張玉玉，張金衛(wèi)，易詠竹，李江濤，徐森華，馮世明，魚南洋，鐘伯雄，丁 農

（1.浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州 310058； 2.湖州市農業(yè)科學研究院，浙江 湖州 313000；3.中國農科院蠶業(yè)研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212018）

我國的豬肉位居我國各種肉產品消費的首位，約占67%[1]，養(yǎng)豬業(yè)已成為推動農業(yè)經濟發(fā)展的支柱產業(yè)。但隨著生豬養(yǎng)殖的規(guī)?；图s化，生豬重大疫病發(fā)生的風險在不斷加大，豬瘟、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征、口蹄疫等重大疫病在部分養(yǎng)殖戶和規(guī)模養(yǎng)殖場中有所發(fā)生。豬的各類傳染病，尤其是病毒性疾病不僅嚴重危害著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，造成重大經濟損失，還會危害人類的健康。因此病毒病的預防和治療成為養(yǎng)殖業(yè)的重中之重，研制出高效經濟的抗病毒和免疫增強藥物成為解決問題的關鍵。

干擾素（Interferon，IFN）最早發(fā)現(xiàn)于1957年，Isaccs和Lindenmann利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感病毒的干擾現(xiàn)象時，發(fā)現(xiàn)被病毒感染的細胞所產生的一種因子[2]。干擾素是人和動物細胞受到特定干擾素誘生劑刺激后，由巨噬細胞、淋巴細胞等產生的一種具有多種生物學活性的糖蛋白。干擾素具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫增強等多種生物活性，具備無休藥期、無藥殘、無毒副作用、不產生耐藥性、可反復使用的優(yōu)點，迄今為止一種最理想的抗病毒生物制劑。大量體內和體外試驗表明，豬干擾素對生豬生產具有重大威脅的病毒均具有抑制作用。Chin?sangaram等報道豬IFN-α/β能抑制口蹄疫病毒在PK細胞上增殖[3]，后續(xù)又報道顯示用腺病毒表達載體表達的豬α干擾素能完全使豬免受口蹄疫病毒的感染[4]。家蠶桿狀病毒表達體系表達的外源蛋白幾乎都是可溶性的，其免疫原性和生物活性非常接近天然來源的分離物，且家蠶具有可大規(guī)模飼養(yǎng)、安全性好、生長周期短等優(yōu)點。豬干擾素α和干擾素γ在抗病毒活性方面具有協(xié)同增強作用，能夠提高重組干擾素產物的效價及穩(wěn)定性[5，6]。由此可見，利用家蠶生物反應器共表達生產含有豬α+γ的復合型干擾素，應用于豬病毒性疾病防治豬干擾素對生豬生產健康發(fā)展具有重要作用。

豐富的家蠶種質資源是品種改良和有效基因利用開發(fā)的物質基礎[7，8]，因而家蠶品種的選育、篩選便成為利用家蠶生物反應器表達外源蛋白中必不可少的重要環(huán)節(jié)。本文采用豬α干擾素（IFN-α）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒，通過對豬α干擾素在不同家蠶品種中表達的檢測，為篩選適合高效共表達豬α+γ的復合型干擾素的家蠶品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

IFN-α ELISA檢測試劑盒由德國IBL公司生產（上海將來實業(yè)有限公司提供）；重組桿狀病毒rBmN?PV（Bm-α+γ）由中國農科院蠶業(yè)研究所提供；24個家蠶原種、7對雜交種組合蠶蛹由湖州農業(yè)科學院飼養(yǎng)提供。

1.2 方法

1.2.1 重組病毒rBmNPV（Bm-α+γ）的接種

以常規(guī)方法飼養(yǎng)及蛹期保護的各品種6～7 d蛹齡蠶蛹為材料，將重組桿狀病毒rBmNPV（Bm-α+γ）按105pfu/頭接種蠶蛹，然后置于25℃下表達4.5 d，收集發(fā)病蠶蛹，-20℃凍存。

1.2.2 IFN-α表達量的檢測

按雌雄1∶1的比例隨機抽取20頭蠶蛹，研缽徹底研磨，轉移至離心管中，8000 rpm離心10 min，取中間層，參照試劑盒說明書進行表達量檢測。

2 結果與分析

2.1 不同家蠶原種對IFN-α的表達

對24個家蠶原種進行ELISA檢測，IFN-α表達結果見表1。由表1可見，所選的24個家蠶品種對豬IFN-α的表達能力差異很大，白玉品種對IFN-α表達最好，表達量可達867.12 ng/L，而表達水平最低的TQ78僅是660.87 ng/L。中系與中系品種之間、日系與日系品種之間的差異也很大，12個日系原種的表達量平均為822.63 ng/L，12個中系原種的表達量平均為759.85 ng/L，初步可以認為日系品種的表達量高于中系品種。

表1 不同家蠶原種對豬α干擾素基因的表達Table 1 The expression of IFN-α in different parental silkworm varieties

2.2 不同家蠶雜交組合對豬α干擾素基因的表達

以表1中不同表達量的原種，組配了7對14個正反交組合采用雙抗夾心ELISA法進行IFN-α表達檢測，由表2可知，日系×中系組合平均表達量明顯高于中系×日系。但在IFN-α表達量上這些雜交組合并沒有明顯表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢，原種與其相對應的雜交種之間似乎沒有直觀的相關關系，即表達量高的原種雜交組合不一定高，反之亦然。TL3東×98晨和98晨×TL3東、秋豐×白玉和白玉×秋豐這兩對雜交品種的表達量較低，推測是由于該品種對該型重組病毒的抵抗力較強，表現(xiàn)為對外源基因的表達能力較低。

表2 不同家蠶雜交組合對豬α干擾素基因的表達Table 2 The expression of IFN-α in different hybrid silkworm varieties

值得一提的是中國系統(tǒng)與日本系統(tǒng)在蛹體重指標的雜交優(yōu)勢明顯，一般來說，蛹體大，血淋巴多，表達產物就多。因此，應用家蠶作為生物反應器表達豬干擾素的研究和產品開發(fā)中，在組配篩選出雜交優(yōu)勢明顯蛹體大的家蠶品種的同時兼顧表達效率的篩選，是重要的攻關方向。本實驗中結合蛹體重量和品種表達量的比較，以春628B×華213C正反交表達效率較高，或者日×中組合的金玉×秋黃、紫氣秋實×春花綠池、皓月×菁松也比較好，可作為表達豬干擾素表達的專用品種。

3 討論

當前獸醫(yī)臨床上大多是用大腸桿菌表達的豬干擾素，其表達的產物是以包涵體的形式存在的，表達出的產物不具有生物學活性，無法直接應用，必須經變性復性過程，但復性后效果往往不理想。利用酵母表達的干擾素，不均一性出現(xiàn)頻率高，對產物的純化非常不利[9]。迄今為止，已用大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞、桿狀病毒等表達系統(tǒng)表達過豬干擾素[10～15]，但從表達產物的抗病毒活性來看，真核生物表達的產物要好于原核表達。

家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)是利用家蠶桿狀病毒BmNPV作為表達載體，在家蠶細胞系或蟲體中表達外源蛋白的真核表達系統(tǒng)，具有安全性高、表達量高、容量大等特點。據(jù)了解，家蠶是目前唯一能大規(guī)模人工飼養(yǎng)的經濟昆蟲，生物學背景清楚，因此利用家蠶來表達和生產豬干擾素具有明顯的優(yōu)勢。本實驗中由于豬IFN-α和豬IFN-γ是聯(lián)合共表達的關系，因此以豬IFN-α表達量的檢測結果可以間接證明IFN-α+γ的表達量結果，這與鐘魯龍的研究結果一致[16]。從本文試驗結論可知，不同品種、品系的家蠶對豬IFN-α的表達有較大差異，篩選適合豬干擾素表達的家蠶品種對產業(yè)化應用具有重要的意義。

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