李姝靜，周自若，岳軍治，周 威，王心蕊，白冬生

（北京工商大學 理學院 化學系，北京100048）

虎杖甙，又名云杉新甙、白藜蘆醇甙，提取自蓼科植物虎杖的干燥根莖和根，是其中一種天然活性成分，被廣泛應用于醫(yī)藥和保健品方面［1，2］?；⒄冗耙驯蛔C明具有抗血小板聚集［3］、抑制腫瘤［4］、抗氧化活性［5，6］及抗炎［7］等生理功能，還可以保護由缺糖缺氧引起的心肌細胞損傷［8，9］。雖然虎杖甙具有保護人體健康的效果，但由于虎杖甙在水中溶解度較小，在紫外照射下易發(fā)生異構化，不穩(wěn)定，導致生物利用度低，其應用受到了限制［10］。因此增大虎杖甙的溶解度和光穩(wěn)定性對拓寬虎杖甙的應用范圍具有重要的意義。

環(huán)糊精（CDs）是一系列由D（＋）－葡萄糖單元通過α－1，4－糖苷鍵連接形成的環(huán)狀低聚糖，具有親水的外圍和疏水的空腔［11］。它的手性疏水空腔可以提供一個尺寸和形狀相對固定的手性環(huán)境［12］，使其可以包合很多疏水性客體分子并使客體分子的物化性質(zhì)得到改進，如提高難溶性化合物的水溶性［13，14］，不穩(wěn)定化合物的光、熱穩(wěn)定性［15］，以及 藥 物 和 香 味 物 質(zhì) 的 控 制 釋 放 等［16，17］。其 中，β－環(huán)糊精（β－CD）因其廉價、具有適中的空腔尺寸、容易形成包合物等優(yōu)點，使其在包合物制備和藥物載體等方面得到廣泛的應用。然而，未經(jīng)修飾的β－CD具有較低的水溶性（25℃下的溶解度約為18．5g／L），限制了其應用。近年來，各種β－CD的衍生物得到了較大范圍的應用。其中，羥丙基－β－環(huán)糊精（HP－β－CD）因其水溶性好、無毒性等優(yōu)點受到廣泛關注［18，19］。

本文以虎杖甙為客體分子，將通過相溶解度方法研究主客體化合物在溶液中的相互作用，通過冷凍干燥法制備虎杖甙／HP－β－CD的包結物，并采用XRD、TG、DSC、SEM等技術手段表征包合物的結構。在此基礎上，考察了包合前后虎杖甙的光穩(wěn)定性。

1 實驗部分

1．1 試劑和儀器

試劑：虎杖甙（＞99%，阿拉丁公司），羥丙基－β－環(huán)糊精（HP－β－CD，Mw＝1380g／mol，DS＝4．2，上海西寶生物科技有限公司），其它試劑和溶劑均購于北京化工廠，溶劑使用前均經(jīng)干燥處理，水溶液均使用去離子水配置。

儀器：CARY－60分光光度計（瓦里安，美國），D／MAX 2500V／PC X 射線衍射儀，DTG－60AH熱重分析儀（島津，日本）；TESCAN VEGA Ⅱ掃描電鏡（捷克）。

1．2 制備方法

1．2．1 虎杖甙／HP－β－CD包合物的合成

虎杖甙（0．6mmol，234mg）溶于40mL的乙醇中，HP－β－CD（0．3mmol，410mg）溶于160mL的蒸餾水中，將HP－β－CD溶液緩慢加入虎杖甙溶液中，并攪拌48h后，旋蒸除去大部分溶劑，濃縮后的樣品經(jīng)0．45μm的濾膜過濾，濾液經(jīng)冷凍干燥后，所得樣品即為HP－β－CD／虎杖甙包合物。

1．2．2 虎杖甙／HP－β－CD的物理混合物

將HP－β－CD和虎杖甙按照摩爾比1∶1的比例稱取，在瑪瑙研缽中充分研磨使其混合均勻。

1．3 相溶解度

稱取100mg的虎杖甙分別加入10mL不同濃度的 HP－β－CD溶液中（濃度梯度從0mmol／L到10．0mmol／L），在25℃的水浴條件下，保持120r／min振動頻率進行充分振蕩，振蕩時間為72h。達到平衡后，經(jīng)0．45μm的濾膜除去不溶的虎杖甙，用紫外－可見分光光度計測定濾液中虎杖甙的含量。然后以虎杖甙溶解度為縱坐標，HP－β－CD的濃度為橫坐標，繪制虎杖甙的相溶解度曲線并計算包合相平衡常數(shù)（Ks）［20］。

其中，S0表示在25℃時不添加環(huán)糊精的虎杖甙的溶解度，Slope為相溶解度曲線的斜率。

1．4 X－射線粉末衍射（XRD）

實驗條件：CuKa射線，波長為0．154056nm，電壓40kV，電流40mA，掃描速度4°／min，2θ范圍5°～50°。

1．5 熱重分析（TG）及差示掃描量熱法（DSC）

熱重分析及差示掃描量熱法的測量儀器為DTG－60AH（島津，日本），實驗條件：升溫范圍30～400℃，升溫速率10℃／min，氮氣流量70mL／min。

1．6 掃描電子顯微鏡（SEM）

將樣品粉末均勻涂布在導電膠帶上，放入噴金儀中，在20W的真空狀態(tài)下噴金30s，使樣品被涂上一層金薄膜層，之后放入掃描電鏡中觀察樣品形貌。

1．7 光穩(wěn)定性研究

用波長范圍為200～400nm的紫外燈光照濃度為6×10－5mol／L的虎杖甙、虎杖甙／HP－β－CD包合物的溶液，不同時間點取樣測定吸光度，檢測波長為310nm。

2 結果與討論

2．1 HP－β－CD對虎杖甙的識別作用

包合物形成過程中，包合比是表征包合物結構的一個重要參數(shù)。同時，包合物形成常數(shù)K值既是包合作用強弱的量度，也是表征各種主體對客體分子識別作用強弱的重要參數(shù)。相溶解度法是測定環(huán)糊精與客體分子包合形成常數(shù)、包合比的一種常用方法。

圖1 HP－β－CD存在下虎杖甙的相溶解度曲線

圖1為不同 HP－β－CD濃度下虎杖甙的相溶解度圖，從圖中可以看出，虎杖甙在水溶液中的溶解度隨HP－β－CD濃度的增加呈現(xiàn)一種線性的增長?；?Higuchi理論［20］，表明 HP－β－CD與虎杖甙形成了摩爾比為1∶1的包合物。計算得出虎杖 甙 與 HP－β－CD 的 包 合 平 衡 常 數(shù) 為1308mol－1·L。此外，包合作用使虎杖甙的溶解性也得到了顯著提升，HP－β－CD濃度為10mmol／L時，虎杖甙的溶解度增大了12．17倍，表明包合作用使虎杖甙的水溶性有了較大幅度提升。

2．2 包合物結構表征

2．2．1 X射線粉末衍射（XRD）

X射線粉末衍射是表征主客體包合物的常用研究方法。如圖2所示，A～D分別為虎杖甙（圖2A）、HP－β－CD（圖2B）、HP－β－CD與虎杖甙摩爾比為1∶1的物理混合物（圖2C）及虎杖甙／HP－β－CD包合物（圖2D）的X射線粉末衍射圖。從圖中可以看出，客體分子虎杖甙具有明顯的晶型結構，主體分子HP－β－CD為無定型結構，物理混合物為兩者混合疊加而成，而形成虎杖甙／HP－β－CD包合物后，虎杖甙的晶型結構消失了，包合后虎杖甙由包合前的晶形轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定型結構，證明了包合物的形成。

圖2 XRD圖

2．2．2 熱重分析（TG）及差示掃描量熱法（DSC）

熱重分析及差示掃描量熱法也是研究包合物形成的有效方法。圖3A～D分別為虎杖甙（圖3A）、HP－β－CD（圖3B）、HP－β－CD與虎杖甙摩爾比為1∶1的物理混合物（圖3C）及虎杖甙／HP－β－CD包合物（圖3D）的熱重分析圖。從圖中看出，虎杖甙的TG曲線在270℃處出現(xiàn)下降，表示在該溫度下虎杖甙發(fā)生分解，HP－β－CD的分解溫度為304℃，虎杖甙／HP－β－CD 包合物的分解溫度為298℃。而虎杖甙與HP－β－CD物理混合物的TG圖與其包合物的TG圖相差不大，可能是因為虎杖甙在熔化后部分與 HP－β－CD形成了包合物。以上結果表明，虎杖甙和HP－β－CD發(fā)生了包合作用，經(jīng)包合后虎杖甙的熱穩(wěn)定性得到了提高。

圖3 TG圖

圖4A～D分別為虎杖甙（圖4A）、HP－β－CD（圖4B）、HP－β－CD與虎杖甙摩爾比為1∶1的物理混合物（圖4C）及虎杖甙／HP－β－CD包合物（圖4D）的DSC圖。虎杖甙在230℃時出現(xiàn)了一個吸熱峰，HP－β－CD出現(xiàn)吸熱峰的溫度為323℃。物理混合物的DSC譜圖則是虎杖甙與HP－β－CD譜圖的簡單疊加。而虎杖甙／HP－β－CD包合物的吸熱峰則上升至354℃，表明主客體分子間已經(jīng)形成了包合結構。這一結果進一步證明了虎杖甙和HP－β－CD之間形成了包合物。

圖4 DSC圖

2．2．3 掃描電子顯微鏡（SEM）

SEM是研究物質(zhì)表面結構的一種定性分析方法?；⒄冗啊P－β－CD、物理混合物、包合物的SEM圖如圖5所示，虎杖甙的形貌為中等尺寸的柱狀形，而HP－β－CD的形貌為球形。物理混合物中既出現(xiàn)了虎杖甙特有的晶體形狀，也有HP－β－CD特有的形狀，說明兩者未發(fā)生化學反應。而對于虎杖甙／HP－β－CD的包合物，其結構為片狀，尺寸和形貌與虎杖甙及HP－β－CD均不相同，以此可以進一步推測，虎杖甙和HP－β－CD之間形成了包合物。

2．3 虎杖甙及其包合物光穩(wěn)定性研究

圖5 SEM圖

式1 虎杖甙光異構示意圖

圖6 （A）虎杖甙隨光照時間的紫外－可見光譜圖；（B）虎杖甙／HP－β－CD包合物隨光照時間的紫外－可見光譜圖；（C）虎杖甙及虎杖甙／HP－β－CD包合物在310nm處隨光照時間的變化圖

虎杖甙對光特別敏感，在光照下可由反式虎杖甙異構為順式虎杖甙（式1）。本研究測定了虎杖甙及其包合物的光穩(wěn)定性，如圖6A、6B所示，隨著光照時間的增加，虎杖甙及其包合物在310nm處的吸光度逐漸下降。以虎杖甙及其包合物在310nm處的吸光度及光照時間作圖，從圖6C中可以看出，虎杖甙的吸光度下降較快，包合物的吸光度下降趨勢與虎杖甙類似，但總體的下降值要遠小于純的虎杖甙，由此可以證明，虎杖甙被HP－β－CD包合后，其光穩(wěn)定性得到了提高。其原因為虎杖甙經(jīng)HP－β－CD包合后，環(huán)糊精空腔在一定程度上限制了虎杖甙的異構。

3 結論

采用冷凍干燥法制備了虎杖甙／HP－β－CD包合物，HP－β－CD與虎杖甙形成了包合比為1∶1的包合物。XRD、TG、DSC及SEM的結果均表明虎杖甙與 HP－β－CD形成了包合物，并且，經(jīng) HP－β－CD包合后，虎杖甙的水溶性及熱穩(wěn)定性均得到有效提高。此外，光穩(wěn)定性實驗表明包合后虎杖甙的光穩(wěn)定性也得到了有效提高。本文研究結果為虎杖甙／HP－β－CD包合物的應用提供了理論依據(jù)。

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