左 松， 伍時(shí)華， 張 健， 趙東玲， 粱發(fā)劍， 黃翠姬

（廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州545006）

外部因素對(duì)酒精酵母GJ2008果糖與葡萄糖酒精發(fā)酵的影響

左 松， 伍時(shí)華， 張 健， 趙東玲*， 粱發(fā)劍， 黃翠姬

（廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州545006）

在高體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫下，考察糖比例、微通氧和溫度等外部因素對(duì)果糖與葡萄糖利用及其差異性的影響，旨在為高濃度甘蔗汁發(fā)酵生產(chǎn)酒精提供參考和依據(jù)。用YPDF培養(yǎng)基模擬甘蔗汁，調(diào)節(jié)乙醇體積分?jǐn)?shù)為11.2%，初始酵母數(shù)為1.40×108個(gè)/mL進(jìn)行酒精發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中果糖與葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并采用曲線下面積法對(duì)果糖與葡萄糖代謝曲線進(jìn)行分析。在高體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫條件下，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)占初總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%及以上時(shí)，果糖代謝會(huì)嚴(yán)重地受到葡萄糖的代謝阻遏；微通氧可有效地縮小發(fā)酵后期果糖/葡萄糖利用差異性，提高乙醇產(chǎn)率61.70%；較低溫度明顯有利于發(fā)酵后期酵母數(shù)的維持；相比外源乙醇，糖的代謝更易受到內(nèi)源乙醇的影響。酒精酵母GJ2008對(duì)葡萄糖有一定偏好性，然而此種偏好性不會(huì)受到外部因素的影響。對(duì)高體積分?jǐn)?shù)甘蔗汁酒精發(fā)酵而言，發(fā)酵后期需保證微通氧和較低溫環(huán)境，并應(yīng)盡可能減少發(fā)酵后期葡萄糖的含量，從而去除葡萄糖對(duì)果糖的代謝調(diào)控作用。

糖比例；果糖；葡萄糖；微通氧；酒精發(fā)酵

甘蔗汁主要含糖為蔗糖，酒精發(fā)酵過(guò)程中，1分子蔗糖水解為1分子果糖和1分子葡萄糖，果糖和葡萄糖共用一套膜運(yùn)輸和酶催化體系[1]，但葡萄糖對(duì)膜運(yùn)輸和酶的親和力均大于果糖，因而酵母往往優(yōu)先利用葡萄糖，使得果糖成為發(fā)酵后期主要?dú)執(zhí)?，此時(shí)發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)缺乏和乙醇濃度高更使得果糖代謝緩慢甚至停滯（此種現(xiàn)象被定義為果糖/葡萄糖利用差異性）。在以蔗糖為基質(zhì)的高濃度酒精發(fā)酵過(guò)程中均不可避免地遇到上述問(wèn)題，但并沒(méi)有引起足夠的重視，主要是由于蔗糖的水解過(guò)程限制了果糖/葡萄糖利用差異性的研究（葡萄汁中含有幾乎等量果糖和葡萄糖，其果糖/葡萄糖利用差異性的研究被廣泛開(kāi)展）。

目前，甘蔗汁酒精發(fā)酵過(guò)程中蔗糖的消耗已得到了初步研究[2-3]，普遍表明在發(fā)酵過(guò)程中隨著蔗糖的水解，果糖積累的速度要明顯高于葡萄糖，但無(wú)法證明是否為葡萄糖對(duì)果糖的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用導(dǎo)致了酵母對(duì)果糖的消耗速率降低。為了消除葡萄糖的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用對(duì)果糖消耗的影響，進(jìn)行了高濃度果糖或葡萄糖單糖酒精發(fā)酵 （糖質(zhì)量濃度≥250 g/L），發(fā)酵至后期，果糖消耗速率明顯低于葡萄糖消耗速率，說(shuō)明果糖/葡萄糖利用差異性在逐步拉大，分析認(rèn)為可能是由于高濃度乙醇造成了上述現(xiàn)象的產(chǎn)生。作者采取“模擬高濃度甘蔗汁酒精發(fā)酵后期”的方法，以果糖、葡萄糖和果糖與葡萄糖為底物進(jìn)行單糖和混合糖酒精發(fā)酵，研究過(guò)程中果糖與葡萄糖消耗及果糖/葡萄糖利用差異性受糖比例、微通氧和溫度等的影響，以期解釋清楚上述現(xiàn)象，并為高濃度甘蔗汁酒精發(fā)酵工業(yè)提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

酒精酵母GJ2008（Saccharomyces cerevisiae），為甘蔗汁酒精發(fā)酵高產(chǎn)菌株，由廣西科技大學(xué)發(fā)酵工程研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基

斜面活化培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/ L，酵母浸膏10 g/L，瓊脂20 g/L。一級(jí)種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸膏10 g/L，自然pH。二級(jí)種子培養(yǎng)基：葡萄糖100 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸膏10 g/L，自然pH。YEP溶液：蛋白胨400 g/L，酵母浸膏200 g/L。以上培養(yǎng)基和溶液均在115℃下高壓蒸汽滅菌30 min。

YPDF培養(yǎng)基1：無(wú)菌水配制乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為12%，取180 mL加入500 mL錐形瓶中，后加入YEP溶液10 mL，設(shè)定果糖與葡萄糖質(zhì)量比分別為100∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4和0∶100，加入食品級(jí)果糖與葡萄糖調(diào)節(jié)總糖質(zhì)量濃度為（83.28±2.32）g/L。

YPDF培養(yǎng)基2：無(wú)菌水配制乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為12%，取180 mL加入500 mL錐形瓶中，后加入YEP溶液10 mL，設(shè)定果糖與葡萄糖質(zhì)量比為1∶1，加入食品級(jí)果糖與葡萄糖調(diào)節(jié)總糖質(zhì)量濃度為（81.40±0.70）g/L。

YPDF培養(yǎng)基3：無(wú)菌水配制乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為12%，取180 mL加入500 mL錐形瓶中，后加入YEP溶液10 mL，加入食品級(jí)果糖或葡萄糖調(diào)節(jié)總糖質(zhì)量濃度為（85.85±2.39）g/L。

YPDF培養(yǎng)基4：蒸餾水配制果糖或葡萄糖溶液300 g/L，取190 mL加入500 mL錐形瓶中，后加入YEP溶液10 mL，實(shí)際果糖或葡萄糖質(zhì)量濃度為（294.90±11.04）g/L。

1.3 發(fā)酵方法

將實(shí)驗(yàn)室保存菌種接至斜面活化培養(yǎng)基上，30℃條件活化培養(yǎng)1～2 d，待其斜面上長(zhǎng)出白色菌落，即菌種培養(yǎng)成熟。將已活化的斜面種子轉(zhuǎn)接至一級(jí)種子培養(yǎng)基中，32℃，搖床120 r/min，培養(yǎng)12 h后10%接種量轉(zhuǎn)接至二級(jí)種子培養(yǎng)基中，32℃，搖床120 r/min，培養(yǎng)10 h后離心棄上清，濕酵母泥備用。

糖比例實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)方法：將濕酵母泥 （50%接種量）轉(zhuǎn)接至200 mL YPDF發(fā)酵培養(yǎng)基1中（500 mL錐形瓶）進(jìn)行果糖與葡萄糖混合發(fā)酵，初始酵母數(shù)為1.70×108左右，28℃，搖床120 r/min培養(yǎng)，每份2個(gè)平行，測(cè)定結(jié)果取平均值。發(fā)酵過(guò)程中每隔4 h取樣并測(cè)CO2失重，至CO2失重小于0.2 g時(shí)，即發(fā)酵結(jié)束。培養(yǎng)條件為非嚴(yán)格厭氧即微通氧，用透氣封口膜（16 cm×16 cm，透氣率85%）和牛皮紙包扎。

微通氧實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)方法：接種方法同上 （接入YPDF發(fā)酵培養(yǎng)基2中），初始酵母數(shù)為1.11×108左右，32℃，搖床120 r/min培養(yǎng)，每份2個(gè)平行，測(cè)定結(jié)果取平均值。取樣方法同上。培養(yǎng)條件為厭氧與微通氧對(duì)比，厭氧條件為發(fā)酵栓密封錐形瓶（發(fā)酵栓內(nèi)加入濃硫酸液封），瓶口塞上有取樣口；微通氧條件為透氣封口膜（16 cm×16 cm，透氣率85%）和牛皮紙包扎錐形瓶。

溫度實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)方法：接種方法同上（接入YPDF發(fā)酵培養(yǎng)基3中），初始酵母數(shù)為1.33×108左右，28、32、36℃，搖床120 r/min培養(yǎng)，每份2個(gè)平行，測(cè)定結(jié)果取平均值。取樣方法同上。培養(yǎng)條件為非嚴(yán)格厭氧即微通氧，用透氣封口膜（16 cm×16 cm，透氣率85%）和牛皮紙包扎。內(nèi)源乙醇實(shí)驗(yàn)接種方法同上（接入YPDF發(fā)酵培養(yǎng)基4中），發(fā)酵溫度為32℃，其余的同溫度實(shí)驗(yàn)。

1.4 分析方法

還原糖采用SGD-IV全自動(dòng)還原糖測(cè)定儀測(cè)定：標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖質(zhì)量濃度為10 g/L，發(fā)酵上清液稀釋至合適濃度進(jìn)樣分析；葡萄糖采用SBA-40C生物傳感分析儀測(cè)定：標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖質(zhì)量濃度1 g/L，發(fā)酵上清液稀釋至合適濃度進(jìn)樣分析，故果糖質(zhì)量濃度（g/L）=還原糖質(zhì)量濃度 （g/L）-葡萄糖質(zhì)量濃度（g/ L）。生物量的測(cè)定：取發(fā)酵液1 mL，12 000 r/min離心2 min，上清液-60℃冷凍（用以測(cè)糖質(zhì)量濃度和乙醇體積分?jǐn)?shù)），無(wú)菌水洗滌酵母泥并離心棄上清，酵母泥在80℃烘箱烘干至恒重。酒精度采用生物傳感分析儀SBA-40C測(cè)定：標(biāo)準(zhǔn)乙醇體積分?jǐn)?shù)0.075%，發(fā)酵上清液稀釋至合適濃度進(jìn)樣分析。

1.5 糖代謝曲線分析

采用“曲線下面積法”來(lái)評(píng)估外部因素對(duì)果糖與葡萄糖利用及其差異性的影響，此法為L(zhǎng)iccioli首次在葡萄汁（等量果糖與葡萄糖）發(fā)酵中提出[4]，果糖和葡萄糖的代謝曲線運(yùn)用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行繪制，并分別獲得果糖與葡萄糖代謝曲線下面積（Area under the fermentation curve/AUC），記做果糖AUC和葡萄糖AUC（AUC越小，表明糖利用速率越快）。

2 結(jié)果和討論

2.1 糖比例對(duì)果糖與葡萄糖酒精發(fā)酵的影響

2.1.1 糖比例對(duì)糖代謝的影響 在高體積分?jǐn)?shù)乙醇和不同糖比例條件下，酵母GJ2008果糖和葡萄糖代謝曲線見(jiàn)圖1，隨著培養(yǎng)基中葡萄糖比例的提高，發(fā)酵初期，酵母GJ2008對(duì)果糖的利用逐步變慢，至葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總糖3/5時(shí)，果糖利用完全停滯，表明葡萄糖的存在嚴(yán)重地影響了果糖的代謝。分析如下，在培養(yǎng)基中果糖比例由1/5提高至3/ 5時(shí)，果糖運(yùn)輸?shù)臋C(jī)會(huì)增加，但果糖利用沒(méi)有明顯加快，在培養(yǎng)基中果糖比例由3/5提高至4/5～5/5時(shí)，果糖運(yùn)輸?shù)臋C(jī)會(huì)再次增加，果糖利用加快。酵母GJ2008在0～4 h發(fā)酵時(shí)間段內(nèi)消耗的總糖基本相同，說(shuō)明在這段時(shí)間內(nèi)，酵母代謝所需糖的量是一定的，當(dāng)葡萄糖的量可以滿足酵母發(fā)酵時(shí)，酵母對(duì)果糖幾乎不利用，當(dāng)葡萄糖的量不能滿足酵母發(fā)酵時(shí)，饑餓的酵母不得不利用無(wú)偏好性的果糖。從目前掌握的信息來(lái)看，等濃度果糖或葡萄糖單糖發(fā)酵，無(wú)論是正常發(fā)酵，還是高體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫下發(fā)酵，發(fā)酵初期果糖與葡萄糖消耗速率相當(dāng)，因此上述現(xiàn)象的產(chǎn)生只能歸因與一定比例的葡萄糖存在代謝調(diào)控機(jī)制，證實(shí)了Liccioli的說(shuō)法[4]（混合發(fā)酵時(shí)葡萄糖代謝調(diào)控作用很大程度上影響了果糖的代謝）。從表1可知，在不同糖比例條件下，葡萄糖AUC總是小于對(duì)應(yīng)的果糖AUC，而且總糖中葡萄糖比例越高時(shí)，果糖AUC與葡萄糖AUC之和越小，表明酵母GJ2008對(duì)葡萄糖有一定的偏好性，且此種偏好性不會(huì)受到果糖與葡萄糖比例的影響。

另一方面，乙醇會(huì)影響果糖/葡萄糖利用差異性，Berthels指出，乙醇對(duì)果糖或葡萄糖的膜運(yùn)輸?shù)鞍椎淖饔貌煌瑥亩町愋缘赜绊懥似渑c果糖和葡萄糖的親和性[5]，但作者研究表明，全果糖或全葡萄糖發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵初期，果糖與葡萄糖的利用并不存在差異性，反而是發(fā)酵后期，果糖/葡萄糖利用差異性逐漸拉大，表明除了酵母本身偏好葡萄糖的內(nèi)在特性外，發(fā)酵過(guò)程中酵母所產(chǎn)生的內(nèi)源乙醇更可能是導(dǎo)致后期果糖/葡萄糖利用差異性拉大的原因。

圖1 不同糖質(zhì)量比條件下酵母GJ2008果糖與葡萄糖消耗曲線Fig.1 Profiles of fructose and glucose concentrations during theethanolfermentation from YPDF media by S.cerevisiae GJ2008 atthe sugar concentration of 80g/L with different hexose ratios

2.1.2 糖比例對(duì)細(xì)胞生成和CO2生成的影響 在不同糖質(zhì)量比條件下，酵母GJ2008果糖與葡萄糖發(fā)酵時(shí)，酵母干重和CO2生成曲線見(jiàn)圖2，隨著總糖中果糖比例的增加，最終發(fā)酵所得酵母干重和CO2生成量均逐漸略微提高，表明果糖發(fā)酵乙醇具有一定的潛力，雖然其糖利用完全時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)。

表1 不同糖質(zhì)量比條件下酵母GJ2008果糖與葡萄糖代謝曲線下面積Table 1 Area under the metaboliccurves for fructose and glucose fermentations by S.cerevisiae GJ2008 of media at the sugar concentration of 80g/L with different hexose ratios

圖2 不同糖質(zhì)量比條件下酵母GJ2008果糖與葡萄糖混合發(fā)酵細(xì)胞生成和CO2生成曲線Fig.2 Profiles of biomass production and CO2accumulation during the ethanol fermentation from YPDF media by S.cerevisiae GJ2008 at the sugar concentration of 80 g/L with different hexose ratios

2.2 微通氧對(duì)果糖與葡萄糖酒精發(fā)酵的影響

2.2.1 微通氧對(duì)糖代謝的影響 在高體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫下，酵母GJ2008果糖和葡萄糖代謝曲線見(jiàn)圖3。厭氧與微通氧條件下，發(fā)酵0～8 h，果糖與葡萄糖代謝曲線幾乎重合，這一現(xiàn)象的出現(xiàn)應(yīng)該是由于發(fā)酵初期錐形瓶?jī)?nèi)有一定的氧氣（即兩種培養(yǎng)條件下發(fā)酵初期內(nèi)環(huán)境幾乎沒(méi)有差別），造成發(fā)酵初期糖代謝曲線重合；當(dāng)發(fā)酵至12 h，發(fā)酵栓所包扎的錐形瓶?jī)?nèi)部氧氣被酵母消耗殆盡，故兩種培養(yǎng)條件下果糖與葡萄糖利用曲線開(kāi)始逐步拉開(kāi)，并且后期果糖曲線拉開(kāi)程度明顯大于葡萄糖。發(fā)酵8～12 h，果糖利用明顯停滯，這一現(xiàn)象的出現(xiàn)應(yīng)該與葡萄糖代謝調(diào)控有關(guān)（見(jiàn)2.1論述部分）。發(fā)酵12～16 h，果糖利用又開(kāi)始加快，分析認(rèn)為葡萄糖代謝阻遏效應(yīng)是有條件的，后期總糖含量不能滿足酵母代謝所需，葡萄糖代謝阻遏效應(yīng)減弱，故果糖代謝加快。

另一方面，厭氧與微通氧條件下，葡萄糖AUC總是小于對(duì)應(yīng)的果糖AUC（表2），而且微通氧條件下，葡萄糖AUC或果糖AUC均明顯小于厭氧條件下的，表明在高體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫下，酵母GJ2008對(duì)葡萄糖有明顯的偏好性，且此種偏好性不會(huì)受到氧氣條件的影響。

圖3 厭氧與微通氧條件下酵母GJ2008果糖與葡萄糖消耗曲線Fig.3 Profiles of fructose and glucose concentrations during theethanolfermentation from YPDF media by S.cerevisiae GJ2008 under anaerobic and micro-aeration conditions

表2 厭氧與微通氧條件下酵母GJ2008果糖與葡萄糖代謝曲線下面積Table 2 Area under the metabolic curves for fructose and glucose fermentations by S.cerevisiae GJ2008 of media under anaerobic and micro-aeration conditions

2.2.2 微通氧對(duì)細(xì)胞生成和CO2生成的影響 在厭氧與微通氧條件下，酵母GJ2008果糖與葡萄糖混合發(fā)酵時(shí)，酵母干重和CO2生成曲線見(jiàn)圖4。發(fā)酵前期，兩種培養(yǎng)條件下干重或CO2累積差值較小，與糖代謝曲線對(duì)應(yīng)（圖3）；發(fā)酵至后期，兩種培養(yǎng)條件下干重或CO2累積差值逐漸拉大，結(jié)果厭氧條件下所產(chǎn)生物量要明顯高于微通氧條件下的，但前者CO2累積速率明顯低于后者，表明在微通氧條件下，其細(xì)胞增殖略慢，但發(fā)酵速率較快。

在高體積分?jǐn)?shù)乙醇條件下，酵母的發(fā)酵活力會(huì)受到影響，其影響的程度與酵母菌的耐乙醇性能相關(guān)[6]。Damore等[7]指出酵母菌的耐乙醇性能與類固醇和不飽和脂肪酸等密切相關(guān)，特別是不飽和脂肪酸，其作用為能增加細(xì)胞膜流動(dòng)性，使細(xì)胞膜緊湊，會(huì)明顯改善酵母的耐乙醇性能。在厭氧條件下，類固醇和不飽和脂肪酸不能得到合成[8]，從而酵母的耐乙醇性能會(huì)受到影響，導(dǎo)致酵母的發(fā)酵活力不能得到有效維持，因此厭氧條件下發(fā)酵較為緩慢。

2.3 溫度對(duì)果糖或葡萄糖單糖酒精發(fā)酵的影響

不同溫度下，酵母GJ2008果糖與葡萄糖單糖發(fā)酵時(shí)，酵母干重和CO2生成曲線見(jiàn)圖5。從圖5（a）～（d）可以看出，發(fā)酵初期，不同溫度下干重或CO2累積差值均較小，與糖代謝曲線對(duì)應(yīng)（溫度對(duì)糖代謝的影響不明顯，故未給出）；發(fā)酵至后期，不同溫度下酵母數(shù)維持值逐漸拉大，表現(xiàn)為低溫條件下所產(chǎn)生物量要明顯高于高溫條件下的，但后者發(fā)酵過(guò)程中CO2累積要略快于前者，表明低溫發(fā)酵有利于酵母數(shù)的維持，但發(fā)酵速率略慢。需要指出的是，在28℃時(shí)，果糖所產(chǎn)生物量比葡萄糖所產(chǎn)生物量高出4.76%，而在32～36℃時(shí)，果糖所產(chǎn)生物量與葡萄糖所產(chǎn)的生物量相等，表明在28℃，以果糖進(jìn)行高濃度酒精發(fā)酵可獲得最多酵母數(shù)。對(duì)于高濃度甘蔗汁酒精發(fā)酵而言，發(fā)酵至后期，發(fā)酵液中主要?dú)執(zhí)菫楣?，因此可根?jù)此信息調(diào)整發(fā)酵溫度。

圖4 厭氧與微通氧條件下酵母GJ2008果糖與葡萄糖混合發(fā)酵細(xì)胞生成和CO2生成曲線Fig.4 Profiles of biomass production and CO2accumulation during the ethanol fermentation from YPDF media by S.cerevisiae GJ2008 under anaerobic and micro-aeration conditions

圖5 不同溫度下酵母GJ2008果糖與葡萄糖混合發(fā)酵細(xì)胞生成和CO2生成曲線Fig.5 Profiles of biomass production and CO2accumulation during the ethanol fermentation from YPF and YPD media by S.cerevisiae GJ2008 at different temperature ranging from 28～36℃ （A-biomass from fructose，B-biomass from glucose，C-CO2release from fructose and D-CO2release from glucose）

2.4 不同條件下最終發(fā)酵結(jié)果

不同糖比例條件下發(fā)酵結(jié)果表明（表4），隨著果糖比例在培養(yǎng)基中的提高，最終乙醇產(chǎn)率和發(fā)酵效率均隨之提高（質(zhì)量比為4∶1組例外），表明果糖用于產(chǎn)乙醇具有一定的優(yōu)勢(shì)；厭氧與微通氧條件下發(fā)酵表明，無(wú)論是乙醇產(chǎn)率還是發(fā)酵效率，前者均明顯低于后者，表明微通氧對(duì)高濃度酒精發(fā)酵至關(guān)重要，是高濃度酒精發(fā)酵必不可少的因素之一。不同溫度下，果糖或葡萄糖發(fā)酵結(jié)果表明，溫度對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響并不顯著（結(jié)果未給出），但結(jié)合圖5可知，較低溫度明顯有利于發(fā)酵后期酵母數(shù)的維持。對(duì)酒精發(fā)酵工業(yè)而言，酵母泥可作為飼料出售，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，故高體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫下，發(fā)酵后期最適發(fā)酵溫度為28℃。

表4 不同條件下酒精酵母GJ2008甘蔗汁酒精發(fā)酵參數(shù)Table 4 Performances of S.cerevisiae GJ2008 in YPDF medium under different culture conditions

2.5 高質(zhì)量濃度果糖或葡萄糖單糖酒精發(fā)酵

2.1 中指出，發(fā)酵過(guò)程中酵母所產(chǎn)生的內(nèi)源乙醇更可能是導(dǎo)致后期果糖/葡萄糖利用差異性拉大的原因，為了證實(shí)上述設(shè)想，故配制高質(zhì)量濃度果糖或葡萄糖進(jìn)行單糖酒精發(fā)酵 （50%接種量去除底物抑制作用），對(duì)比外源乙醇與內(nèi)源乙醇對(duì)果糖/葡萄糖利用差異性的影響。

運(yùn)用軟件Origin 8.0擬合出高質(zhì)量濃度果糖和葡萄糖發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)分別為15.1、13.5 h，此時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為10.68%和9.97%（由CO2失重?cái)M合得出），與2.1中外源乙醇體積分?jǐn)?shù)（11.20%）接近，果糖和葡萄糖質(zhì)量濃度分別為87.8和86.6 g/L（與外源乙醇組的初糖質(zhì)量濃度相等）。內(nèi)源乙醇與外源乙醇發(fā)酵對(duì)比（圖6），表明比糖代謝速率更易受到內(nèi)源乙醇的影響。另一方面，比果糖代謝速率與比葡萄糖代謝速率受內(nèi)源乙醇的影響相比，并無(wú)差異，否定了2.1中的猜想即“發(fā)酵過(guò)程中酵母所產(chǎn)生的內(nèi)源乙醇更可能是導(dǎo)致后期果糖/葡萄糖利用差異性拉大的原因”，而發(fā)酵過(guò)程中酵母的活性強(qiáng)弱似乎與這一差異性有關(guān)，即活性稍弱的酵母其果糖利用性能要遜于葡萄糖。

圖6 內(nèi)源乙醇與外源乙醇下酵母GJ2008比果糖與葡萄糖消耗速率曲線Fig.6 Profiles of specific sugar consumption rates during the ethanol fermentation from YPF or YPD media by S.cerevisiaeGJ2008 underendogenousand exogenous ethanol

3 結(jié)語(yǔ)

在高體積分?jǐn)?shù)乙醇下，糖比例、微通氧和溫度等外部因素對(duì)果糖與葡萄糖酒精發(fā)酵的影響表明，葡萄糖含量占初總糖40%及以上時(shí)，果糖代謝會(huì)嚴(yán)重地受到葡萄糖的代謝阻遏；微通氧可有效地縮小發(fā)酵后期果糖/葡萄糖利用差異性，提高乙醇產(chǎn)率61.70%；較低溫度明顯有利于發(fā)酵后期酵母數(shù)的維持；相比外源乙醇，糖的代謝更易受到內(nèi)源乙醇的影響；酒精酵母GJ2008對(duì)葡萄糖有一定偏好性，然而此種偏好性不會(huì)受到外部因素的影響。

因此，對(duì)高濃度甘蔗汁酒精發(fā)酵而言，發(fā)酵后期需保證微通氧和較低溫環(huán)境，并應(yīng)采取相應(yīng)措施如定向進(jìn)化策略或膜運(yùn)輸?shù)鞍谆騂XT的改變以加快發(fā)酵前期葡萄糖的利用，減少發(fā)酵后期葡萄糖的含量，從而緩解或消除發(fā)酵后期葡萄糖對(duì)果糖的代謝調(diào)控作用，進(jìn)而縮短最終發(fā)酵時(shí)間和提高整體發(fā)酵性能。

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Influence of External Factors on Fructose and Glucose Fermentations by Saccharomyces cerevisiae GJ2008

ZUO Song， WU Shihua， ZHANG Jian， ZHAO Dongling*， LIANG Fajian， HUANG Cuiji
（School of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China）

The external factors affecting the differences between fructose and glucose consumptions and fermentations under high concentrations of ethanol were investigated by the effects of hexose ratio，micro-aeration and temperature to provide basis for the alcoholic fermentation of high gravity sugarcane juice.Sugarcane juice was simulated using YPDF medium and fermented under ethanol concentration of 11.2% （v/v）and with an initial yeast number of 1.40×108cells/mL.The concentrations of fructose and glucose in the process of fermentation were determined by HPLC. Metabolic curves of fructose and glucose fermentation were analyzed and fitted by the area under the curve （AUC）method.The fructose metabolism was seriously impeded by the glucose metabolismunder high concentrations of ethanol if the initial glucose was more than 40%of total sugar. Micro-aeration could effectively reduce the differences between fructose and glucose consumptions during the late stages of the fermentation，and the ethanol productivity was raised by 61.70%.Low temperature was apparently favorable to maintain the final biomass，while sugar metabolism was susceptible to the endogenous ethanol rather than the exogenous ethanol.In addition，there was a preference to glucose for S.cerevisiae GJ2008，however，the preference was not affected by the environmental factors.For the alcoholic fermentation of high gravity sugarcane juice，it is recommended to maintain a micro-aeration and a low temperature condition during the late stages of the fermentation，in which stages the glucose concentration should be well reduced to remove its metabolic repression to fructose.

hexose ratio，fructose，glucose，micro-aeration，ethanol fermentation

Q 815

A

1673—1689（2015）07—0764—08

2014-06-11

廣西科技攻關(guān)項(xiàng)目（桂科攻0782003-2）；廣西科技大學(xué)科學(xué)基金（?？谱?307105）。

*通信作者：趙東玲（1965-），男，湖南衡陽(yáng)人，工程師，主要從事微生物發(fā)酵研究。E-mail：dlzhao168@126.com