鄧鵬程，徐培坤，朱立新，王 斌，楊成子

◇經(jīng)驗(yàn)與體會(huì)◇

腦膠質(zhì)瘤癌組織與外周血中p16甲基化檢測(cè)及臨床意義

鄧鵬程1，徐培坤1，朱立新2，王 斌1，楊成子1

選擇48例腦膠質(zhì)瘤患者血漿及癌組織作為實(shí)驗(yàn)組，10例腦外傷患者壞死腦組織、血漿及10例健康者血漿作為對(duì)照組。應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）和亞硫酸氫鹽處理后測(cè)序（BSP）法檢測(cè)p16基因甲基化，顯示實(shí)驗(yàn)組外周血漿、腫瘤組織中p16基因甲基化率分別為37.5%（18／48）、43.8%（21／48），對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)甲基化現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)組基因甲基化與臨床資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

膠質(zhì)瘤；甲基化；p16；血漿；癌組織

p16基因位于9p21，包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，是常見(jiàn)的抑癌基因，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的異常增殖［1］。p16基因處于甲基化狀態(tài)則無(wú)法發(fā)揮其正常功能。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)48例膠質(zhì)瘤患者的血漿標(biāo)本和癌組織標(biāo)本p16基因甲基化的檢測(cè)，分析p16基因甲基化狀態(tài)與膠質(zhì)瘤的聯(lián)系及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2013年3月～2014年7月于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)中48例腦膠質(zhì)瘤患者的癌組織及對(duì)應(yīng)血漿標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，其中男27例，女21例；年齡7～74歲，中位年齡43.5歲。癌組織標(biāo)本均經(jīng)我院病理科確診：星形細(xì)胞瘤16例，少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤9例，髓母細(xì)胞瘤5例，中樞神經(jīng)細(xì)胞瘤1例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤14例，室管膜瘤3例。其中Ⅰ～Ⅱ級(jí)26例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)22例。腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)前均未進(jìn)行放、化療等前期治療，可排除前期治療干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另取10例因腦外傷手術(shù)患者的壞死腦組織及對(duì)應(yīng)血漿標(biāo)本和10例健康者血漿標(biāo)本作為對(duì)照組，其中男13例，女7例，年齡20～67歲，中位年齡為45歲。腦組織及血

漿標(biāo)本提取后快速轉(zhuǎn)放入－80℃冰箱中冷凍備用。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本DNA提取和DNA濃度、純度測(cè)定 ①

取癌組織標(biāo)本10 mg移至加入冰水浴預(yù)冷的研缽中，快速充分研磨成勻漿；血漿標(biāo)本取樣200 μl；②使用AxyPrep基因組DNA試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)按步驟提取標(biāo)本DNA并檢測(cè)提取的DNA濃度和純度；③將提取癌組織及對(duì)應(yīng)血漿標(biāo)本的DNA標(biāo)號(hào)后移至－20℃冰箱保存。

1.2.2 基因組樣本的亞硫酸氫鈉處理 ①準(zhǔn)備DNA樣品，總體積為20 μl，總量約500 ng（以200～500 ng最佳）；②采用MethylCodeTMBisulfite Conversion Kit試劑盒，按使用說(shuō)明進(jìn)行亞硫酸鹽修飾；③將修飾后的DNA轉(zhuǎn)入1.5 ml的離心管中進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.3修飾后DNA樣本PCR擴(kuò)增 p16基因甲基化和非甲基化引物由上海Invitrogen公司設(shè)計(jì)（甲基化的引物F：5′-TCGTCGTTGTGGTTTTCGTG-3′，R：5′-AAACCTCCACCGACGATTATCT-3′；非甲基化的引物F：5′-GGGGTGTTTGTTGTTGTGGT-3′，R：5′-ATCTCCTCCTCCTCCTAACCTA-3′）。PCR反應(yīng)體系為25 μl（Buffer 2.5 μl＋Mg 1 μl＋F1／R1 1 μl＋10 mmol／L dNTP 0.5 μl＋Bisulfite）處理的DNA 1.0 μl＋DNA聚合酶0.2 μl＋ddH2O 19 μl。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性300 s，95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)35周期，72℃延伸300 s后終止擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的目的產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4PCR產(chǎn)物TA克隆測(cè)序 步驟一：提取標(biāo)本DNA，亞硫酸氫鈉處理，PCR步驟如前。其中引物由上海Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成（p16基因引物F：5′-TTGTYGAGTTYGGTTTTGG-3′，R：5′-CCTCAATT TCCCACRATTAAAA-3′）；步驟二：連接，配制體積為5 μl的反應(yīng)液（PCR產(chǎn)物2 μl＋pMD18-T Vector 0.5 μl＋SolutionⅠ2.5 μl），將配制的溶液混勻，放置16℃中連接30 min以上；步驟三：轉(zhuǎn)化，取出1管凍存的DH5α（200 μl／管）感受態(tài)細(xì)胞，冰塊中溶解；取5 μl連接產(chǎn)物加入菌液中，輕柔搖勻，冰水浴30 min，42℃熱激90 s，再冰浴2 min；加至500 μl無(wú)抗性LB培養(yǎng)基并在搖床中37℃200 r／min培養(yǎng)45 min；超凈臺(tái)中取200 μl預(yù)轉(zhuǎn)化的菌液涂抹至含100 μg／ml氨芐的平板上；將平板放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過(guò)夜，直至克隆完成；步驟四：從平板上挑取多個(gè)克隆產(chǎn)物測(cè)序（測(cè)序工作由上海英駿生物技術(shù)公司完成）。依照測(cè)序結(jié)果，可以判斷目的產(chǎn)物中是否發(fā)生甲基化現(xiàn)象。若未發(fā)生甲基化現(xiàn)象，基因序列中胞嘧啶經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾等實(shí)驗(yàn)處理后會(huì)變成胸腺嘧啶；若發(fā)生甲基化現(xiàn)象，基因序列中胞嘧啶則保持不變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0軟件分析，數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 癌組織及相應(yīng)血標(biāo)本的甲基化實(shí)驗(yàn)組中癌組織及血漿標(biāo)本檢測(cè)p16基因甲基化的概率分別為43.8%（21／48）、37.5%（18／48），對(duì)照組均未檢測(cè)出p16基因的甲基化。見(jiàn)圖1、2。

2.2 p16基因甲基化與臨床參數(shù)相關(guān)性腦膠質(zhì)瘤患者癌組織及對(duì)應(yīng)血漿標(biāo)本中p16基因甲基化的發(fā)生率與患者的性別、年齡、腫瘤類型、病理分級(jí)之間相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明p16基因甲基化現(xiàn)象與臨床資料相關(guān)性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

3 討論

表1 p16基因甲基化與臨床病理特征關(guān)系（n）

隨著腫瘤表觀遺傳學(xué)的研究進(jìn)展，抑癌基因的甲基化是腫瘤發(fā)生發(fā)展中一個(gè)重要的分子事件。王喆等［2］發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤中發(fā)生p16甲基化率為42.5%（17／40），表明p16基因甲基化的發(fā)生率隨腦膠質(zhì)瘤惡性程度增加而升高；本實(shí)驗(yàn)中腦膠質(zhì)瘤組織的p16基因甲基化率為43.8%（21／48），與研究［2］結(jié)果一致。由此推斷p16基因可能是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中一個(gè)重要事件，但本實(shí)驗(yàn)并未表明p16基因甲基化與病理分級(jí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)中存在病理診斷為Ⅱ～Ⅲ級(jí)的標(biāo)本，按高級(jí)別處理，可能是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一個(gè)原因。擬下一步擴(kuò)大樣本繼續(xù)研究，并以跨高、低級(jí)別的腫瘤作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

國(guó)外學(xué)者［3－4］發(fā)現(xiàn)血漿／血清中有大量游離的DNA存在，而腫瘤患者中更甚，結(jié)果證實(shí)了血液檢測(cè)可能成為診斷腫瘤的有力輔助。另外，血標(biāo)本具有采集方便、微創(chuàng)、價(jià)格便宜、適合大片人群普篩等優(yōu)點(diǎn)，因此，研究血液標(biāo)本的DNA甲基化是有意義的。研究［5］顯示膠質(zhì)瘤患者的血清中發(fā)生p16基因甲基化率為75%（9／12），并推斷血清檢測(cè)有成為膠質(zhì)瘤分子檢測(cè)的潛能。本實(shí)驗(yàn)表明血漿標(biāo)本中p16甲基化率為37.5%（18／48），對(duì)照組中并未發(fā)現(xiàn)p16基因的甲基化，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可以推斷出以血漿標(biāo)本為檢測(cè)物也同樣發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)與p16基因甲基化存在一定的聯(lián)系，為腦膠質(zhì)瘤的無(wú)創(chuàng)性檢查診斷開(kāi)拓了新思路。

研究［6］表明血漿與癌組織標(biāo)本中p16基因甲基化檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩標(biāo)本檢測(cè)的結(jié)果的確具有關(guān)聯(lián)。張振興等［7］也得出類似的結(jié)論。本研究顯示血漿標(biāo)本與癌組織的p16基因甲基化率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此推斷腦膠質(zhì)瘤中p16基因甲基化檢測(cè)，血漿標(biāo)本與癌組織有著密切的聯(lián)系，兩者呈平行相關(guān)，但兩者并非一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系。分析原因一：可能與血漿中DNA檢測(cè)甲基化的靈敏度較低于癌組織或是血漿中腫瘤DNA含量少有關(guān)。圖1電泳圖顯示癌組織的電泳條帶比血漿標(biāo)本中的條帶亮可以反映這點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用的兩種方法檢測(cè)DNA甲基化，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，但無(wú)法排出血漿中其他非腫瘤DNA的干擾。原因二：具體腫瘤類型可能存在差異性，具有的不同的分子生物學(xué)特征也可能導(dǎo)致這樣實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可擴(kuò)大樣本，針對(duì)具體腫瘤類型進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤患者血漿中檢測(cè)p16基因甲基化與癌組織具有平行相關(guān)性，血漿檢測(cè)具有成為膠質(zhì)瘤早期診斷指標(biāo)之一的潛力，但血漿檢測(cè)仍有靈敏度較低、部分結(jié)果與癌組織檢測(cè)不一致等缺陷。

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p16 methylation in plasma and tumor tissue of patients with human brain glioma

Deng Pengcheng1，Xu Peikun1，Zhu Lixin2，et al（1Dept of Neurosurgery，2Central Lab，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

The plasma and cancer tissue of the 48 patients for glioma were selected as the experimental group.The necrotic brain tissue and plasma of the 10 patients with traumatic brain injuries were selected as the control group，and the plasma of the 10 healthy people was also selected as the control group.The p16 gene methylation was examinated in samples by methylation specific polymerase chain reaction（MSP）method and bisulfite sequencing after processing（BSP）method.The result shows that the rate of p16 gene methylation in tumor tissues was 43.8%（21／48）and in gliomas，plasma was 37.5%（18／48）.The methylation phenomenon was not found in the control group.The study found that the p16 gene methylation was no significant correlation with clinical data.

glioma；methylation；p16；plasma；tumor tissue

R 739.41

1000－1492（2015）02－0253－03

2014－09－28接收

安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：1301042208）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1神經(jīng)外科、2中心實(shí)驗(yàn)室，合肥 230022

鄧鵬程，男，碩士研究生；徐培坤，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xpkayfy＠163.com