尹 佳

雜合抗菌肽MgJ基因在畢赤酵母中表達條件的優(yōu)化

尹 佳

（吉林化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，吉林 吉林 132022）

為確定雜合抗菌肽MgJ基因的最佳誘導(dǎo)表達條件，將構(gòu)建好的重組表達載體pPICZαA-MgJ經(jīng)SacⅠ線性化處理，電轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母GS115，利用抗生素Zeocin篩選陽性克隆，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增驗證，甲醇誘導(dǎo)表達。優(yōu)化雜合抗菌肽MgJ誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度、初始菌體濃度表達條件。結(jié)果表明雜合抗菌肽MgJ的最佳表達條件為：28℃、250 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)，每24 h添加體積分?jǐn)?shù)0.5%的甲醇，誘導(dǎo)時間120 h，MgJ表達量可達11.9 mg/L。純化后獲得的表達產(chǎn)物MgJ對S. aureusATCC 29213有較好的抑菌活性，最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）為10 ?g/mL。

雜合抗菌肽MgJ；畢赤酵母；表達條件優(yōu)化

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是生物界中廣泛存在的一類生物活性小肽，具有抗細菌或真菌作用，有些還具有抗原蟲、病毒或腫瘤細胞的功能[1-2]?？咕木哂袕V譜的抗菌作用，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌具有抑制作用；可以殺傷動物體內(nèi)的腫瘤細胞，卻又不破壞動物體內(nèi)的正常細胞[3]。在合成機制、氨基酸組成和作用機制等方面不同于傳統(tǒng)的微生物（包括細菌、真菌和鏈霉菌等）產(chǎn)生的多肽類抗生素[4-5]。因此，抗菌活性肽的開發(fā)與應(yīng)用研究已成為國內(nèi)外昆蟲學(xué)、植物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)研究的熱點。目前國內(nèi)外已有采用基因工程的方法制備抗菌肽的報道，由于抗菌肽通常帶有陽離子正電荷，與帶有陰離子的DNA可能發(fā)生相互作用，具有一定的細胞毒性，因此通常采用融合蛋白的形式進行表達[6-7]。

本實驗將抗菌肽Magainin-Ⅱ和JaponicinⅡ兩個基因進行雜合得到的重組酵母表達載體pPICZαA-MgJ采用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母GS115，對陽性克隆子進行誘導(dǎo)表達，獲取雜合抗菌肽MgJ，并進行誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度、初始菌體濃度表達條件的優(yōu)化，獲得高效表達的蛋白，以期為生產(chǎn)新型食品生物防腐劑提供參考。

1 材料與方法

1.1菌種與培養(yǎng)基

菌種：宿主菌畢赤酵母GS115，工程菌pPICZαA-MgJ由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品工程實驗室保存。

YPD培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L、胰蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L。BMGY培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L、胰蛋白胨20 g/L、K3PO4100 mmol/L、無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）13.4 g/L、生物素4×10-5g/L、甘油10 g/L，pH 6.0。BMMY培養(yǎng)基：5 mL/L過濾除菌的甲醇替代BMGY的10 g/L甘油。YPDS培養(yǎng)基：胰化蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L、葡萄糖20 g/L、山梨醇182.2 g/L、瓊脂粉20 g/L。水解酪蛋白（Mueller-Hinton）培養(yǎng)基：牛肉粉2 g/L、可溶性淀粉1.5 g/L、酸水解酪蛋白17.5 g/L。

1.2方法

1.2.1畢赤酵母的轉(zhuǎn)化以及篩選

畢赤酵母轉(zhuǎn)化采用電轉(zhuǎn)化法[8]。重組質(zhì)粒pPICZαAMgJ經(jīng)SacⅠ線性化處理電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞畢赤酵母GS115。以空質(zhì)粒pPICZαA作陰性對照。電轉(zhuǎn)化參數(shù)為：電壓2 000 V、脈沖5 ms、溫度0℃。電擊結(jié)束后，立即加入1 mL預(yù)冷的1 mol/L山梨醇。將混合物轉(zhuǎn)移到滅菌離心管中，30 ℃靜置培養(yǎng)1.5 h，取轉(zhuǎn)化物均勻涂布于含100 ?g/mL Zeocin的YPDS選擇平板上[9]。

1.2.2酵母重組子的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）鑒定

用5’-AOX1引物（5’-GACTGGTTCCAATT GACAAGC-3’）和3’-AOX1引物（5’-GCAAATGGCA TTCTGACATCC-3’）分別作為上、下游引物，進行PCR擴增反應(yīng)，以鑒定陽性克隆。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性1 min；94℃變性1 min、56℃退火1 min、72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.3重組酵母GpMgJ的生長動力學(xué)

發(fā)酵液稀釋后于600 nm波長處以去離子水為對照進行比色測定。本實驗中的OD600nm值為OD600nm讀數(shù)與稀釋倍數(shù)的乘積。從GpMgJ接種到BMGY培養(yǎng)基起開始計時，OD600nm= 6時轉(zhuǎn)入BMMY，每6 h取樣測定OD600nm值，繪制其生長曲線。

1.2.4重組雜合肽的表達

將GS115-pPICZαA-MgJ重組菌和對照重組菌GS115-pPICZαA分別接種于2 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min搖床培養(yǎng)過夜，再以1%的量分別接種于100 mL BMGY培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min搖床培養(yǎng)至OD600nm= 2～6。4 000 r/min離心5 min收集菌體，用100 mL BMMY培養(yǎng)基重懸細胞后轉(zhuǎn)移至500 mL搖瓶中，于28℃、250 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d，期間每隔24 h補加100%甲醇使其終體積分?jǐn)?shù)達0.5%～1%，分別在0、24、48、72、96、120、144 h取樣，10 000 r/min、4℃離心10 min，取上清液進行Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測。

1.2.5表達產(chǎn)物的純化

取1.2.4節(jié)中上清液加等體積無水乙醇，置于-20℃環(huán)境2 h，再于4℃、10 000 r/min離心15 min，取上清裝入截留相對分子質(zhì)量3 000的透析膜中，0.05 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）于4℃過夜透析除鹽脫色。再用25%的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）6000反滲透濃縮至10 mL。濃縮液經(jīng)Sephadex G-50層析和CM52陽離子交換層析純化后濃縮至1 mg/mL，進行發(fā)酵上清液中蛋白含量的檢測和Tricine-SDS-PAGE檢測。

1.2.6重組菌發(fā)酵液中蛋白含量的測定

以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用Bradford蛋白質(zhì)定量法[10-11]。用1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL，然后用無離子水補充到0.1 mL。最后各試管中分別加入5.0 mL考馬斯亮藍G-250試劑，2～5 min后，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595 nm波長處的吸光度（A595nm），以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，以吸光度（A595nm）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得曲線方程y=0.197 9x+0.124 5（R2=0.995 1）。由此測出抗菌肽的A595nm值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。0.5 mg/mL BSA溶液的A595nm約為0.50。

1.2.7重組抗菌肽表達條件的優(yōu)化

1.2.7.1甲醇體積分?jǐn)?shù)

將GpMgJ重組菌轉(zhuǎn)入25 mL BMMY（pH 6.0）培養(yǎng)液中，于28℃、250 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)24 h后按0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的終體積分?jǐn)?shù)追加甲醇；誘導(dǎo)120 h后各取2 mL樣品，10 000 r/min離心10 min，收集表達上清純化，進行蛋白質(zhì)含量測定。

1.2.7.2誘導(dǎo)時間

將GpMgJ重組菌轉(zhuǎn)入25 mL BMMY（pH 6.0）培養(yǎng)液后，于28℃、250 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)，每24 h按0.5%的終體積分?jǐn)?shù)追加甲醇；分別于24、48、72、96、120、144 h各取2 mL樣品，10 000 r/min離心10 min，收集表達上清純化，進行蛋白質(zhì)含量測定。

1.2.7.3誘導(dǎo)溫度

將GpMgJ重組菌轉(zhuǎn)入25 mL BMMY（pH 6.0）培養(yǎng)液中，分別在24、26、28、30、32℃進行誘導(dǎo)表達，250 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)，每24 h按0.5%的終體積分?jǐn)?shù)追加甲醇；誘導(dǎo)120 h后各取2 mL樣品，10 000 r/min離心10 min，收集表達上清純化，進行蛋白質(zhì)含量測定。

1.2.7.4初始菌體濃度

將GpMgJ重組菌接種到5mL BMGY培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min搖床培養(yǎng)至OD600nm= 5，4℃、4 000 r/min離心10 min，收集菌體；將適量菌體接入25 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY（pH 6.0）中，使得起始誘導(dǎo)表達濃度分別為OD600nm= 5、10、20、30、40、50。培養(yǎng)120 h，每24 h按0.5%的終體積分?jǐn)?shù)追加甲醇；各取2 mL樣品，10 000 r/min離心10 min，收集表達上清液純化，進行蛋白質(zhì)含量測定。

1.2.8重組抗菌肽抗菌活性的測定

采用美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會（National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）規(guī)定的微量稀釋法[12]。將供試菌（S. aureusATCC 25923）接種到水解酪蛋白培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)12～18 h，使細菌處于對數(shù)生長期。取1.2.5節(jié)純化的抗菌肽MgJ加入水解酪蛋白培養(yǎng)基中，使其終質(zhì)量濃度分別為1、5、10、15 ?g/mL，各加0.1 mL到無菌微量反應(yīng)板各孔中，每梯度質(zhì)量濃度重復(fù)2孔。同樣方法，用100 ?g/mL的氨芐西林（ampicillin，AMP）作陽性對照，空載體轉(zhuǎn)化酵母表達蛋白為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1重組酵母菌株的PCR鑒定

圖1 重組酵母菌株的PCR鑒定Fig.1 Identification of pPICZαA-MgJ by PCR

由圖1可知，6個重組酵母的質(zhì)粒DNA均擴增出約700 bp的明顯條帶，而空載體在500～750 bp之間擴增出約580 bp的條帶，結(jié)果正確。

2.2重組雜合肽的表達及純化

重組菌GS115-MgJ表達上清液經(jīng)進行Tricine-SDS-PAGE檢測，結(jié)果見圖2。在發(fā)酵96 h后，有約5.3 kD的蛋白條帶出現(xiàn)，與推測的MgJ雜合抗菌肽分子質(zhì)量相同，而pPICZαA轉(zhuǎn)化的GS115空載體對照的誘導(dǎo)上清液無此蛋白條帶出現(xiàn)。表明重組酵母菌GS115-MgJ特異表達了MgJ。重組菌離心后上清中雜蛋白含量較多（圖2），用Sephadex G-50層析和CM52陽離子交換層析純化后得到了相對純度較高的融合蛋白（圖3）。

圖2 誘導(dǎo)不同時間表達產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE圖Fig.2 Tricine-SDS-PAGE of expressed products

圖3 蛋白分離純化后的Tricine-SDS-PAGGEE圖Fig.3 Tricine-SDS-PAGE of the purified antibacterial proteins

2.3重組菌發(fā)酵上清液中的蛋白含量

表1 不同時間重組菌GS115-MgJ分泌總蛋白和目的蛋白含量Table 1 Total secreted proteins and target protein in fermentation supernanant of GS115-MgJ

由表1可知，在發(fā)酵上清液中，重組菌GS115-MgJ分泌的總蛋白和目的蛋白量隨時間的延長而增加。分泌目的蛋白在發(fā)酵120 h后達到峰值11.9 mg/L，隨后隨時間延長呈下降趨勢。在發(fā)酵144 h時，分泌總蛋白含量達300.6 mg/L。

圖4 GpMgJ生長曲線Fig.4 Growth curve of GpMgJ

2.4 重組酵母

GpMgJ菌體生長曲線見圖4。18～36 h生長最旺盛，為對數(shù)生長期；36～48 h生長變的相對緩慢；48 h時菌體密度（OD600nm）達到最高46.9，此后進入穩(wěn)定期。

2.5重組雜合肽表達條件的優(yōu)化

圖5 甲醇體積分?jǐn)?shù)對目的蛋白表達的影響Fig.5 Expression of target peptide at different concentrations of methanol

2.5.1甲醇體積分?jǐn)?shù)

由圖5可知，甲醇體積分?jǐn)?shù)在0.5%時，分泌總蛋白含量和目的蛋白的表達量均達到最大值，因此，甲醇的最佳誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)為0.5%。

2.5.2誘導(dǎo)時間

圖6 誘導(dǎo)時間對目的蛋白表達的影響Fig.6 Expression of target peptide at different fermentation times

由圖6可知，重組菌GpMgJ經(jīng)過誘導(dǎo)后，分泌總蛋白含量和目的蛋白含量逐漸上升，誘導(dǎo)120 h時目的蛋白達到最高值11.9 mg/L。120 h后，總分泌蛋白量雖然繼續(xù)上升，但目的蛋白分泌量下降。因此，最佳誘導(dǎo)表達時間為120 h。2.5.3誘導(dǎo)溫度由圖7可知，隨著溫度升高或降低，蛋白表達都會受到影響。在28℃誘導(dǎo)表達時，蛋白的表達量最高。因此，最佳表達溫度為28℃。

圖7 誘導(dǎo)溫度對目的蛋白表達的影響Fig.7 Expression of target peptide at different temperatures

2.5.4初始菌體濃度

圖8 初始菌體濃度對目的蛋白表達的影響Fig.8 Effect of initial cell concentration on the expression of target peptide

由圖8可知，當(dāng)OD600nm在5～40范圍內(nèi)，隨著誘導(dǎo)起始菌體濃度的增加，目的蛋白表達量緩慢增加，當(dāng)OD600nm超過40后，目的產(chǎn)物的表達量有所下降。

2.6重組雜合肽的抗菌活性

圖9 金黃色葡萄球菌的MIC檢測結(jié)果Fig.9 MIC of MgJ onS. aureusATCC 29213

由圖9可知，有細菌生長者呈亮黃色，無細菌生長者為紅色。自10 ?g/mL質(zhì)量濃度起，較高質(zhì)量濃度的MgJ能顯著抑制S. aureusATCC 29213生長，由此推斷，MgJ對S. aureusATCC 29213的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）為10 ?g/mL。在MIC孔及前后孔各取培養(yǎng)液10μL，轉(zhuǎn)種MH平板，35℃培養(yǎng)24 h，在較低稀釋梯度孔沒有細菌生長；MIC孔無細菌生長；較高稀釋梯度孔有細菌生長，證明結(jié)果判定正確。

3 結(jié)論與討論

畢赤酵母表達系統(tǒng)在表達異源蛋白上有諸多優(yōu)點[13]。本實驗對雜合抗菌肽基因表達的誘導(dǎo)劑體積分?jǐn)?shù)、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度、初始菌體濃度4個表達條件進行了優(yōu)化。

當(dāng)誘導(dǎo)劑甲醇體積分?jǐn)?shù)高時不僅對目的蛋白的表達具有抑制作用，也會抑制細胞的生長甚至導(dǎo)致細胞的死亡；甲醇體積分?jǐn)?shù)較低時，甲醇會成為限制性底物，限制蛋白表達。因此，過高或過低的甲醇體積分?jǐn)?shù)對畢赤酵母表達外源蛋白都不利[14-16]。本研究結(jié)果顯示甲醇的最佳誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)為0.5%。

外源目的蛋白MgJ在培養(yǎng)基中的積累是一個動態(tài)的過程，一方面畢赤酵母不斷分泌表達MgJ，另一方面MgJ又不斷被降解，因此，MgJ在培養(yǎng)基中的積累隨時間的變化而變化[17]。本研究結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)120 h以后，培養(yǎng)基中的總分泌蛋白雖然繼續(xù)增加，但目的蛋白分泌量下降?？赡苁怯捎谀康牡鞍椎姆置跍p少，而胞外酶對目的蛋白水解作用加劇的結(jié)果。

畢赤酵母最適生長溫度在28～30℃之間[18]。研究結(jié)果證實，在28℃發(fā)酵時，外源MgJ的表達量較高，高于或低于此范圍都將顯著影響其表達量。

在一般情況下，細胞光密度（OD600nm）值隨著接種量的增加而呈上升趨勢。隨著誘導(dǎo)起始菌體濃度的增加，目的蛋白表達量也會緩慢增加，但也有研究證實，過大的初始菌體濃度反而會造成目的蛋白表達量的下降[19]。這可能與表達過程中培養(yǎng)基的溶氧有關(guān)。發(fā)酵過程中具有足夠的溶氧，菌體濃度越大，目的蛋白的表達量也應(yīng)越高。高密度發(fā)酵可以提高單位培養(yǎng)上清中分泌蛋白的含量，但隨著重組菌生長穩(wěn)定期的到來，菌體的繁殖速率下降，死亡速率逐步上升，雖然菌體的總數(shù)沒有變化，可蛋白酶等代謝產(chǎn)物的分泌卻逐步增多，使得外源蛋白被降解而影響表達量。因此，可以通過有效控制初始菌體濃度與表達時間的相互關(guān)系以獲得最大表達量[20]。

由此可見，獲得了雜合抗菌肽MgJ最佳表達條件且表達產(chǎn)物抗菌活性良好。重組表達的雜合抗菌肽MgJ在體外具有顯著的抑制細菌生長的作用，可作為抗微生物活性物質(zhì)應(yīng)用于制備食品防腐劑[21]，為開發(fā)新型抗菌劑提供了參考。

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Optimization of Expression Conditions for Hybrid Antimicrobial Peptide MgJ in Pichia pastoris

YIN Jia
(College of Biology and Food Engineering, Jilin Institute of Chemical Technology, Jilin 132022, China)

The objective of this study was to determine the optimal induction conditions for the expression of hybrid antimicrobial peptideMgJinPichia pastoris. TheSacI-linearized recombinant expression vector pPICZαA-MgJ was transformed intoPichia pastorisGS115 by electroporation. The positive clones were screened with Zeocin and identified by PCR. The protein expression was induced by methanol and the expression conditions of hybridantimicrobial peptide MgJ were optimized. The results showed that the optimum expression conditions of MgJ were as follows: 28℃, 250 r/min, adding 0.5%(V/V) methanol to the culture every 24 h, and induced expression time 120 h. The amount of expressed MgJ could reach up to 11.9 mg/L. After purification, the expressed product MgJ had better antimicrobial activity onS. aureusATCC 29213 with a minimal inhibitory concentration (MIC) of 10μg/mL.

hybrid antimicrobial peptide MgJ;Pichia pastoris; optimization of expression conditions

Q78

1002-6630（2015）11-0162-05

10.7506/spkx1002-6630-201511031

2014-07-02

吉林化工學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項目（2012066）

尹佳（1983—），女，講師，碩士，研究方向為食品生物技術(shù)與功能性食品。E-mail：yinjia612@163.com