趙雷明，劉衛(wèi)東，陳曦，王敏，馮進(jìn)輝，吳洽慶，朱敦明

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嗜熱共生桿菌內(nèi)消旋-2,6-二氨基庚二酸脫氫酶中Y76對(duì)輔酶偏好性影響

趙雷明1,2，劉衛(wèi)東2，陳曦2，王敏1，馮進(jìn)輝2，吳洽慶2，朱敦明2

1天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457 2中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 天津市生物催化技術(shù)工程中心，天津 300308

趙雷明, 劉衛(wèi)東, 陳曦, 等. 嗜熱共生桿菌內(nèi)消旋-2,6-二氨基庚二酸脫氫酶中Y76對(duì)輔酶偏好性影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(7): 1108–1118.Zhao LM, Liu WD, Chen X, et al. Effect of residue Y76 on co-enzyme specificity of meso-diaminopimelate dehydrogenase from Symbiobacterium thermophilum. Chin J Biotech, 2015, 31(7): 1108–1118.

輔酶NAD(H) 相比NADP(H) 有穩(wěn)定性好、價(jià)格低廉及更廣的輔酶循環(huán)方法等優(yōu)勢(shì)，因此在實(shí)際應(yīng)用中常需將NADP(H) 依賴(lài)型的脫氫酶改造成為NAD(H) 依賴(lài)型的。來(lái)源于嗜熱共生桿菌的NADP(H) 依賴(lài)型內(nèi)消旋-2,6-二氨基庚二酸脫氫酶 (-2,6-diaminopimelate dehydrogenase,StDAPDH) 及其突變體酶是催化還原氨化合成D-氨基酸的優(yōu)良催化劑，本研究試圖改變其輔酶偏好性，增強(qiáng)其應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。對(duì)其晶體結(jié)構(gòu)分析可知，氨基酸殘基Y76距離腺嘌呤較近，R35及R36和輔酶上磷酸基團(tuán)有直接相互作用。依氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)性質(zhì)對(duì)Y76進(jìn)行了定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)不同突變子對(duì)兩種輔酶的偏好性都發(fā)生了變化；對(duì)與磷酸基團(tuán)直接作用的R35、R36進(jìn)行的雙突變R35S/R36V，導(dǎo)致酶對(duì)NADP+的催化活力降低；將R35S/R36V和部分Y76突變進(jìn)行了組合，發(fā)現(xiàn)三突變組合以NAD+為輔酶時(shí)的活力均大于以NADP+為輔酶的活力，實(shí)現(xiàn)了輔酶偏好性轉(zhuǎn)變。這些研究工作為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)StDAPDH的輔酶偏好性完全轉(zhuǎn)變提供依據(jù)。

氨基酸脫氫酶，內(nèi)消旋-2,6-二氨基庚二酸脫氫酶，輔酶偏好性，突變

氨基酸脫氫酶是以氨基酸分子中-CH-NH2為氫供體，以NAD(P)+為受體的一類(lèi)氧化還原酶，有嚴(yán)格的手性選擇性。野生型的氨基酸脫氫酶多為L(zhǎng)-選擇性[1]，利用酶催化可逆反應(yīng)的特點(diǎn)，這類(lèi)酶被成功用于光學(xué)純L-氨基酸的生物合成；目前已知的D-氨基酸脫氫酶多為膜蛋 白[2-8]，僅有內(nèi)消旋-2,6-二氨基庚二酸脫氫酶 (-2,6-D-diaminopimelate dehydrogenase) (DAPDH) (EC 1.4.1.16) 家族及它們的突變體酶可用來(lái)進(jìn)行D-氨基酸的生物合成[9-12]。內(nèi)消 旋-2,6-二氨基庚二酸脫氫酶 (DAPDH) 存在于賴(lài)氨酸合成途徑中，是一類(lèi)NADP+-依賴(lài)型的氧化還原酶，它催化可逆的內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(-diaminopimelate，-DAP) 的D-手性碳上的氨基氧化脫氨，生成L-2-氨基-6-酮基庚二酸，反應(yīng)方程式如圖1所示[13]。我們從嗜熱共生桿菌中獲得一個(gè)內(nèi)消旋-2,6-二氨基庚二酸脫氫酶 (StDAPDH)[14],該酶可被直接用來(lái)還原氨化合成光學(xué)純D-丙氨酸，我們對(duì)其進(jìn)行改造擴(kuò)展了底物譜范圍[15]，而且還獲得了它的X-射線晶體結(jié)構(gòu)[16]，為對(duì)StDAPDH開(kāi)展深入研究奠定了基礎(chǔ)。

已報(bào)道的DAPDH家族野生型以及突變子酶均偏好于NADP(H)[9-12]，到目前為止尚無(wú)該家族酶輔酶偏好性改造的報(bào)道。輔酶NAD(H)和NADP(H) 相比而言，NAD(H) 有穩(wěn)定性好、價(jià)格低廉及更廣的輔酶循環(huán)再生方法等優(yōu) 勢(shì)[17]，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用上，多傾向于使用NAD(H) 依賴(lài)型的脫氫酶。對(duì)DAPDH進(jìn)行輔酶專(zhuān)一性改造，可以為DAPDH潛在的工業(yè)化應(yīng)用提供支撐。

圖1 內(nèi)消旋-二氨基庚二酸脫氫酶催化的反應(yīng)[13]

輔酶NAD(H) 和NADP(H) 的主要區(qū)別在于2′位上的腺嘌呤上，NADP(H) 中該位置比NAD(H) 多連接了一個(gè)磷酸基團(tuán)，而且該位置和輔酶在催化反應(yīng)中提供質(zhì)子的C4的位置較遠(yuǎn)。在輔酶偏好性改造中，常?？梢酝ㄟ^(guò)改造和輔酶磷酸基團(tuán)結(jié)合的氨基酸殘基如精氨酸 (R) 及賴(lài)氨酸 (K) 等來(lái)達(dá)到目的[18-30](表1)。

除了和磷酸基團(tuán)相關(guān)的基團(tuán)外，Crobu等[31]以及Baroni等[32]在改造鐵氧化還原蛋白NADP+還原酶時(shí)發(fā)現(xiàn)，臨近輔酶腺嘌呤的氨基酸殘基 (H286及Y258) 對(duì)輔酶偏好性也有影響，而且他們獲得的僅僅Y258位單突變就能使輔酶偏好性完全翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)。

通過(guò)結(jié)構(gòu)分析比較發(fā)現(xiàn)，StDAPDH結(jié)構(gòu)中和輔酶腺嘌呤接近并可能影響輔酶偏好性的氨基酸為Y76，與輔酶NADP+上磷酸基團(tuán)有直接作用的基團(tuán)為R35和R36。對(duì)于StDAPDH中Y76對(duì)輔酶偏好性是否有影響進(jìn)行了突變摸索，此外，還對(duì)和與輔酶NADP+上磷酸基團(tuán)有直接作用的R35/R36位也進(jìn)行了突變嘗試，并和Y76的部分突變子進(jìn)行了組合突變測(cè)試。本文報(bào)道相關(guān)的研究結(jié)果。

表1 NAD(P)(H) 輔酶改造研究的總結(jié)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)中所用感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌Top10以及BL21 (DE3) 均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；突變起始質(zhì)粒pET32a-為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

實(shí)驗(yàn)中所用KOD DNA聚合酶、PCR相關(guān)KOD plus緩沖液、MgSO4、dNTPs購(gòu)自日本TOYOBO公司；Fast-Digest限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自Fermentas公司；輔酶NADP(H) 以及NAD(H) 均購(gòu)自Codexis公司；文中所用底物以及其他試劑均購(gòu)自Alfa Aesar公司。質(zhì)粒提取試劑盒、核酸回收試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)中所構(gòu)建質(zhì)粒均由金唯智生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.1.3 培養(yǎng)基

文中所用培養(yǎng)基均為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，其中固體培養(yǎng)基中含1%瓊脂粉。

1.1.4 主要儀器

酶標(biāo)儀為MD公司Spectramax M2；蛋白純化儀為?KTA purifier 10；所用層析柱以及填料均購(gòu)自GE公司；APV2000高壓勻漿破碎儀購(gòu)自APV公司；RC6+高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自Thermo公司；離心機(jī)為Eppendorf公司5430R；MJ Mini PCR儀；核酸、蛋白電泳系統(tǒng)以及Gel DocTMXR+凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自Bio-RAD公司；SS-325高壓滅菌鍋購(gòu)自日本Tomy Kogyo公司。

1.2 方法

1.2.1 定點(diǎn)突變

根據(jù)[14]基因序列和擬突變的位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)突變引物 (表2)，所有突變都以含突變前基因的質(zhì)粒為模板，按照QuickChangeTM試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行相應(yīng)突變。PCR過(guò)程：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸7 min，其中第二步至第四步循環(huán)20次，之后于68 ℃延伸20 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳確證。對(duì)擴(kuò)增出來(lái)的目的片段進(jìn)行切膠回收后，使用Ⅰ于30 ℃消化2 h，將消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞中，涂布至含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種至3 mL液體LB培養(yǎng)基中，菌體長(zhǎng)出后離心取菌體提取質(zhì)粒，并將質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證，將序列正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態(tài)中，進(jìn)行后續(xù)表達(dá)純化工作。

表2 突變引物的序列

1.2.2 突變酶的表達(dá)純化

突變酶的表達(dá)、純化方法和野生型酶類(lèi) 似[14]，首先將含過(guò)夜培養(yǎng)的種子液以1%的比例接種至2 000 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至600約1.0后，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG) 至終濃度為0.5 mmol/L，25 ℃、200 r/min繼續(xù)誘導(dǎo)12 h，4 ℃、5 000 r/min離心30 min收集菌體，菌體用緩沖液A (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，5%甘油) 重懸，高壓勻漿破碎，破碎液于4 ℃、14 000 r/min離心30 min，收集上清液作為粗酶液，經(jīng)過(guò) 0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行鎳柱親和層析。鎳柱按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行再生處理并用緩沖液A進(jìn)行平衡，上樣后先用緩沖液A將280紫外吸收洗至基線，再用15%比例的緩沖液B (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，5%甘油，500 mmol/L咪唑) 洗脫雜蛋白，接著使用50%比例的緩沖液B洗脫目的蛋白,收集合并洗脫峰，使用Amicon Ultra-15 超濾管 (截留分子量：10 kDa) 進(jìn)行超濾濃縮，置換緩沖液至緩沖液C (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol/L NaCl) 并進(jìn)一步濃縮，濃縮后的酶用于SDS-PAGE以及酶學(xué)性質(zhì)檢測(cè)。蛋白質(zhì)濃度使用BCA試劑盒檢測(cè)，使用牛血清白蛋白BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.3 活力測(cè)定和動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

酶活測(cè)定方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[14]，以StDAPDH的天然底物內(nèi)消旋-二氨基庚二酸 (-DAP) 為底物，以NAD(P)+為輔酶，通過(guò)檢測(cè)340下輔酶NAD(P)H生成時(shí)吸光值的變化來(lái)表征突變體的活性，輔酶的摩爾吸光系數(shù)為 6.22 mmol/(L·cm)。酶活測(cè)定體系為:10 mmol/L-DAP，0.5 mmol/L NAD(P)+，200 mmol/L Na2CO3/NaHCO3，pH 10.0，總體積為200 μL。酶活單位 (U) 定義為30 ℃下每分鐘生成 1 μmol NAD(P)H所需要的酶量。

對(duì)輔酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定，具體條件如下：100 mmol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液 (pH 10)，10 mmol/L-DAP，NADP+終濃度在0.031?16 mmol/L 之間變動(dòng)，NAD+終濃度在0.031?32 mmol/L之間變動(dòng)。每個(gè)NADP+濃度做3?4次平行反應(yīng)取平均值，利用GraphPad Prism軟件，根據(jù)Michaelis-Menten方程式計(jì)算野生型酶和各突變體酶對(duì)NADP+以及NAD+的表觀m和max值。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變位點(diǎn)的選擇及突變?cè)O(shè)計(jì)

從StDAPDH結(jié)合輔酶的結(jié)構(gòu)[16]可知，和磷酸基團(tuán)有直接作用的殘基為R35和R36，Y76的位置類(lèi)似于鐵氧化還原蛋白NADP+還原酶中靠近Y258的位置[31-32]，StDAPDH結(jié)構(gòu)中這3個(gè)位置的氨基酸殘基和輔酶的位置關(guān)系見(jiàn)圖2。與NADP+的腺嘌呤環(huán)相臨近的76位酪氨酸，其空間位阻較大，且有極性的羥基；為了探索其對(duì)輔酶專(zhuān)一性是否有影響，以及是空間位阻還是極性對(duì)輔酶專(zhuān)一性產(chǎn)生影響，進(jìn)行了突變改造，將其突變?yōu)楹推溆蓄?lèi)似大位阻的色氨酸 (W)、苯丙氨酸 (F) 和略小位阻的疏水性氨基酸纈氨酸 (V)、甲硫氨酸 (M) 以及異亮氨酸 (I) 以探索空間位阻的影響，突變?yōu)橛H水氨基酸如堿性的精氨酸 (R)、酸性的谷氨酸 (E) 及組氨酸 (H) 以探索極性的影響。Lerchner等改造醇脫氫酶RasADH的輔酶偏好性從NADP+至NAD+的工作中[25]，起始酶與輔酶NADP+上磷酸基團(tuán)相互作用的氨基酸殘基也是兩個(gè)精氨酸 (R38及R39)，通過(guò)將它們突變?yōu)镽38V/R39S后成功將輔酶偏好性改為NAD+依賴(lài)型。通過(guò)結(jié)構(gòu)比較可以發(fā)現(xiàn)，StDAPDH中的R35及R36分別對(duì)應(yīng)RasADH中的R39和R38。對(duì)StDAPDH設(shè)計(jì)了R35S/R36V雙突變，探索該雙突變是否和RasADH中一樣能使輔酶偏好性發(fā)生翻轉(zhuǎn)。突變引物序列見(jiàn)表2。

2.2 突變體的純化以及性質(zhì)分析

我們首先對(duì)構(gòu)建的Y76單突變進(jìn)行了表達(dá)純化，利用純酶對(duì)兩種輔酶的活力進(jìn)行了測(cè)定及比較，單突變的純酶結(jié)果見(jiàn)圖3，其與野生型對(duì)兩種輔酶的比活力比較見(jiàn)圖4。

圖2 StDAPDH中和輔酶偏好性可能相關(guān)的位點(diǎn)

通過(guò)對(duì)Y76位的不同單突變對(duì)兩種輔酶比活力的比較 (圖4)，我們可以看出，除Y76W外的所有突變子對(duì)NAD+的比活力均有所提高，而且所有Y76位突變子對(duì)NADP+的比活力均有所下降。在這些突變子中，位阻最大的Y76W對(duì)兩種輔酶的比活力為Y76位單突變中最低的，可能是因?yàn)槠漭^大的位阻影響了NAD(P)+上腺嘌呤的結(jié)合，因而影響它們的活力。突變后位阻比酪氨酸略小的疏水氨基酸Y76F對(duì)輔酶活力變化趨勢(shì)和野生型酶影響趨勢(shì)最為接近，其對(duì)NAD+的比活力相比較野生型酶有所提高，其對(duì)NADP+的比活力是所有突變子中最高的；酸性氨基酸Y76E對(duì)NAD+的活力比Y76F有進(jìn)一步提高，堿性氨基酸Y76H比Y76E對(duì)NAD+的活力更高，但對(duì)NADP+的活力略低；同為堿性的氨基酸Y76R比Y76H對(duì)NAD+的活力則更高一些，對(duì)NADP+的活力也相對(duì)更高；位阻更小的疏水性的Y76M、Y76V以及Y76I對(duì)NAD+的活力逐步增高，對(duì)NADP+的活力也相應(yīng)逐步降低，表明它們的輔酶偏好性偏轉(zhuǎn)能力也逐步提高；在我們測(cè)試的這些Y76突變子中，Y76V及Y76I對(duì)NAD+的比活力最高。在所有Y76的突變子中，雖然Y76E有最高的NAD+/NADP+比值 (0.73)，但其對(duì)NAD+的活力并不是最高；而Y76I突變子，雖然NAD+/NADP+比值為0.69，但其對(duì)NAD+活力是Y76突變子中最高的。

為考察R35/R36為對(duì)輔酶偏好性的影響，我們借鑒別人的結(jié)果，進(jìn)行了R35S/R36V雙突變；為考察Y76位的突變和R35、R36位突變是否有相互作用，我們選取了Y76單突變中對(duì)NADP+活力最高的Y76F，對(duì)NAD+活力最高的Y76V和Y76I，分別與R35S/R36V進(jìn)行了組合突變，并進(jìn)行了表達(dá)、純化及活力測(cè)定。純化結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖3 StDAPDH Y76單突變純酶的SDS-PAGE結(jié)果

圖4 野生型和Y76單突變酶的比活力

R35S/R36V雙突變對(duì)StDAPDH輔酶偏好性影響和Y76W單突變類(lèi)似，對(duì)兩個(gè)輔酶的活力都有明顯降低，而且對(duì)NAD+的比活力仍然低于對(duì)NADP+的比活力 (圖6)。對(duì)R35、R36兩個(gè)位點(diǎn)的突變結(jié)果表明，嘗試改造的R35S/R36V雖然確實(shí)對(duì)酶的偏好性有影響，其N(xiāo)AD+/NADP+比值 (1.25) 比所有Y76單突變 (最高值為0.73) 都高，但是對(duì)NAD+活力提高不明顯。R35S/R36V雙突變和Y76F組合后的R35S/R36V/Y76F對(duì)輔酶NAD+的比活力相比 Y76F單突變沒(méi)有明顯變化，但NAD+/NADP+比值卻從0.39提高到1.25，而且該突變對(duì)NAD+的比活力高于對(duì)NADP+的比活力；R35S/R36V和Y76I及Y76V組合后的突變子對(duì)NAD+的比活力也均高于它們對(duì)NADP+的比活力，而且它們的NAD+/NADP+比值也均有明顯提高，分別從0.69到1.39，以及0.53到1.36；在單突變中Y76I比Y76V對(duì)NAD+的比活力稍高，但在組合的三突變中，R35S/R36V/Y76V卻比R35S/R36V/Y76I對(duì)NAD+的比活力更高。這些結(jié)果表明，R35/R36位和Y76位組合后，可以獲得比單獨(dú)進(jìn)行單突變或雙突變更好的結(jié)果，但其所起的作用并不是簡(jiǎn)單的疊加。后續(xù)若想獲得更好結(jié)果，可能需要先篩選出R35/R36位較好的結(jié)果，并將較好的雙突變結(jié)果和76位進(jìn)行進(jìn)一步組合突變并進(jìn)行篩選。

圖5 R35S/R36V以及三突變純酶的SDS-PAGE 結(jié)果

圖6 野生型和突變體酶的比活力

本研究中涉及的突變子動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。從表中可以看出，所有Y76突變對(duì)NAD+的m都降低了，而且除了Y76E外所有突變對(duì)NADP+的m也降低了，其中對(duì)NADP+的m值最小的是Y76F，這說(shuō)明Y76F對(duì)NADP+的親和力最好；Y76E對(duì)NADP+的cat最高，但同時(shí)其m也最高，這說(shuō)明Y76E在提高了其催化效率的同時(shí)也降低了對(duì)NADP+的親和力；對(duì)NAD+的m值最小的是空間位阻較小的Y76M、Y76I和Y76V，Y76V對(duì)NAD+的cat和cat/m是所有突變中最大的，這說(shuō)明在對(duì)NAD+的親和力和催化效率中，空間位阻起到了重要的作用。

從表3中還可以看出，R35S/R36V對(duì)NADP+和NAD+的m、cat以及cat/m都降低了，這說(shuō)明與磷酸基團(tuán)有相互作用的R35、R36對(duì)輔酶親和力和催化效率有非常重要的作用。同時(shí)，還可以看出Y76對(duì)R35S/R36V的作用與Y76的單突變的效果一致，當(dāng)Y76的空間位阻依次變小 (F、I、V) 時(shí)，其對(duì)NAD+的m也變小；通過(guò)比較單突變Y76V，Y76I和三突變R35S/R36V/Y76V和R35S/R36V/Y76I對(duì)NAD+的cat/m時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，它們之間存在協(xié)同作用：Y76V的cat/m比Y76I大，但R35S/R36V/Y76V的cat/m卻比R35S/R36V/Y76I的數(shù)值小，這可能是因?yàn)閅76V和R35S/R36V都突變?yōu)槲蛔栎^小的氨基酸殘基，表3中m(NAD+)/m(NADP+) 值顯示，Y76突變對(duì)NAD+和NADP+親和力差異的貢獻(xiàn)各不相同，與野生型相比，空間位阻相對(duì)較小的M、V和I對(duì)輔酶的親和力更偏好于NAD+，其中Y76I的m(NAD+)/m(NADP+) 值比野生型的低了6倍多，顯示其對(duì)NAD+的親和力有明顯的提高。雙突變R35S/R36V與野生酶相比，m(NAD+)/m(NADP+) 值相差23倍，在此基礎(chǔ)上，增加額外的一個(gè)突變 (無(wú)論是Y76I，F(xiàn)或者V) 都導(dǎo)致此效果的進(jìn)一步提升。表3中cat(NAD+)/cat(NADP+) 的結(jié)果顯示，與野生酶相比，大部分突變都導(dǎo)致了酶對(duì)NAD+和NADP+的cat差異的變化，其中以Y76R和Y76V導(dǎo)致酶選擇NAD+作為輔因子最有效，3個(gè)突變中，R35S/R36V/Y76I最高。

以上結(jié)果分析可知，R35、R36對(duì)NAD+和NADP+偏好性的選擇具有關(guān)鍵的作用，這可能是其直接與磷酸基團(tuán)相互作用的結(jié)果。不僅如此，Y76對(duì)NAD+和NADP+的偏好性選擇也有重要的作用，可能通過(guò)對(duì)嘌呤環(huán)的作用，改變了NAD+在酶結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象，使NAD+更好地與酶結(jié)合，導(dǎo)致催化效率的提高。

表3 野生型StDAPDH和所有突變子的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3 討論

從上述結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，雖然Y76單突變對(duì)NAD+的比活仍低于對(duì)NADP+的比活，但該位點(diǎn)的突變對(duì)輔酶偏好性確有影響，動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果表明，Y76位的突變是通過(guò)改變酶和輔酶NADP+和NAD+的親和力來(lái)影響其輔酶專(zhuān)一性的。對(duì)與NADP+磷酸基團(tuán)有直接作用的R35/R36設(shè)計(jì)的R35S/R36V突變，雖然改變了輔酶偏好性，但對(duì)NAD+的比活力沒(méi)有明顯提升；而測(cè)試的Y76突變和R35S/R36V突變組合，對(duì)輔酶偏好性有影響的同時(shí)，對(duì)NAD+的比活力均已大于對(duì)NADP+的比活力。這些結(jié)果表明，距離腺嘌呤較近的Y76對(duì)StDAPDH的輔酶偏好性確有影響，而且該位置和與NADP+上磷酸有直接作用的R35及R36對(duì)輔酶偏好性有協(xié)同作用。

在本文進(jìn)行的改造嘗試基礎(chǔ)上，對(duì)StDAPDH的R35、R36及Y76進(jìn)行組合飽和突變，也許能獲得對(duì)NAD+活力更高的突變酶，相關(guān)研究工作正在進(jìn)行中。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Effect of residue Y76 on co-enzyme specificity of-diaminopimelate dehydrogenase from

Leiming Zhao1,2, Weidong Liu2, Xi Chen2, Min Wang1, Jinhui Feng2, Qiaqing Wu2, and Dunming Zhu2

1 Key Laboratory of Industrial Microbiology Fermentation of Ministry of Education, College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China 2 Tianjin Biocatalysis Technology Engineering Center, National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

Inindustrial application of NAD(P)H-dependent dehydrogenases, NAD(H) has the advantages over NADP(H) in higher stability, lower price and wider recycling system. Recently, ao-2,6-diaminopimelate dehydrogenase from(StDAPDH) has been found to be a useful biocatalyst for the production of D-amino acids, but it requires NADP(H) as co-enzyme. To switch the co-enzyme specificity from NADP(H) to NAD(H), we studied the effect of Y76 on the co-enzyme specificity of StDAPDH, because the crystal structural analysis indicated that residue Y76 is near the adenine ring. The mutation of Y76 exerted significant effect on the co-enzyme specificity. Furthermore, the double mutant R35S/R36V significantly lowered the specific activity toward NADP+, and the combination of R35S/R36V with some of the Y76 mutants resulted in mutant enzymes favorable NAD+over NADP+. This study should provide useful guidance for the further development of highly active NAD+-dependent StDAPDH by enzyme engineering.

amino acid dehydrogenase,-diaminopimelate dehydrogenase, co-enzyme preference, mutagenesis

October 30, 2014;

January 19, 2015

Key Deployment Project of Chinese Academy of Sciences (No. KSZD-EW-Z-016-3), National Natural Science Foundation of China (Nos. 21072151, 21102100), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CB710801).

:Qiaqing Wu. Tel: +86-22-84861963; Fax: +86-22-84861996; E-mail: wu_qq@tib.cas.cn Dunming Zhu. Tel: +86-22-84861962; Fax: +86-22-84861996; E-mail: zhu_dm@tib.cas.cn

中國(guó)科學(xué)院重點(diǎn)部署項(xiàng)目 (No. KSZD-EW-Z-016-3)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 21072151, 21102100)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2011CB710801) 資助。