4A可見，自然光照下所采集到的圖片有很嚴(yán)重的陰影，而LED面光源照明下所采集到的圖片亮度均勻無陰影，圖片質(zhì)量有明顯提高。進(jìn)一步對這10個(gè)樣品分別進(jìn)行顏色均勻程度分析，結(jié)果如圖4 B～C所示。由圖看出，自然光下由于背景很大，采集到的圖片Y值整體偏高，并且每個(gè)位置處樣品的顏色誤差較大。相比之下，采用LED作為照明光源，采集到的圖片顏色誤差很小。這充分說明在自然光下采集到的圖片顏色不均勻而導(dǎo)致顏色誤差增大。

圖4 自然光(上)和LED面光源(下)采集的黃色墨水圖片(A)，以及10個(gè)樣品的Y值分析結(jié)果(B)與Y值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(C)Fig.4 The yellow ink images obtained under ambient(upon)and LED source(down)(A)，Y value(B)and standard deviation of Y value(C)of ten samples with same content of ink

在自然光和LED面光源的照明條件下，采集了體積分?jǐn)?shù)為0%～45%的10個(gè)黃色墨水樣品圖片，并進(jìn)行了顏色分析，如圖5所示。由圖可知，在LED面光源的照明條件下，所采集到的圖片質(zhì)量有了大幅增加，且LED面光源下墨水含量在0%～45%范圍內(nèi)均保持良好的線性關(guān)系，而自然光下墨水含量僅在0%～25%范圍內(nèi)與Y值的線性關(guān)系很好，且由于自然光下背景較大，使得墨水含量大于30%即達(dá)到飽和，導(dǎo)致較高濃度的墨水含量不能區(qū)分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LED面光源相較于自然光在數(shù)據(jù)分析上有很大的優(yōu)勢，能大幅提高檢測的靈敏度。

圖5 自然光(上)和LED面光源(下)采集的不同含量黃色墨水圖片(A)，以及黃色墨水含量與Y值的關(guān)系(B)Fig.5 The yellow ink images obtained under ambient(upon)and LED source(down)(A)and relationship between Vink/Vtotaland Y value(B)

2.3 不同品牌智能手機(jī)對圖片采集的影響研究

為了驗(yàn)證不同品牌的智能手機(jī)在比色分析中的普適性，以黃色墨水為實(shí)驗(yàn)樣品，在LED面光源照明下分別以Huawei，Coolpad，Samsung 3款智能手機(jī)(參數(shù)見表1)為圖片采集工具，對體積分?jǐn)?shù)為0%～40%的黃色墨水進(jìn)行圖片采集，并進(jìn)行色度值分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3款智能手機(jī)所采集到的圖片略有差異。圖片的色度值分析結(jié)果顯示，3款手機(jī)所測得的Y值分布趨勢完全相同，只是Y值大小略有差別，Samsung分析的Y值最大，其次是Coolpad，Huawei分析的Y值最小(圖6)。從表1可以看到，3款智能手機(jī)的F數(shù)值各不相同，從小到大依次是 Huawei，Coolpad，Samsung。表明F數(shù)值越小，進(jìn)光量越多，則獲得的畫面更亮;而F數(shù)值越大，進(jìn)光量越少，則畫面較暗，因此Y值略有差異。

表1 3款智能手機(jī)的參數(shù)及其設(shè)置Table 1 Parameters and setting of the three different bands smartphones

2.4 基于數(shù)字圖片比色分析的馬拉硫磷檢測

以Coolpad8736智能手機(jī)為圖片采集工具，對馬拉硫磷進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)中，加入底物搖勻溶液后用移液槍將顯色后8個(gè)濃度(0～10.0 μg/mL)的馬拉硫磷檢測液轉(zhuǎn)移到比色皿中，反應(yīng)15 min后，在LED面光源照射下進(jìn)行圖片采集，同時(shí)作為對比，測量了待檢溶液反應(yīng)15 min后在412 nm處的吸光度值，分析結(jié)果如圖7所示。從圖7A可以看到，隨著馬拉硫磷濃度的增加其Y值逐漸減小最終趨于飽和。吸光度值與馬拉硫磷濃度的關(guān)系如圖7B所示，隨著馬拉硫磷濃度的增加，溶液的吸光度值逐漸減少，直至飽和。將比色法所得結(jié)果與光譜分析法所得結(jié)果進(jìn)行對比(如圖7C)，兩種方法的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.995 1，充分證明了本方法的可行性與準(zhǔn)確性。

圖6 黃色墨水體積比與3款智能手機(jī)采集黃色墨水圖片Y值的關(guān)系Fig.6 Relationship between Vink/Vtotaland Y value by analyzing yellow ink images captured by three smartphones of different bands

圖7 馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)品濃度與Y值的關(guān)系曲線Fig.7 Relationship between malathion concentration and Y value

2.5 未知樣品的檢測以及與傳統(tǒng)紫外－可見分光光度法的結(jié)果對比

為了驗(yàn)證本方法在實(shí)際樣品檢測中的可靠性與準(zhǔn)確性，以噴灑0，10，20，30，40 μg/mL 5個(gè)濃度的馬拉硫磷溶液的蘋果表皮作為待檢樣品。分別采用比色法與光譜分析法對樣品進(jìn)行定量檢測(如圖8)。由圖可知，噴灑較高濃度馬拉硫磷(10～40 μg/mL)的樣品檢測結(jié)果約為3.4～8.5 μg/mL，與UV－Vis分光光度計(jì)的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本文研究了基于智能手機(jī)數(shù)字圖片比色法的有機(jī)磷農(nóng)殘速測技術(shù)，使用LED面光源作為圖片采集光源，解決了自然光照下圖片失真、背景大等問題，同時(shí)也彌補(bǔ)了LED點(diǎn)光源由于角度放置不合適而引起的圖片失真問題。本方法具有普適性，不同的智能手機(jī)不會(huì)對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。與傳統(tǒng)的檢測手段相比，本方法具有易操作、速度快、成本低等優(yōu)勢。在本方法的基礎(chǔ)上，有望通過集成化研制出便攜式測試盒，同時(shí)應(yīng)用手機(jī)APP進(jìn)行比色分析，以實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)殘的實(shí)時(shí)、在線定量檢測。

圖8 DIC與紫外－可見分光光度計(jì)對樣品檢測的結(jié)果Fig.8 Detecion results for sample with DIC and UV－Vis spectrometry

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