陳 蘊(yùn)， 楊雪麗， 周海燕， 黃 超， 王文龍， 龔笑海， 馮柏年， 金 堅(jiān)

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

PARP-1體外活性測(cè)定方法的建立及其應(yīng)用

陳 蘊(yùn)， 楊雪麗， 周海燕， 黃 超， 王文龍， 龔笑海， 馮柏年， 金 堅(jiān)*

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

建立PARP-1的體外活性測(cè)定方法并對(duì)84個(gè)具有潛在PARP抑制活性的化合物進(jìn)行篩選。從Sf9昆蟲細(xì)胞中提取酶液，以NAD+為底物，DNA為激活劑，建立PARP-1的活性測(cè)定方法；以高通量技術(shù)參數(shù)評(píng)價(jià)此方法，用已知PARP抑制劑進(jìn)行驗(yàn)證，并以此方法進(jìn)行PARP抑制劑的篩選。結(jié)果顯示，確定的酶促反應(yīng)體系為：12.5 nmol/L NAD+，15 μg/mL DNA，6.25×10-4U PARP-1。評(píng)價(jià)Z'因子為0.76，S/B值為3.58?；诖四Ｐ秃Y出47個(gè)化合物在濃度7.4 μmol/L時(shí)對(duì)PARP-1的抑制率達(dá)到60%以上。表明所建立的PARP-1活性測(cè)定方法，適用于PARP-1抑制劑的高通量篩選。

多聚二磷酸腺苷核糖基聚合酶-1；活性測(cè)定；抑制劑；高通量篩選

PARP（Poly（ADP-ribose）polymerase，聚ADP核糖基聚合酶）是一種參與翻譯后修飾的核蛋白質(zhì)，能催化β-NAD+脫去煙酰胺生成PAR（poly（ADP-ribose）），與多種接受體蛋白質(zhì)形成酯鍵連接，進(jìn)而影響多種細(xì)胞過程。至今已發(fā)現(xiàn)18種PARPs，其功能各異也有交叉，參與DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄控制、基因穩(wěn)定和細(xì)胞死亡和轉(zhuǎn)化等過程[1-2]。

PARP-1參與細(xì)胞內(nèi)90%以上的聚ADP-ribose作用，在糖尿病并發(fā)癥、動(dòng)脈粥樣硬化、感染性休克、關(guān)節(jié)炎等疾病過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。此外，PARP-1因與其產(chǎn)物PAR參與DNA堿基切除修復(fù)過程，PARP抑制劑在腫瘤治療中成為聯(lián)合用藥及放射增敏的有效選擇[5]。雖然Pfizer開發(fā)的PARP抑制劑AG014699在2003年首先聯(lián)合Temozolomide用藥進(jìn)入癌癥治療的臨床研究[6]，但至今仍未有正式上市的PARP抑制劑，這些都為PARP抑制劑的相關(guān)研究和研制，提供了有效的參考價(jià)值[7]和可能的廣闊市場前景。

中國藥科大學(xué)[8]和北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所曾在多種中藥及天然藥物中篩選PARP-1抑制劑，但PARP-1的制備和體外篩選方法的建立仍制約著新型PARP抑制劑在我國的研究和發(fā)展。作者所在實(shí)驗(yàn)室前期已成功利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞進(jìn)行hPARP-1的高表達(dá)[9]，解決了PARP-1的制備問題。如何利用獲得的PARP-1建立靈活穩(wěn)定的PARP抑制劑高通量篩選方法，即是本課題研究中擬解決的關(guān)鍵問題。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

表達(dá)PARP-1的Sf9昆蟲細(xì)胞由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存，篩選樣品由江南大學(xué)藥學(xué)院馮柏年教授提供。Deoxyribonucleic acid from calf thymus Type XV，Activated，購于Sigma公司；NAD+氧化型輔酶Ⅰ，Roche公司產(chǎn)品；96孔白板，Corning Costar公司產(chǎn)品；AZD2281（Ku-0059436，Olaparib），購于 Selleck公司；其他化學(xué)試劑均為國藥集團(tuán)分析純。

所用熒光化學(xué)發(fā)光微孔板讀數(shù)儀型號(hào)為Thermo Scientific Fluoroskan Ascent FL。

1.2 方法

1.2.1 PARP-1制備1 000 g離心5 min收集細(xì)胞，棄上清液，用裂解液（25 mmol/L Tris-HCl，

10 mmol/L EDTA，50 mmol/L葡萄糖，1 mol/L NaCl，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.02%Tween-20，0.5 mmol/L PMSF，pH 8.0）重懸細(xì)胞。冰浴超聲破碎，15 000 g、4℃離心40 min，收集上清液，低溫透析將裂解液置換為存儲(chǔ)液 （25 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L BSA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%TritonX-100，體積分?jǐn)?shù)50%甘油，pH 8.0），活性測(cè)定后分裝保存于-80℃冰箱。

1.2.2 NAD+的轉(zhuǎn)化反應(yīng)原理NAD+在堿性條件下與苯乙酮反應(yīng)后，與過量的甲酸經(jīng)加熱反應(yīng)轉(zhuǎn)化為高熒光活性物質(zhì)，通過測(cè)定生成物的熒光值來檢測(cè)反應(yīng)物NAD+的量[10]。利用反應(yīng)緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L MgCl2，pH 8.0）將NAD+稀釋成不同濃度，以每孔30 μL加入96孔板，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔，于室溫條件下輕微振蕩15 min；加入10 μL 2 mmol/L KOH和10 μL體積比1/5的苯乙酮-乙醇，4℃/25℃反應(yīng)5～15 min；加入50 μL體積分?jǐn)?shù)88%甲酸 （終體積分?jǐn)?shù)為44%），110℃反應(yīng)5 min；室溫平衡10～40 min，熒光化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)，激發(fā)波長355 nm，發(fā)射波長460 nm。RFU：Relative Fluorescence Units，相對(duì)熒光單位。

1.2.3 PARP-1活性測(cè)定原理PARP-1被DNA激活后以NAD+為底物進(jìn)行催化反應(yīng)，通過測(cè)定剩余NAD+的量，可檢測(cè)出PARP-1消耗的NAD+的量，從而反映出PARP-1的相對(duì)活性。將PARP-1與DNA以不同濃度混合至 20 μL，加入40 μL NAD+（終濃度為12.5 nmol/L），每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔，只含有DNA的為空白對(duì)照，不含PARP-1的為陰性對(duì)照，含PARP-1的為試驗(yàn)組，室溫輕微振蕩15 min；加入20 μL 2 mmol/L KOH和20 μL體積比1/5的苯乙酮-乙醇，4℃反應(yīng)10 min；加入100 μL體積分?jǐn)?shù)88%甲酸，110℃反應(yīng)5 min；室溫平衡30 min，熒光化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)。相對(duì)酶活力

酶活性單位：12.5 nmol/L NAD+與酶在 15 μg/mL DNA激活作用下于室溫反應(yīng)15 min，1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol/L NAD+所需的酶用量定義為1 U。

1.2.4 PARP-1抑制劑高通量篩選方法評(píng)價(jià)Z'因子是用來評(píng)估高通量篩選模型的一種重要技術(shù)參數(shù)，當(dāng)Z'＞0.5時(shí)才認(rèn)為該模型是可行的，Z'因子越接近1.0，表明該模型的可靠性和可行性越高[11]。可

式（2）中：SD為標(biāo)準(zhǔn)差；M為平均值；“sig”體系：不加PARP-1，只含12.5 nmol/L NAD+和15 μg/mL DNA；“back”體系：12.5 nmol/L NAD+，15 μg/mL DNA，6.25×10-4U PARP-1。按照上述反應(yīng)條件取多個(gè)孔的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算分析。信號(hào)本底比（S/B）反映的是篩選模型獲得的數(shù)據(jù)與本底數(shù)據(jù)之間的距離。一般情況下，信號(hào)本底比的數(shù)值應(yīng)大于3[12]，其計(jì)算公式為

1.2.5 化合物的PARP-1抑制活性測(cè)定所有測(cè)定樣品由DMSO溶解并配制成10 mmol/L?；衔镞m當(dāng)稀釋后以每孔4 μL加入96孔板，PARP-1和DNA混合后以反應(yīng)緩沖液補(bǔ)足至 16 μL，加入40 μL NAD+（終濃度：12.5 nmol/L NAD+，15 μg/mL DNA，6.25×10-4U PARP-1），3個(gè)復(fù)孔，室溫輕微振蕩15 min；后續(xù)步驟同1.2.3。只含NAD+和DNA的為陰性對(duì)照組，只含NAD+、DNA和PARP-1的為陽性對(duì)照組，含化合物的為試驗(yàn)組。抑制率根據(jù)公式（2）計(jì)算：

以GraphPad Prism5.0計(jì)算IC50。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，以GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中*表示p＜0.05；**表示p＜0.01；***表示p＜0.001。

2 結(jié)果與討論

2.1 NAD+反應(yīng)條件的確定

NAD+與苯乙酮在4℃作用10 min，時(shí)間較短，溫度難以控制，為了解該步驟對(duì)最終結(jié)果的影響，對(duì)該反應(yīng)條件的溫度和時(shí)間分別進(jìn)行探索。圖1（a）是NAD+濃度在0～100 nmol/L時(shí)，與苯乙酮在4℃或25℃條件下反應(yīng)10 min的結(jié)果，測(cè)得RFU值并無差異，表明此反應(yīng)中溫度對(duì)結(jié)果并無影響，為減少苯乙酮的揮發(fā)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇4℃作為反應(yīng)溫度。圖1（b）是0～100 nmol/L NAD+與苯乙酮在4℃條件下作用不同時(shí)間的結(jié)果，NAD+濃度較高時(shí)，反應(yīng)5 min與反應(yīng)10 min的RFU值顯示出一定的差異，而10 min與15 min時(shí)的無差異，由此表明該濃度范圍內(nèi)的NAD+與苯乙酮在10 min內(nèi)即可反應(yīng)完全，后續(xù)實(shí)驗(yàn)確定10 min為反應(yīng)時(shí)間。NAD+與苯乙酮反應(yīng)后，需要加入終體積分?jǐn)?shù)44%的甲酸，于110℃反應(yīng)5 min，然后室溫平衡后測(cè)定。為得到穩(wěn)定的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)探索了平衡時(shí)間對(duì)RFU值的影響，結(jié)果如圖1（c）所示，NAD+濃度為12.5 nmol/L時(shí)，反應(yīng)平衡30 min后RFU逐漸趨于穩(wěn)定，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以30 min作為平衡時(shí)間。

圖1 NAD+的化學(xué)定量反應(yīng)條件Fig.1 Reaction conditions of NAD+conversion

2.2 底物NAD+濃度的確定

為減少后續(xù)實(shí)驗(yàn)誤差，將酶反應(yīng)體系擴(kuò)大至60 μL，測(cè)定NAD+濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線以選擇底物用量。結(jié)果見圖2，NAD+濃度在0.1～100 nmol/L時(shí)與RFU值呈良好的線性關(guān)系，實(shí)驗(yàn)中測(cè)得不含NAD+的空白組RFU值為5.0±0.2，選取RFU值500±20為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的陰性值，此時(shí)信噪比為100，可有效減少背景值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，相對(duì)應(yīng)的NAD+濃度即12.5 nmol/L作為底物工作濃度。

圖2 底物NAD+與RFU值的線性關(guān)系Fig.2 NAD+concentration is in a linear relationship with fluorescence intensity

2.3 激活劑DNA濃度的確定

以12.5 nmol/L NAD+作為底物，通過優(yōu)化DNA濃度以提高PARP-1對(duì)NAD+的催化作用，結(jié)果見圖3，選取3個(gè)不同的PARP-1用量，隨著DNA濃度的增加，PARP-1的活性不斷增加，但在10 μg/ mL達(dá)到最高值，繼續(xù)增加DNA濃度PARP-1活性并無提高，為確保反應(yīng)中PARP-1的最高活性，選取15 μg/mL作為DNA的工作質(zhì)量濃度。

圖3 DNA質(zhì)量濃度對(duì)PARP-1活性的影響Fig.3 Effects of DNA concentration on PARP-1 activity

圖4 PARP-1的穩(wěn)定性Fig.4 Activity changes of PARP-1

2.5 PARP-1酶的用量的確定

從1 L昆蟲細(xì)胞（2×106mL-1）中共獲得30 mL PARP-1粗酶液。15 μg/mL DNA激活作用下，不同濃度PARP-1對(duì)12.5 nmol/L NAD+的作用結(jié)果如圖5所示，隨著酶用量增加，反應(yīng)剩余底物不斷減少。設(shè)置S/B值為4，將反應(yīng)15 min后NAD+（12.5 nmol/ L）消耗至（25±2）%（（3.125±0.25）nmol/L）時(shí)的酶活力單位數(shù)（6.25×10-4U）作為PARP-1的用量，結(jié)果表明該批次粗酶液約0.6 μL即可達(dá)到該篩選體系所需要的PARP-1用量。

2.4 PARP-1酶的穩(wěn)定性驗(yàn)證及DMSO體積分?jǐn)?shù)對(duì)PARP-1活性的影響

將PARP-1在室溫條件下放置0～60 min后分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PARP-1活性基本無變化，如圖4（a）所示。后續(xù)化合物篩選過程中以DMSO作母液，為排除DMSO對(duì)結(jié)果的影響，測(cè)定了不同DMSO體積分?jǐn)?shù)對(duì)PARP-1活性的影響，結(jié)果如圖4（b）所示，反應(yīng)體系DMSO體積分?jǐn)?shù)高于2.7% 時(shí)對(duì)PARP-1的活性有顯著抑制作用。

圖5 PARP-1活性測(cè)定Fig.5 PARP-1 activity assays

2.6高通量技術(shù)參數(shù)評(píng)價(jià)

為了驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性和可靠性，以高通量技術(shù)參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，得到“sig”值為478±8，“back”值為133±20，計(jì)算Z'為0.76，S/B=3.58。因此可認(rèn)為該反應(yīng)體系適用于PARP-1抑制劑的高通量篩選。

2.7 已知PARP抑制劑的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

選取3個(gè)已知PARP-1抑制劑對(duì)上述篩選方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見圖6，測(cè)得PHE、DPQ、AZD2281的IC50分別為562.4、369.6、6.8 nmol/L，因此可認(rèn)為本模型是一種高效靈敏的PARP抑制劑的活性測(cè)定方法。

2.8 化合物篩選

對(duì)84個(gè)具有潛在PARP抑制活性的化合物進(jìn)行初步篩選，結(jié)果如圖7所示，相同濃度的不同化合物表現(xiàn)出對(duì)PARP-1活性的不同抑制作用，其中抑制率高于0.6的有47個(gè)。

圖6 PARP抑制劑的IC50測(cè)定Fig.6 Concentration-inhibition curve of PARP inhibitors on PARP-1

圖7 化合物的PARP-1抑制活性篩選Fig.7 Screening for PARP-1 inhibitors in 96 well plates

3 結(jié)語

PARP抑制劑的篩選模型以PARP酶的活性為基礎(chǔ)，而PARP活性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法常需要放射性/生物素標(biāo)記的NAD+或PAR抗體，成本高，操作較繁瑣[13-16]。

本課題研究中借鑒Karson S.Putt的NAD+化學(xué)定量法，首先進(jìn)行NAD+反應(yīng)條件的評(píng)估，有效地控制了操作過程中的穩(wěn)定性和結(jié)果的重復(fù)性。此外，研究所用的PARP-1來自作者所在實(shí)驗(yàn)室已成功表達(dá)的昆蟲細(xì)胞，經(jīng)一步超聲破碎即可獲取，經(jīng)濟(jì)且高效。同時(shí)，為克服酶的活性差異帶來的影響，作者首先優(yōu)化底物NAD+的濃度，選擇合適的PARP-1活力單位數(shù)，通過調(diào)節(jié)酶液的用量以達(dá)到所需的酶活力單位數(shù)，同時(shí)優(yōu)化酶激活劑DNA的濃度，從而建立了靈活便捷的PARP-1抑制劑篩選方法。最后，以高通量技術(shù)參數(shù)評(píng)價(jià)該方法，并以已知的PARP抑制劑對(duì)該活性評(píng)價(jià)體系進(jìn)行驗(yàn)證，建立了有效的高通量篩選模型，并以此模型對(duì)84個(gè)具有潛在PARP抑制活性的化合物進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

同時(shí)，該活性測(cè)定方法也適用于PARP家族其他蛋白質(zhì)活性的檢測(cè)，但由于NAD+轉(zhuǎn)化條件的限制，反應(yīng)載體需選用耐高溫材料；含有烷基吡啶類結(jié)構(gòu)的化合物會(huì)產(chǎn)生較高的本底值。而在研究前期為降低酶的用量，反應(yīng)體系中底物濃度設(shè)置較低，在操作過程中易影響結(jié)果的重復(fù)性，后期可適當(dāng)提高NAD+濃度，按照本研究方法以酶的活性為基礎(chǔ)，建立新的反應(yīng)體系和高通量篩選模型。

參考文獻(xiàn)：

[1]Woodhouse B C，Dianov G L.Poly ADP-ribose polymerase-1：An international molecule of mystery[J].DNA Repair（Amst），2008，7（7）：1077-1086.

[2]Jagtap P，Szabo C.Poly（ADP-ribose）polymerase and the therapeutic effects of its inhibitors[J].Nat Rev Drug Discov，2005，4（5）：421-440.

[3]Abd Elmageed Z Y，Naura A S，Errami Y，et al.The poly（ADP-ribose）polymerases （PARPs）：New roles in intracellular transport[J].Cell Signal，2012，24（1）：1-8.

[4]Peralta-Leal A，Rodriguez-Vargas J M，Aguilar-Quesada R，et al.PARP inhibitors：New partners in the therapy of cancer and inflammatory diseases[J].Free Radic Biol Med，2009，47（1）：13-26.

[5]Lee J M，Ledermann J A，Kohn E C.PARP Inhibitors for BRCA1/2 mutation-associated and BRCA-like malignancies[J].Ann Oncol，2014，25（1）：32-40.

[6]Plummer R，Jones C，Middleton M，et al.Phase I study of the poly（ADP-ribose）polymerase inhibitor，AG014699，in combination with temozolomide in patients with advanced solid tumors[J].Clin Cancer Res，2008，14（23）：7917-7923.

[7]Ferraris D V.Evolution of poly（ADP-ribose）polymerase-1（PARP-1）inhibitors：From concept to clinic[J].J Med Chem，2010，53（12）：4561-4584.

[8]柳軍，張陸勇.聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1抑制劑高通量篩選模型[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2007，23（1）：124-127.

LIU Jun，ZHANG Luyong.HTS model for Poly（ADP-ribose）polymerase-1 inhibitor[J].Chin Pharmacol Bull，2007，23（1）：124-127.（in Chinese）

[9]周海燕，馬軍，楊雪麗，等.hPARP1酶在桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞中的高表達(dá)及快速純化[J].生物工程學(xué)報(bào)，2013，29（7）：998-1005.

ZHOU Haiyan，MA Jun，YANG Xueli，et al.Expression and purification of hPARP1 by baculovirus system[J].Chin J Biotech，2013，29（7）：998-1005.（in Chinese）

[10]Putt K S，Hergenrother P J.An enzymatic assay for poly（ADP-ribose）polymerase-1（PARP-1）via the chemical quantitation of NAD（+）：Application to the high-throughput screening of small molecules as potential inhibitors[J].Anal Biochem，2004，326（1）：78-86.

[11]王守寶，竺曉鳴，高峰，等.倉鼠糜酶2抑制劑高通量篩選模型的建立及其應(yīng)用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47（2）：168-173.

WANG Shoubao，ZHU Xiaoming，GAO Feng，et al.High-throughput screening for hamster chymase 2 inhibitors[J].Acta Pharmaceutica Sinica，2012，47（2）：168-173.（in Chinese）

[12]王斯文，陳向東，汪輝，等.β-內(nèi)酰胺酶抑制劑高通量篩選模型的建立[J].中國抗生素雜志，2013，38（2）：102-105.

WANG Siwen，CHEN Xiangdong，WANG Hui，et al.Establishment of high-throughput screening model for β-lactamase inhibitor [J].Chinese Journal of Antibiotics，2013，38（2）：102-105.（in Chinese）

[13]Geraets L，Moonen H J，Wouters E F，et al.Caffeine metabolites are inhibitors of the nuclear enzyme poly（ADP-ribose）polymerase-1 at physiological concentrations[J].Biochem Pharmacol，2006，72（7）：902-910.

[14]Decker P，Miranda E A，de Murcia G，et al.An improved nonisotopic test to screen a large series of new inhibitor molecules of poly（ADP-ribose）polymerase activity for therapeutic applications[J].Clin Cancer Res，1999，5（5）：1169-1172.

[15]Brown J A，Marala R B.Development of a high-throughput screening-amenable assay for human poly（ADP-ribose）polymerase inhibitors[J].J Pharmacol Toxicol Methods，2002，47（2）：137-141.

[16]Dillon K J，Smith G C，Martin N M.A flashplate assay for the identification of parp-1 inhibitors[J].J Biomol Screen，2003，8（3）：347-352.

Establishment and Application of Enzymatic Assay for Poly(ADP-Ribose)Polymerase-1

CHEN Yun， YANG Xueli， ZHOU Haiyan， HUANG Chao，WANG Wenlong， GONG Xiaohai， FENG Bainian， JIN Jian*
（School of Pharmaceutical Sciences，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

To establish an enzymatic assay for poly（ADP-ribose）polymerase-1 and screen PARP inhibitors from 84 potential compounds.Crude PARP-1 was extracted from Sf9 insect cells.With nicked DNA as activator，PARP-1 was used to catalyze the hydrolysis of the substrate NAD+，the RFU value measured from the remaining NAD+was used to evaluate the activity of PARP-1 or efficiency of PARP inhibitors.A 96-microwell screening method was set up by optimizing the reaction system．The screening method was assessed with high throughput index，such as Z'factor，signal to back ground （S/B）and validated by well-known PARP inhibitors such as PHE，DPQ and AZD2281.84 compounds were assayed for PARP inhibition through the established method.The enzymatic reaction system was optimized as：12.5 nmol/L NAD+，15 μg/mL DNA，6.25×10-4U PARP-1.The Z'factor is 0.76，S/B is 3.58 and the IC50of PHE，DPQ and AZD2281 is 562.4 nmol/ L，369.6 nmol/L and 6.8 nmol/L.There are 47 compounds showed 60%or more PARP-1 inhibition efficiency at the concentration of 7.4 μmol/L.An enzymatic assay of PARP-1 was successfully established.Itcanbeeffectivelyappliedtohigh-throughputscreeningforPARPinhibitors．

poly（ADP-ribose）polymerase-1，enzymatic assay，inhibitors，high-throughput screening

Q 556.2；R 965.1

A

1673—1689（2015）03—0324—06

2014-04-14

陳 蘊(yùn)（1972—），女，上海崇明人，工學(xué)碩士，講師，主要從事藥理學(xué)研究。Email：chenyun72@126.com

*通信作者：金 堅(jiān)（1960—），男，浙江東陽人，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事藥物設(shè)計(jì)與分子藥理學(xué)研究。E-mail：jinjian31@126.com