夏隆春，郭慧君，劉秋紅，王甜，李玉清

（山東勝利生物工程有限公司山東濟(jì)寧272073）

超低溫冷凍保藏法在菌種保藏中的研究

夏隆春，郭慧君*，劉秋紅，王甜，李玉清

（山東勝利生物工程有限公司山東濟(jì)寧272073）

菌種在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中對(duì)生產(chǎn)水平具有決定性的作用，在生產(chǎn)中一個(gè)合適的菌種保藏方法也很重要。超低溫冷凍保藏法通過AIDCS測(cè)控系統(tǒng)把超低溫冰箱的測(cè)溫裝置連接到電腦上，進(jìn)行實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)冰箱內(nèi)溫度，進(jìn)行在線溫度記錄。通過菌種驗(yàn)證對(duì)比得出超低溫冷凍保藏法具有保存時(shí)間長、保存費(fèi)用低、不容易發(fā)生變異、利于操作的特點(diǎn)。得出這種方法在菌種保藏中值得推廣。

超低溫冰箱；菌種保藏；效價(jià)

菌種是一種極其重要和珍貴的的生物資源，它在工業(yè)生產(chǎn)水平中占有決定性的作用，但是他的世代時(shí)間一般很短，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此常造成工業(yè)菌種的退化，并有可能造成優(yōu)良菌種的丟失，所以必須做好菌種的保存，長期保持菌種的活性[1]。超低溫冷凍保藏法就是把需要保存的菌種加入合適的保護(hù)劑混勻后分裝到凍存管中，放入超低溫冰箱保藏。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株莫能菌素、恩拉霉素、海南霉素均是正常使用的菌種。

1.1.2 儀器超低溫保存冰箱用-86℃超低溫冰箱、AIDCS測(cè)控系統(tǒng)、電腦、液氮罐。

1.2 方法

1.2.1 超低溫冰箱的在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)運(yùn)用AIDCS監(jiān)控軟件把溫度感應(yīng)裝置通過溫度調(diào)節(jié)器連接到電腦能夠記錄超低溫冰箱在連續(xù)的時(shí)間點(diǎn)不同的位置其溫度情況，AIDCS具有高性能的記錄功能的特點(diǎn)，有超高溫、停電報(bào)警、遠(yuǎn)程監(jiān)控功能等。1.2.2超低溫保存箱的均一穩(wěn)定性驗(yàn)證超低溫保存箱（以下簡稱冰箱）共有4層，每層均有獨(dú)立的門可供開關(guān)，每層各均勻分布3個(gè)溫度探頭，共12個(gè)檢測(cè)點(diǎn)檢測(cè)溫度，以此驗(yàn)證一下冰箱在連續(xù)的時(shí)間點(diǎn)不同的位置的溫度情況。

1.2.3 超低溫保存箱保藏菌種保存時(shí)間的驗(yàn)證將生產(chǎn)用菌種莫能菌素，恩拉霉素、海南霉素這3個(gè)品種的菌種的成熟斜面孢子在無菌狀態(tài)刮下各自均分到含有冷凍保護(hù)劑的凍存管中制成凍存孢子，混勻后放入設(shè)定溫度為-86℃的超低溫冰箱中保存兩年，中間隔4個(gè)月各取出1支凍存孢子進(jìn)行效價(jià)驗(yàn)證。檢驗(yàn)其效價(jià)是否降低。

1.2.4 超低溫保藏方法與液氮超低溫保藏方法的對(duì)比把恩拉霉素菌種制成凍存孢子，分別用超低溫冷凍保藏法和液氮超低溫保藏法這2種保藏法進(jìn)行菌種保存[2]，從保存菌種效價(jià)的高低、便于操作和使用、保藏費(fèi)用等各方面進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 超低溫冰箱的均一穩(wěn)定性驗(yàn)證

驗(yàn)證方法為：等冰箱溫度運(yùn)行穩(wěn)定到冰箱預(yù)設(shè)的溫度-86℃后，冰箱內(nèi)放入3品種的各一個(gè)菌種20支凍存孢子運(yùn)行10 d，任意調(diào)出AIDCS監(jiān)控軟件連續(xù)運(yùn)行48 h內(nèi)數(shù)據(jù)報(bào)表，間隔時(shí)間為1 min，得出數(shù)據(jù)，因數(shù)據(jù)太多只挑取每層各1個(gè)檢測(cè)點(diǎn)，間隔時(shí)間為8 h進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。層數(shù)從上層數(shù)為第一層，其記錄數(shù)據(jù)見下表1。

表1 冰箱每層內(nèi)不同的時(shí)間點(diǎn)溫度情況

通過分析數(shù)據(jù)得出每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)溫度波動(dòng)范圍在±1℃之間，溫度波動(dòng)不大，在正常范圍內(nèi)，說明冰箱的均一穩(wěn)定性較好。但是第四層的溫度比冰箱的設(shè)定溫度略高5℃左右，分析原因應(yīng)該是最下層與冰箱的壓縮機(jī)等運(yùn)行設(shè)備離得最近，造成實(shí)測(cè)溫度比冰箱設(shè)定溫度高。平常存放菌種時(shí)不把菌種放在最下層，以保證菌種存放的環(huán)境均一穩(wěn)定。

2.2 超低溫保存箱保藏菌種不同的保存時(shí)間效價(jià)情況

用超低溫保存箱保藏菌種保存2年，每間隔4個(gè)月取一支凍存孢子驗(yàn)證其效價(jià)，莫能菌素、恩拉霉素、海南霉素這3個(gè)品種驗(yàn)證效價(jià)結(jié)果見表2。

表2 莫能菌素、恩拉霉素、海南霉素不同的保存時(shí)間效價(jià)情況

從表2結(jié)果可知，隨著保藏時(shí)間的延長效價(jià)略有降低，在去除各方面允許的誤差情況下，在長達(dá)兩年的保藏時(shí)間里這3個(gè)品種的效價(jià)降低在5%以內(nèi)，保藏1年效價(jià)降低在2%以內(nèi)，隨著保藏時(shí)間的延長效價(jià)略有降低。這3個(gè)品種的菌種均屬于放線菌，說明此方法適合放線菌一些品種的短期保藏，保藏1年之內(nèi)，不影響菌種的效價(jià)，在工業(yè)生產(chǎn)中一般生產(chǎn)菌種保存周期在1年以內(nèi)，所以此方法適用于一些放線菌生產(chǎn)菌種的保藏。

2.3 兩種保藏方法比較分析

超低溫冷凍保藏法和液氮超低溫保藏法這兩種保藏方法進(jìn)行比較，這兩種方法均是通過把孢子或菌絲體與冷凍保護(hù)劑混勻后進(jìn)行保藏，只是保藏的環(huán)境不同。

2.3.1 效價(jià)比較用恩拉霉素的凍存孢子分別進(jìn)行兩種方法的保藏，過一定時(shí)間后進(jìn)行效價(jià)的驗(yàn)證，在保存時(shí)間上對(duì)這兩種方法進(jìn)行比較，其結(jié)果見表3。

表3 不同的保藏方法在相同的保存時(shí)間內(nèi)其效價(jià)情況

從表3中可以看出用超低溫冷凍保藏法保藏2年后效價(jià)降低2.2%，而液氮超低溫保藏法2年后效價(jià)降低1.4%，因?yàn)槊總€(gè)時(shí)間點(diǎn)驗(yàn)證的是同一個(gè)菌種相同的菌種號(hào)，兩種保藏方法相差0.8%，通過數(shù)據(jù)分析可知還是液氮超低溫保藏法保藏年限比較長，不容易發(fā)生生產(chǎn)能力退化。而超低溫冷凍保藏法略有退化，超低溫冷凍保藏法比較適合于保藏周期中短期的菌種，生產(chǎn)菌種保藏周期較短適合于超低溫冷凍保藏法。

2.3.2 費(fèi)用比較兩種保藏方法從保藏費(fèi)用上進(jìn)行比較，超低溫冷凍保藏法用的是1 000 W的超低溫保存箱保藏，每月的耗電量在800度電左右，而且冰箱的空間較大，可同時(shí)保藏1 000支凍存菌絲或凍存孢子，電費(fèi)按0.5元/度，每支管1個(gè)月保藏費(fèi)用為約0.4元。

液氮超低溫保藏法，需要使用專用的液氮罐，1個(gè)50 L的液氮罐保藏菌種量為200支左右，每月正常需要補(bǔ)充30 L左右的液氮，液氮按10元/L，每支1個(gè)月管的保藏費(fèi)用約為1.5元。

2.3.3 安全系數(shù)兩種方法從安全系數(shù)上進(jìn)行比較，液氮的保藏溫度為-196℃，對(duì)凍存管的質(zhì)量要求較高，必須嚴(yán)格采用耐低溫的材質(zhì)，而且凍存管放入液氮罐后前后溫差變化較大，管口容易變松掉帽造成染菌?；蚴挂旱M(jìn)入管內(nèi)導(dǎo)致拿取時(shí)管內(nèi)液氮溫度變高，液氮?dú)饣l(fā)生炸管，對(duì)工作人員造成傷害。而超低溫冷凍保藏法相對(duì)于液氮保藏法，瞬間溫差不是很大，不會(huì)造成管口變松、炸管。

以上兩種方法保藏方式比較接近，但這兩種保藏法各有側(cè)重點(diǎn)，超低溫冷凍保藏法因其需要保藏的周期在1年以內(nèi)，比較適合于產(chǎn)抗生素的放線菌的生產(chǎn)菌種的保藏。而在主菌種庫菌種保藏中，因是主菌種庫的菌株少、保藏時(shí)間長，不經(jīng)常取用，且在菌種退化方面要求更為嚴(yán)格，則更適合液氮超低溫保藏法[3]。

3 討論

通過對(duì)超低溫冰箱的分析可知，超低溫冷凍保藏法通過連接AIDCS測(cè)控系統(tǒng)連接電腦，通過報(bào)表查詢，記錄密度、可記錄時(shí)間及查找方便方面均大大高于各種有紙或無紙紀(jì)錄儀，在減輕了工作量的前提下使記錄數(shù)據(jù)真實(shí)、準(zhǔn)確和完整。通過兩種保藏方法的對(duì)比得出超低溫冷凍保藏法在保藏菌種1年內(nèi)不容易退化，運(yùn)行成本低、易于操作、安全系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)。因此，在工業(yè)菌種保藏中，超低溫冷凍保藏法是一種比較值得推廣的保藏方法?！觯ň庉嫞豪钣甏龋?/p>

[1] 陶興武,劉志國,田俊.生物工程概論[M].北京:化工工業(yè)出版社, 2010:162-165.

[2] 王馮艷,劉寶華,崔云,等.關(guān)于截短側(cè)耳素菌種保藏的試驗(yàn)總結(jié)[J].生物技術(shù)世界,2014(09):72-73.

[3] 韓芹芹,李國慶,聶凡,等.液氮保藏平菇菌種的處理方法初探[J].食用菌學(xué)報(bào),2010,增刊:57-60.

Study on Preservation of Strain in the Ultra-Low Temperature Freezing Preservation

Xia Longchun,Guo Huijun,Liu Qiuhong,Wang Tian,Li Yuqing
(Shandong Shengli Biological Engineering Co.,Ltd,Jining Shandong,272073)

The strain has a decisive effect on the level of production in the industrial fermentation production,in the production of an appropriate preservation methods is also very important.Ultra low temperature freezing preservation method of the temperature measuring device of super low temperature refrigerator is connected to the computer through AIDCS measurement and control system,real-time online monitoring of temperature inside the refrigerator,on-line temperature record.By contrast to ultra low temperature freezing strain verification preservation method has the characteristics of long preservation time,save costs low,not prone to mutation,easy operation.It demonstrated that the method is worth popularizing in the preservation of.

ultra low temperature freezer;strain preservation;titer

10.3969/j.issn.1008-4754.2015.03.036

夏隆春，男（1981-），山東濟(jì)寧人，本科學(xué)士，主要從事微生物發(fā)酵工程的研究。

*通訊作者：郭慧君，女（1981-），山東濟(jì)寧，工程師，E-mail: xialc1981@163.com。