張曉勉，高智慧，李明良，岳春雷，

袁信昌4，吳敏霞5，王 泳1，李賀鵬1，陳 斌4

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江省林業(yè)技術(shù)推廣總站，浙江 杭州 310020；3. 浙江省桐廬縣莪山鄉(xiāng)人民政府，浙江 桐廬 311512；4. 浙江省舟山市農(nóng)林與漁農(nóng)村委員會，浙江 舟山316021；5. 浙江省溫嶺市林業(yè)技術(shù)推廣站，浙江 溫嶺 317500）

無柄小葉榕耐寒性研究

張曉勉1，高智慧2*，李明良3，岳春雷1，

袁信昌4，吳敏霞5，王 泳1，李賀鵬1，陳 斌4

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江省林業(yè)技術(shù)推廣總站，浙江 杭州 310020；
3. 浙江省桐廬縣莪山鄉(xiāng)人民政府，浙江 桐廬 311512；4. 浙江省舟山市農(nóng)林與漁農(nóng)村委員會，浙江 舟山316021；5. 浙江省溫嶺市林業(yè)技術(shù)推廣站，浙江 溫嶺 317500）

采用人工模擬低溫處理技術(shù)測定無柄小葉榕離體葉片在不同低溫梯度脅迫下電解質(zhì)滲出率的變化，并利用Logistic方程擬合其電解質(zhì)滲出率的曲線，計算半致死溫度（LT50）。結(jié)果表明：在低溫脅迫處理過程中，隨著溫度的降低，電解質(zhì)滲出率與處理溫度呈負相關(guān)；電解質(zhì)滲出率整體變化呈典型的“S”形單峰曲線；經(jīng)顯著性檢驗相關(guān)系數(shù)均在0.91以上，符合Logistic方程；通過方程拐點確定無柄小葉榕半致死溫度為-3.95℃。

無柄小葉榕；電解質(zhì)滲出率；電導(dǎo)法；Logistic方程；耐寒性

無柄小葉榕（Ficus concinna var. subsessilis）是小葉榕（Ficus concinna）的一個變種，在我國主要分布在浙江南部、廣西、廣東等省份[1~2]。無柄小葉榕樹姿雄偉，長壽常綠，是優(yōu)良的造林綠化樹種；同時由于其優(yōu)良的耐鹽堿特征使其成為一種沿海防護林建設(shè)的重要樹種，在我國南方的生態(tài)綠化中占據(jù)重要的位置[3]。但由于該樹種主要產(chǎn)于我國亞熱帶最北緣，對于干旱和低溫相對敏感，因此探討和研究無柄小葉榕的耐寒特性和寒害發(fā)生機理對于擴大其種植面積和制定合理的抗寒措施有重要意義。

電導(dǎo)法結(jié)合Logistic方程判斷電解質(zhì)外滲與低溫傷害程度的關(guān)系是測定植物耐寒性常用的方法[4]。從Dexter等使用電導(dǎo)法測定植物抗性以來[4]，這種方法得到了不斷的完善和發(fā)展。Sukumatan等提出了電解質(zhì)透出率達50%時為半致死溫度的觀點[5]，但半致死溫度并不總是表現(xiàn)為電解質(zhì)透出率達50%時的溫度。Rajashekar C等利用Logistic曲線描述低溫對植物細胞膜的傷害過程，提出曲線拐點為LT50的觀點[6]，即以植物組織在一系列冰凍溫度下測得的電解質(zhì)透出率配以 Logistic方程，利用求拐點溫度作為組織半致死溫度。半致死溫度在溫度——細胞傷害率的“S”型曲線上表現(xiàn)為曲線的拐點所對應(yīng)的溫度，它能較直觀、準確地反映植物的抗寒能力和所能耐受的低溫極限，這種觀點在我國得到了廣泛的認同[7~11]。

本研究根據(jù)低溫脅迫后細胞原生質(zhì)滲透性發(fā)生變化這一原理，應(yīng)用電導(dǎo)法結(jié)合 Logistic方程擬合求出無柄小葉榕半致死溫度，從而對其耐寒性能進行初步評價分析，為其在浙江擴大栽培區(qū)域以及制定合理的抗寒措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實驗時間為2013年3月，實驗材料來自浙江省林業(yè)科學(xué)研究院大棚中栽培的3年生小葉榕盆栽苗。實驗時從盆栽苗中隨機選取生長基本一致的葉片樣品帶回實驗室進行相應(yīng)實驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 低溫處理 取各單株成熟葉片進行低溫處理．隨機采取各單株位于中上部當年生側(cè)枝上的第4、第5、第6個葉片（完整無病蟲害），每個單株15枚左右。采后用濕潤紗布包裹放入自封袋中密封，帶回實驗室，用自來水、蒸餾水和重蒸餾水沖洗干凈后，用紗布擦干，各單株葉片分為3個重復(fù)（每重復(fù)5片），低溫處理設(shè)為0、-2、-4、-6、-8℃ 5個溫度梯度，低溫處理時降溫幅度為4℃/h，達到處理溫度后保持24h，然后解凍（升溫速度為4℃／h），解凍溫度達室溫（15℃）后，進行葉片受害程度觀測和電導(dǎo)率測定。

1.2.2 電解質(zhì)滲出率（相對電導(dǎo)率）的測定 低溫處理結(jié)束后，取出試管，加入蒸餾水5 mL，真空滲入15 min，振蕩一下，置25℃下放置3 h，取出再振蕩一下，靜置后用DDS-11A型數(shù)字電導(dǎo)率儀測電導(dǎo)率值，后置沸水浴中15 min，冷卻后測煮沸電導(dǎo)率值，計算電解質(zhì)滲出率（相對電導(dǎo)率，處理電導(dǎo)率與煮沸電導(dǎo)率之百分比）。1.2.3 數(shù)據(jù)處理 對實驗數(shù)據(jù)（電解質(zhì)滲出率）進行Logistic回歸分析，Logistic方程為：

其中，y為實測細胞傷害率；t代表冷凍溫度；k為細胞傷害率的飽和容量；a、b為方程參數(shù)。為確定a、b值，將Logistic方程轉(zhuǎn)化為，則轉(zhuǎn)化為細胞傷害率（ y'）與處理溫度（t）的直線方程。通過直線回歸的方法求出a、b值，對回歸方程進行二階導(dǎo)數(shù)變換的方程曲線的拐點值，即為半致死溫度（LT50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同低溫處理對無柄小葉榕形態(tài)變化的影響

不同低溫處理后小葉榕葉片樣品于室內(nèi)靜置12 h后，觀察其形態(tài)變化，結(jié)果見表1。從表1可以看出，不同低溫處理條件下小葉榕葉片受傷害程度差異比較明顯。總體表現(xiàn)為：0和-2℃處理后，凍害不明顯；-4℃處理后產(chǎn)生凍害；-6℃處理后有明顯凍害；-8℃處理后有嚴重凍害。

2.2 不同低溫處理對無柄小葉榕葉片電解質(zhì)滲出率的影響

表1 葉片凍害程度形態(tài)觀察Table 1 Morphological changes after different cold stress

低溫造成膜傷害的結(jié)果是膜滲透性的改變和喪失，細胞內(nèi)物質(zhì)大量向外滲透，并最終引起細胞的死亡。電解質(zhì)滲出率可以反映組織傷害的程度和植物抗寒能力的高低[8]。

從圖1可以看出，整個電解質(zhì)滲出率的變化趨勢呈緩慢、急劇、再緩慢的“S”型變化趨勢，處理溫度與電解質(zhì)滲出率之間呈顯著負相關(guān)，平均相關(guān)系數(shù)達-0.932。有研究表明，低溫使膜透性呈可逆性增加時，是葉片細胞對低溫刺激的一種適應(yīng)性反應(yīng)；當它呈半可逆增加時，則是細胞遭受傷害的標志；呈不可逆增加時，則是細胞因冷致死的結(jié)果[13]。

從整個低溫處理過程來看，在 0℃時，電解質(zhì)滲出率平均值為26%，說明細胞膜已有部分破壞。從0℃到-2℃過程中，電解質(zhì)滲出率降低，原因可解釋為在剛開始一段時間內(nèi)植物細胞膜受到一定程度的破壞，而后由于植物對低溫脅迫產(chǎn)生了一定的防衛(wèi)反應(yīng)，特別是保護酶系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)等適應(yīng)性防御反應(yīng)在一定程度上維持膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使電解質(zhì)滲出率有所降低。但當溫度在-2℃到-6℃過程中，隨著溫度的繼續(xù)降低，低溫脅迫超出了植物細胞的防衛(wèi)反應(yīng)能力，使植物細胞膜破壞加強，導(dǎo)致細胞電解質(zhì)滲出率急劇上升[14]。當溫度低于-6℃時，細胞電解質(zhì)滲出率增速變緩，說明膜透性幾乎完全被破壞[15]。

圖1 不同溫度梯度小葉榕葉片電解質(zhì)滲出率Figure 1 Electrolyte leakage rate in leaves of F. concinna var. subsessilistreated with different temperature

2.3 低溫處理條件下無柄小葉榕電解質(zhì)滲出率Logistic回歸模型建立及抗寒性能分析

半致死溫度是植物抗寒性強弱的重要參考指標，某植物的半致死溫度只有低于或等于該地區(qū)的最低溫度時，該植物才能正常越冬。因此，對植物組織進行人工低溫處理，通過分析不同溫度下的電解質(zhì)滲出率值，模擬出相應(yīng)的 Logistic回歸方程，能較好地反映出該植物的抗寒能力[16]。朱根海等在研究不同低溫處理盆栽小麥的變化情況時發(fā)現(xiàn)，其電解質(zhì)滲出率曲線呈“S”形，認為應(yīng)用電導(dǎo)法配合 Logistic方程求出“S”形曲線的拐點溫度能較準確地估計出植物組織的低溫半致死溫度（LT50），而且LT50可作為植物抗寒性的重要指標之一[9]。Logistic方程是一個典型的“S”曲線方程，在數(shù)學(xué)上拐點即時的值，即為LT50。莫惠棟利用方程回歸統(tǒng)計法對溫度和電解質(zhì)滲出率進行Logistic回歸分析，計算出LT50，并進行擬合度檢驗，認為可以很好的估計出植物組織的低溫半致死溫度[17]。

本研究以0、-2、-4、-6、-8℃人工低溫處理條件下，各無柄小葉榕離體葉片的電導(dǎo)率數(shù)值為依據(jù) ，建立無柄小葉榕葉片電解質(zhì)滲出率的回歸方程（表 2）。從表 2可以看出，在低溫脅迫下，電解質(zhì)滲出率與溫度之間的關(guān)系曲線，能較好地用Logistic曲線方程進行擬合，擬合度都在0.91以上，達到顯著水平。說明在本研究中，不同低溫處理的電解質(zhì)滲出率遵循 Logistic方程的變化規(guī)律，與半致死溫度呈線性關(guān)系，且擬合結(jié)果可靠，精確度較高。通過對三個重復(fù)得到的半致死溫度的平均可以得出無柄小葉榕低溫的LT50為-3.95℃。將各重復(fù)半致死溫度代入擬合方程可得出拐點溫度時細胞傷害率，經(jīng)過計算三個重復(fù)細胞傷害率的平均值為50%。

表2 不同低溫下無柄小葉榕電解質(zhì)滲出率擬合Logistic方程及LT50Table 2 Fitted logistic equation and half lethal temperature(LT50) for electrolyte leakage rate in leaves of F. concinna var. subsessilis treated with different temperature

3 結(jié)論與討論

細胞膜是生物體與環(huán)境之間的界面結(jié)構(gòu)，對維持生物體正常的生理生化過程有重要的作用。細胞膜是細胞感受環(huán)境脅迫最敏感的部位[18]也是低溫傷害的初始部位[19]。Lyons[20]認為，冷敏感植物在遭受低溫脅迫時，生物膜首先發(fā)生物相改變，由液晶相變?yōu)槟z相，生物膜的透性發(fā)生不同程度的增大，細胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲，引起導(dǎo)電性的變化，根據(jù)細胞導(dǎo)電性的差異，確定膜透性大小，從而推測膜的受傷程度和對寒冷的抗性強弱。電導(dǎo)法就是依據(jù)此原理檢測植物的抗寒性，并以相對電導(dǎo)率擬合Logistic方程求得LT50，以此比較植物在低溫下保持膜系統(tǒng)穩(wěn)定性和完整性的能力判斷植物抗寒能力強弱[4]。

本實驗利用0、-2、-4、-6、-8℃ 5個溫度梯度對無柄小葉榕電解質(zhì)滲出率進行測定。研究表明，電解質(zhì)滲出率與處理溫度呈顯著負相關(guān)，整個電解質(zhì)滲出率的變化趨勢呈緩慢、急劇、再緩慢的“S型變化趨勢。當溫度在-2℃到-6℃過程中，植物細胞膜破壞加強，細胞電解質(zhì)滲出率急劇上升。當溫度低于-6℃時，細胞電解質(zhì)滲出率增速變緩，說明膜透性幾乎完全被破壞。

有研究表明，植物組織遭受低溫脅迫時，膜透性發(fā)生變化，傷害程度不同，膜透性變化不同，但在輕度傷害時膜的透性是可恢復(fù)的。低溫對細胞膜傷害存在一個臨界溫度，低于臨界溫度時，對膜結(jié)構(gòu)的破壞是可逆的[21]。在本研究中，在0℃到-2℃過程中，細胞電解質(zhì)滲出率呈下降趨勢，-2℃時質(zhì)膜傷害率低于0℃，這就是植物在初遇低溫時自我保護機制起作用的結(jié)果。

用電導(dǎo)法配合 Logistic方程計算材料的半致死溫度比較簡便，而且可靠性強，現(xiàn)已應(yīng)用于多種植物材料耐寒性的測定[22~23]。本研究以小葉榕成熟葉片為材料，嚴格控制低溫處理和材料浸提的溫度與時間，然后利用低溫處理后的電解質(zhì)滲出率值擬合Logistic方程，最后采用拐點法求得無柄小葉榕的半致死溫度為-3.95℃。但需要說明的是，在自然生長狀態(tài)下，植物體的生理狀況會隨外界環(huán)境因素的變化而發(fā)生改變，并會產(chǎn)生一系列適應(yīng)性變化，逐漸形成其抗寒性[24]。人工低溫脅迫下，通過相對電導(dǎo)率來判斷植物的被傷害程度與抗寒能力，忽略了很多外來影響因素。因此，本研究所得到的葉片LT50，只是判別抗寒性差別的依據(jù)之一。要更為準確地對無柄小葉榕的抗寒能力做出科學(xué)判斷，不僅需要進行生理生化方面的多指標綜合分析，還需要進行自然狀態(tài)下的生理指標測定和低溫脅迫后恢復(fù)生長試驗等后續(xù)研究[25]。

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Determination of Cold Resistance of Ficus concinna var. subsessilis by REC with Logistic Equation

ZHANG Xiao-mian1，GAO Zhi-hui2*，LI Ming-liang3，YUE Chun-lei1，YUAN Xin-chang4，WU Min-xia5，WANG Yong1，LI He-peng1，CHEN Bin4

（1. Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China; 2. Zhejiang Forestry Extension Station, Hangzhou 310020, China; 3. E’shan Township Government of Tonglu, Tonglu 311512, China; 4. Zhoushan Agro-forestry, Fishery and Rural Area Committee, Zhoushan 316021, China; 5. Wenling Forestry Extension Station of Zhejiang, Wenling 317500, China）

Electrolyte leakage in leaves of Ficus concinna var. subsessilis were determined under simulated low temperature and Logistic equation was fitted with curves of electrolyte leakage for calculating semi-lethal temperature (LT50). The results showed that electrolyte leakage rate had negative relation with decrease of temperature and the curve showed a typical“S”shape. Correlation coefficient was above 0.91 after test of significance, which met with logistic equation. LT50of F. concinna var. subsessilis was -3.95℃.

Ficus concinna var. subsessilis; electrolyte leakage rate; relative electric conductivity; Logistic equation; cold resistance

S718.51

A

1001-3776（2015）03-0026-05

2015-01-04；

2015-04-18

浙江省科技廳院所專項“千里沿?；闪謳ЫㄔO(shè)關(guān)鍵技術(shù)研究與集成示范”（2012F30020）；浙江省林業(yè)廳省院合作項目“小葉榕耐寒種質(zhì)資源的引選研究與示范”（2011SY04）、浙江省林業(yè)廳推廣項目“沿?；闪謳ЫㄔO(shè)關(guān)鍵技術(shù)推廣與示范”（2012B32）

張曉勉（1983-），男，河南南陽人，助理研究員，博士，從事森林生態(tài)等研究；*通訊作者。