諶 平 何成宜 陳志英

(中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院基因與細(xì)胞工程研究室 深圳 518055)

合成免疫策略治療慢性乙肝病毒感染綜述

諶 平 何成宜 陳志英

(中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院基因與細(xì)胞工程研究室 深圳 518055)

慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染可誘發(fā)肝硬化與肝癌，是危害人類(lèi)健康的重大疾病?；趯?duì) HBV 感染持續(xù)不愈主要是機(jī)體免疫功能缺陷所致的認(rèn)識(shí)，提出用“合成免疫”策略重建抗 HBV 免疫功能，消除感染以預(yù)防致命病變的發(fā)生。用優(yōu)化的基因治療載體微環(huán) DNA，在體內(nèi)表達(dá)一套工程抗體，模擬急性 HBV感染康復(fù)時(shí)機(jī)體的免疫反應(yīng)，由單克隆抗體中和病毒，雙靶向抗體將非特異的 T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為抗 HBV 的 T 淋巴細(xì)胞，殺死 HBV 感染的肝細(xì)胞，兩者協(xié)同達(dá)到根治慢性 HBV 感染的目的。微環(huán) DNA 安全、經(jīng)濟(jì)，可建立一個(gè)安全、高效、可負(fù)擔(dān)的抗 HBV 免疫體系，有效消除 HBV 的危害。

乙肝病毒；慢性 HBV 感染；合成免疫；微環(huán) DNA；過(guò)繼免疫

1 引 言

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。中國(guó)有 1 億左右、全球有超過(guò) 3 億慢性 HBV 感染患者(Chronic Hepatitis B virus carrier，CHB)，每年導(dǎo)致超過(guò) 60 萬(wàn)人死于原發(fā)性肝癌和肝硬化[1]。多數(shù)肝癌和肝硬化的發(fā)生，是由于 HBV 感染誘發(fā)肝臟持久炎癥與肝細(xì)胞反復(fù)死亡增生所致，清除病毒可有效防止肝癌和肝硬化的發(fā)生。目前還缺乏經(jīng)濟(jì)、方便的治療方法來(lái)有效消除 HBV 的危害。雖然現(xiàn)有的核苷類(lèi)似物和干擾素治療能有效抑制 HBV 的復(fù)制，減輕或消除癥狀，但這些治療療效短暫，只有長(zhǎng)期接受治療，才能有效預(yù)防肝硬化及肝癌的發(fā)生。由于接受長(zhǎng)期治療的 HBV 攜帶者并不多，故這種治療對(duì)解除全球 HBV 威脅意義不大。世界衛(wèi)生組織最新官方統(tǒng)計(jì)表明，CHB 患者接受長(zhǎng)期抗 HBV 核苷類(lèi)似物治療的比例不超過(guò) 10%[2]。除了因?yàn)闆](méi)有明顯的癥狀，攜帶者不知道感染的存在而沒(méi)有接受治療外，開(kāi)始治療而中途放棄的比例很高。經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)不是一個(gè)主要因素，每天服藥造成的麻煩是主要的原因[2]?？?HBV 感染的治療性疫苗曾經(jīng)被寄以厚望，但多個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)效果不彰[3,4]。雖然疫苗能有效預(yù)防 HBV 感染，并已經(jīng)逐漸減少中國(guó) HBV 攜帶率，但是，由于原來(lái)慢性 HBV 攜帶者的基數(shù)非常龐大，接近一億之巨，加上疫苗覆蓋不全，在可以預(yù)見(jiàn)的未來(lái)，慢性 HBV 感染及引起的肝硬化和肝癌，仍然是中國(guó)和世界最重要的健康問(wèn)題。本文將系統(tǒng)陳述慢性 HBV 感染形成的機(jī)制以及目前的治療現(xiàn)狀，并提出合成免疫策略，作為根本解決 HBV 感染這個(gè)重大健康問(wèn)題的方案。

2 免疫系統(tǒng)的缺陷是 HBV 感染持續(xù)的關(guān)鍵

HBV 是一種典型的非致細(xì)胞病變病毒，病毒本身對(duì)肝細(xì)胞不會(huì)造成病理傷害。肝臟病變的發(fā)生，是由于機(jī)體的免疫系統(tǒng)清除病毒的過(guò)程，造成肝臟的炎癥反應(yīng)，包括肝細(xì)胞死亡，轉(zhuǎn)氨酶升高。有資料表明，在中國(guó)感染過(guò) HBV的總?cè)藬?shù)超過(guò) 6 億人，但大部分人的機(jī)體能產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，將病毒完全清除，并獲得終生免疫。其中，康復(fù)過(guò)程包括機(jī)體產(chǎn)生中和抗體滅活病毒，細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞(Cytotoxic Lymphocyte，CTL)殺滅帶毒的肝細(xì)胞，兩者協(xié)同達(dá)到根治的效果，且這種抗 HBV 免疫終生有效。但是，在從急性感染康復(fù)多年之后，用敏感的檢測(cè)方法仍可在肝臟中檢測(cè)到微量的cccDNA，血液中也可檢測(cè)到 HBV 病毒顆粒。這表明，康復(fù)不一定伴隨 HBV 全部消滅，而是建立起一個(gè)有效的免疫監(jiān)督機(jī)制，使殘留的cccDNA 不能大量復(fù)制造成復(fù)發(fā)。臨床上發(fā)現(xiàn)HBV 感染康復(fù)多年后，在機(jī)體的免疫系統(tǒng)受抑制如接受免疫抑制治療時(shí)，HBV 感染復(fù)發(fā)，與這個(gè)假說(shuō)相吻合。

多方面的證據(jù)表明，HBV 感染遷延不愈轉(zhuǎn)化為慢性的主要機(jī)制是宿主的免疫功能受損，對(duì) HBV 各種抗原產(chǎn)生不同程度的免疫耐受，不能像大多數(shù)成人那樣有效地清除 HBV[5]。慢性HBV 感染最多是母嬰傳播的結(jié)果，其次是兒童期感染，成年人感染轉(zhuǎn)為慢性者較少。 母嬰傳播包括妊娠期、分娩期間和哺乳期的感染。胎兒期通過(guò)胎盤(pán)途徑接觸病毒抗原，免疫系統(tǒng)可通過(guò)“陰性選擇”，將 HBV 特異性 T 細(xì)胞克隆清除，結(jié)果不論是胎兒期、分娩期或更遲才感染 HBV 病毒，感染都將持續(xù)[5,6]。新生兒通過(guò)母嬰傳播感染 HBV 病毒后，90% 以上會(huì)發(fā)展成為慢性感染，是為“新生兒免疫耐受”。3 歲以前的幼兒期，機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)育還不健全，也容易造成慢性感染[5,7]。而當(dāng)成人感染 HBV 時(shí)，超過(guò)90% 的人都能清除病毒得以痊愈，只有不到 5%的人群發(fā)展成為慢性感染。成人感染 HBV 的免疫耐受主要機(jī)制為個(gè)體免疫系統(tǒng)不健全，如 Th1/ Th2 細(xì)胞失衡、病毒特異性 CD8+T 細(xì)胞功能損傷、樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic Cell，DC)功能缺陷、調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞(Regulatory T Cell，Treg)增多、免疫抑制途徑異?；钴S等[5,8-10]。在對(duì) CHB 病程進(jìn)一步分析的基礎(chǔ)上，可把 CHB 分為免疫耐受期和免疫清除期[11]。在免疫耐受期病毒滴度可高達(dá)109～1010/mL，而肝臟不見(jiàn)任何炎癥反應(yīng)，血液也檢測(cè)不到標(biāo)志肝細(xì)胞損傷的轉(zhuǎn)氨酶異常，表明機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)病毒幾乎不產(chǎn)生任何反應(yīng)；免疫耐受期持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)短不一，可長(zhǎng)達(dá) 30 年以上；隨后，可進(jìn)入免疫清除期，表現(xiàn)為一次或多次的急性肝炎癥狀，HBV 病毒滴度下降，經(jīng)數(shù)次反彈之后，病毒滴度維持在較低水平，但肝臟嚴(yán)重?fù)p害導(dǎo)致纖維化與肝硬化；HBV 持續(xù)感染往往導(dǎo)致病毒突變株出現(xiàn)，可能是機(jī)體免疫選擇壓力的結(jié)果[11]。CHB 徹底持久清除 HBV，像急性HBV 感染后康復(fù)者很少見(jiàn)。

在急性 HBV 感染時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫應(yīng)答，HBV 特異的細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞(CTL)是清除病毒的主要效應(yīng)細(xì)胞；抗體在預(yù)防 HBV 感染起關(guān)鍵作用，但在清除 HBV 感染過(guò)程中的作用較小。 用黑猩猩所做的 HBV 感染實(shí)驗(yàn)表明，用抗體耗盡血液中的 CD4+T 細(xì)胞，CD8+CTL 仍能有效清除病毒[12]，這突顯 CD8+CTL 細(xì)胞在該過(guò)程的重要作用。CTL 細(xì)胞主要通過(guò)肝細(xì)胞溶解途徑，清除病毒；此外，還可通過(guò)促進(jìn)病毒基因組降解的非細(xì)胞溶解機(jī)制清除病毒[13]。相比之下，慢性 HBV 感染時(shí)，CTL 免疫應(yīng)答要弱得多，無(wú)法有效清除病毒感染。有研究表明，在慢性感染患者，特別是病毒 DNA 載量高者，其外周血中難以檢測(cè)到 HBV 特異的 CTL[14]。

3 重建抗 HBV 免疫可治療慢性 HBV 感染

3.1 骨髓移植

多方面的證據(jù)表明， 通過(guò)移植抗 HBV 獲得性免疫的方法，可以清除 HBV，并建立持久的抗 HBV 免疫機(jī)制。有多個(gè)報(bào)道表明，合并慢性 HBV 感染患者通過(guò)骨髓移植，在重建造血和免疫系統(tǒng)的同時(shí)，體內(nèi)的 HBV 也被清除[15]，提示捐贈(zèng)者的骨髓為受捐者提供了抗 HBV 免疫機(jī)制。Lau 等[15]報(bào)道的 21 例接收骨髓移植的合并HBV 感染的淋巴瘤患者中，5 例接受了抗-HBs/抗-HBc 陽(yáng)性的骨髓移植，有 2 例(40%)產(chǎn)生持續(xù)的 HBsAg 血清學(xué)陰轉(zhuǎn)；而其余 16 例接受抗-HBs 陰性供體骨髓移植的患者，無(wú)人發(fā)生陰轉(zhuǎn)。詳細(xì)分析接受移植者體內(nèi) T 淋巴細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)：抗 HBV 特異性 T 細(xì)胞來(lái)源于骨髓供體；而抗-HBs 陰性供體體內(nèi)缺乏抗 HBV 特異性 T 細(xì)胞，故此，沒(méi)有一例發(fā)生 HBV 感染狀態(tài)的變化。這些令人信服的證據(jù)證明，供者抗 HBV 的免疫功能被轉(zhuǎn)移到受者體內(nèi)并產(chǎn)生治療效果[16,17]。還有研究表明，接受骨髓移植后的 HBsAg 陰轉(zhuǎn)率明顯高于自發(fā)的轉(zhuǎn)換率或應(yīng)用干擾素后的陰轉(zhuǎn)率[18]，進(jìn)一步支持該假說(shuō)。這些成功的個(gè)案，成為支持我們提出的合成免疫治療 CHB 的基礎(chǔ)。

盡管如此，骨髓移植治療慢性 HBV 感染技術(shù)沒(méi)有普遍用于臨床，除了費(fèi)用高昂的因素外，骨髓移植潛在的危險(xiǎn)是重要的限制。骨髓移植存在固有的免疫排斥反應(yīng)問(wèn)題，常常需要終生服用免疫抑制藥以控制排斥反應(yīng)；此外，慢性 HBV攜帶者在接受骨髓移植后，可能激活 HBV 大量復(fù)制，誘發(fā)肝炎甚至致命的重型肝炎[19,20]。

3.2 細(xì)胞治療

細(xì)胞治療指的是將外周血或臍帶血的單核細(xì)胞在體外用細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴(kuò)增后回輸?shù)襟w內(nèi)的治療方法。細(xì)胞療法有多種，如 CIK 細(xì)胞，DCCIK 細(xì)胞、DC 細(xì)胞等。有報(bào)道表明，細(xì)胞治療對(duì) HBV 感染有一定療效。

CIK 即細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，是一類(lèi)具有 T 細(xì)胞與自然殺傷細(xì)胞特性的免疫效應(yīng)細(xì)胞。其他免疫效應(yīng)細(xì)胞如 CTL，只能識(shí)別 MHC 遞呈的抗原，稱(chēng)為 MHC 依賴(lài)性免疫細(xì)胞。與此不同，CIK 細(xì)胞能在不依賴(lài) MHC 的情況下識(shí)別、殺死感染細(xì)胞或癌細(xì)胞，反應(yīng)迅速、精確，加上細(xì)胞毒力強(qiáng)、易于增殖等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于腫瘤免疫治療，也有用于治療 CHB 的嘗試。CIK 的作用機(jī)制還沒(méi)有完全了解，但已知該細(xì)胞通過(guò) NKG2D、DNAM-1 與 NKp30 等受體介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間直接接觸而發(fā)揮作用，腫瘤常常過(guò)表達(dá) NKG2D 而成為 CIK 細(xì)胞的靶標(biāo)。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CIK 與 HBsAg 共培養(yǎng)，可以增強(qiáng) CIK 細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷作用。Gao 等[21]對(duì) 14 名慢性乙肝患者用 CIK 治療 52 周后取得較好效果，其中有 6名(42.86%)患者肝功能恢復(fù)正常、血清 HBeAg 轉(zhuǎn)陰。CIK 細(xì)胞用于臨床治療 CHB 的報(bào)道尚少，如進(jìn)一步證實(shí)，可成為一個(gè)不錯(cuò)的治療選項(xiàng)。

DC-CIK 細(xì)胞是樹(shù)突狀細(xì)胞(DC 細(xì)胞)與 CIK細(xì)胞共培養(yǎng)的產(chǎn)物。 DC 細(xì)胞是體內(nèi)最重要的專(zhuān)業(yè)抗原遞呈細(xì)胞，將抗原加工后通過(guò) MHC 遞呈到細(xì)胞表面刺激初始 T 細(xì)胞增殖，是誘導(dǎo)機(jī)體獲得性免疫應(yīng)答必不可少的環(huán)節(jié)。如上所述，由DC 細(xì)胞介導(dǎo)產(chǎn)生 HBV 特異 CTL，是清除 HBV的主要機(jī)制[22]。大量證據(jù)表明，DC 細(xì)胞與屬于天然免疫的 CIK 細(xì)胞也有協(xié)同作用，導(dǎo)致 DCCIK 細(xì)胞毒性作用比 CIK 細(xì)胞更強(qiáng)，治療效果也更好[23]。

有證據(jù)表明，CHB 患者 T 細(xì)胞應(yīng)答不足，與 DC 功能缺陷導(dǎo)致抗原遞呈功能低下有關(guān)。與健康人相比，CHB 患者外周血中的 DC 細(xì)胞數(shù)量較少，DC 表面共刺激分子 CD80、CD86 及主要組織相容性復(fù)合體 Ⅱ 類(lèi)分子(MHC II)的表達(dá)顯著降低，輔助 HBV 特異性的 CD8+T 細(xì)胞應(yīng)答的能力降低，刺激 T 細(xì)胞增殖的能力也低于健康人[24-26]?；?DC 細(xì)胞在 HBV 細(xì)胞免疫中的重要作用，已經(jīng)有用誘導(dǎo)成熟的 DC 細(xì)胞作為過(guò)繼性免疫治療 CHB 的嘗試。Chen 等[27]用 HBsAg刺激的 DC 治療 19 例 CHB 患者，其中 10 名(52.6%)患者 HBeAg 轉(zhuǎn)陰，這一結(jié)果與干擾素的療效相當(dāng)。這一研究結(jié)果如經(jīng)過(guò)進(jìn)一步證實(shí)，將有臨床治療價(jià)值。

3.3 阻斷免疫抑制信號(hào)

機(jī)體不能對(duì) HBV 產(chǎn)生正常的免疫反應(yīng)，可能跟 CHB 患者的 T 細(xì)胞功能缺陷也有關(guān)系。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CHB 患者 HBV 特異的 CD8+T 細(xì)胞過(guò)度表達(dá)程序性死亡受體-1(Programmed Death Protein-1，PD-1)或程序性死亡配體-1(PD-1 Ligand，PD-L1)，造成 T 細(xì)胞功能低下。PD-1/ PD-L1 系統(tǒng)是 T 細(xì)胞功能負(fù)調(diào)控機(jī)制之一，正常水平的 PD-1/PD-L1 可將 T 細(xì)胞功能維持在適度水平；如表達(dá)不足，T 細(xì)胞的功能過(guò)高，可致自身免疫反應(yīng)；相反，表達(dá)過(guò)高，則可造成 T 細(xì)胞功能不足或缺失，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生或感染持續(xù)。實(shí)驗(yàn)證明，在 PD-1/PD-L1 過(guò)表達(dá)造成 T 細(xì)胞功能缺失時(shí)，用抗體阻斷 PD-1 與 PD-L1 相互作用可解除對(duì) T 細(xì)胞的抑制作用，促進(jìn) T 細(xì)胞增殖，恢復(fù)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷功能[28]。多個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，部分腫瘤過(guò)度表達(dá) PD-1/PD-L1，應(yīng)用抗 PD-1 或抗 PD-L1 抗體，可恢復(fù) T 細(xì)胞的抗癌功能，導(dǎo)致腫瘤消退，證明這個(gè)治療策略的可行性。 近來(lái)，用抗 PD-1/PD-L1 抗體治療 CHB 的研究取得了初步進(jìn)展。Tzeng 等[28]利用抗 PD-1 抗體阻斷PD-1 與 PD-L1 的作用，能上調(diào) HBV 持續(xù)感染小鼠模型中肝內(nèi) T 細(xì)胞 HBcAg 特異性 IFN-γ 的產(chǎn)生，也能恢復(fù) CTL 對(duì)病毒感染的清除作用，表明了抗 PD-1/PD-L1 抗體用于治療 CHB 的潛在價(jià)值，但其療效和安全性仍有待臨床實(shí)驗(yàn)證明。

已發(fā)現(xiàn)的 T 細(xì)胞負(fù)調(diào)控分子機(jī)制還包括CD244、細(xì)胞毒 T 細(xì)胞相關(guān)蛋白-4(Cytotoxic T-lymphocyte-Associated Protein 4，CTLA-4)和 T 細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain containing molecule-3，Tim-3)。與 PD-1 一樣，CD244 在 CHB 患者 HBV 特異 CD8+T 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，通過(guò)不同的信號(hào)通路負(fù)調(diào)控 T 細(xì)胞免疫功能，因此阻斷 CD244 和其配體 CD48 成為潛在的免疫療法作用靶標(biāo)而受關(guān)注[29]。CTLA-4 在腫瘤和病毒感染中的作用已有深入研究。有證據(jù)表明，阻斷 CTAL-4 能促進(jìn) HBV 特異的 CD8+T 細(xì)胞增殖、誘導(dǎo) Th1/Th2 應(yīng)答產(chǎn)生、增強(qiáng) CTL 殺傷效應(yīng)[22,30,31]。臨床上，抗 CTLA-4 抗體對(duì)多種腫瘤有明確的治療作用，美國(guó) FDA 已經(jīng)批準(zhǔn)抗CTLA-4 抗體治療黑色素瘤[32]，但該抗體藥是否同樣適用于 CHB 治療仍有待進(jìn)一步研究。Tim-3是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的另一種T細(xì)胞負(fù)調(diào)控機(jī)制，可能與 CHB 的發(fā)生有關(guān)。 在 CHB 患者體內(nèi)觀察到，高表達(dá) Tim-3 的 T 細(xì)胞產(chǎn)生 IFN-γ 和 TNF-α 的能力減弱；Tim-3 阻斷劑或抑制 Tim-3 的表達(dá)能促進(jìn)HBV 特異 CD8+T 細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生[33,34]，增強(qiáng) PBMC 和 NK 細(xì)胞的抗病毒作用[35]。

總之，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種免疫抑制蛋白在 CHB中對(duì) T 細(xì)胞免疫起到抑制作用，因此應(yīng)用這些分子的阻斷劑(主要是單克隆抗體)來(lái)恢復(fù) T 細(xì)胞抗HBV 的功能，已經(jīng)成為 CHB 免疫療法的一個(gè)研究熱點(diǎn)。但這類(lèi)蛋白對(duì) T 細(xì)胞的抑制作用是免疫系統(tǒng)一種正常的調(diào)控機(jī)制，必不可少，如何使用抑制劑達(dá)到抗 HBV 的治療效果而不使 T 細(xì)胞的功能失衡而導(dǎo)致嚴(yán)重副作用，是在實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用之前必須解決的問(wèn)題。因此，這類(lèi)抑制劑的使用，還有很長(zhǎng)的路要走，目前未見(jiàn)相關(guān)藥品批準(zhǔn)上市。

3.4 治療性疫苗

目前已有多種治療性疫苗經(jīng)過(guò)臨床試驗(yàn)。最常見(jiàn)的是針對(duì)表面抗原(HBsAg)或核心抗原(HBcAg)的常規(guī)疫苗。這些常規(guī)疫苗能實(shí)現(xiàn)血清 e 抗原(HBeAg)陰轉(zhuǎn)、誘導(dǎo) HBV 特異性免疫應(yīng)答，也能降低病毒滴度，但是它們的有效期短暫，無(wú)法持續(xù)抑制 HBV 復(fù)制[36-42]。

分子生物學(xué)技術(shù)被用于設(shè)計(jì)復(fù)雜的治療性疫苗，試圖突破免疫耐受問(wèn)題。例如，將 HBsAg和特異性 anti-HBs 抗體連接起來(lái)，組成了抗原-抗體復(fù)合物(Immunogenic Complex，IC)[43]。IC中的 Fc 段與 APC 膜表面受體結(jié)合，增加對(duì)抗原(HBsAg)的加工和遞呈，同時(shí)還促進(jìn) Th1 細(xì)胞分泌 IFN-γ，從而誘發(fā)更強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)。臨床 I 期結(jié)果表明，IC 疫苗能導(dǎo)致部分 HBeAg 陽(yáng)性病人發(fā)生 HBeAg 轉(zhuǎn)陰，病人體內(nèi)檢測(cè)到 HBs抗體的表達(dá)、體內(nèi)病毒載量也明顯減少[44]。在隨后的臨床 II 期實(shí)驗(yàn)中，通過(guò) IC 疫苗治療，21.8%(17/78)的治療組患者發(fā)生了 HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換，但是在治療 24 周以后，這些患者體內(nèi)仍能檢測(cè)到少量病毒 DNA 和 HBsAg[45]。但是最新的臨床 III 期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) IC 組與安慰劑對(duì)照組差異不顯著，跟臨床 II 期結(jié)果相比，IC 組 HBeAg轉(zhuǎn)陰率從 21.8% 降至 14%，而對(duì)照組則從 9% 升至 21.9%[3]。因此，這些結(jié)果不能證明 IC 疫苗具有長(zhǎng)期治療效果[3,4]。

由于 DNA 疫苗能較好地誘發(fā) Th1 型細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)，而且比蛋白疫苗設(shè)計(jì)更簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本更低，因此 DNA 疫苗也成為了 CHB 免疫治療的一種選擇[46]，一些表達(dá) HBsAg 的 DNA疫苗也進(jìn)入了臨床 I 期試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明 DNA安全，且能恢復(fù)部分 T 細(xì)胞免疫，但是不足以顯著抑制病毒復(fù)制[47,48]。因此，還沒(méi)有治療性 DNA疫苗進(jìn)入市場(chǎng)。

4 合成免疫策略治療慢性 HBV 感染

4.1 合成免疫抗 HBV 感染的基本原理

最近，我們提出了利用合成免疫治療腫瘤的免疫療法創(chuàng)新策略[49]：用微環(huán) DNA 表達(dá)工程抗體，其中的單克隆抗體介導(dǎo)抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性作用，而雙靶向抗體將非特異的 T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為抗癌 CTL，兩者協(xié)同，達(dá)到治療癌癥的目的?；趯?duì)急性感染康復(fù)過(guò)程以及對(duì) CHB 發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，我們提出用類(lèi)似的合成免疫策略，來(lái)達(dá)到根治 CHB 的目的。這里描述 HBV 感染與腫瘤的差別，以及合成免疫實(shí)施方案的異同。

合成免疫抗 HBV 的策略是利用微環(huán) DNA 合成并表達(dá)一組 HBV 特異的工程抗體(engineered Antibodies，eAbs)，包括單克隆抗體(monoclonal Antibody，mAb)和雙靶向抗體(BispecificAntibodies，BsAbs)，用它們模擬急性 HBV 感染康復(fù)過(guò)程，由 mAb 中和病毒，而 BsAbs 在 T 細(xì)胞與感染 HBV 的肝細(xì)胞之間形成免疫突觸，發(fā)揮 T 細(xì)胞受體一樣的功能，介導(dǎo) T 細(xì)胞殺死靶細(xì)胞(圖 1)。

在預(yù)防 HBV 感染時(shí)，抗體中和病毒是主要的效應(yīng)機(jī)制，但在清除 HBV 感染的過(guò)程中，抗體的作用有限。因?yàn)椴《旧a(chǎn)大量 HBsAg 分泌到血液中，與中和抗體結(jié)合，成為病毒顆粒的保護(hù)傘。因此，急性 HBV 感染的康復(fù)，主要依靠 CTLs 清除 HBV 感染的靶細(xì)胞。相應(yīng)地，抗HBV 合成免疫策略也應(yīng)以 BsAb 介導(dǎo) T 細(xì)胞殺傷感染肝細(xì)胞為主，輔以 mAb 中和體液中的病毒顆粒。

4.2 基于微環(huán) DNA 技術(shù)的 HBV 合成免疫實(shí)施方案

工程抗體 BsAb 和 mAb 可以通過(guò)體外生產(chǎn)并純化得到(基于抗體制備的免疫療法)，但抗體的制造成本高，且在體內(nèi)的半衰期很短，難以用來(lái)建立起上述康復(fù)者體內(nèi)持久的抗 HBV 免疫機(jī)制。這里提供了另一種抗 HBV 合成免疫的實(shí)施方案，即通過(guò)優(yōu)化的非病毒 DNA 載體－微環(huán) DNA(Minicircle，MC)，在體內(nèi)生產(chǎn)適量的抗HBV 工程抗體(mAb 及 BsAb)。MC 通過(guò) DNA重組技術(shù)消除標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒載體中的骨架 DNA 成分，只含外源基因表達(dá)框[50,51]。骨架 DNA 成分包括質(zhì)粒 DNA 復(fù)制起始位點(diǎn)、抗生素抗性基因和F1復(fù)制序列；它們只在DNA克隆時(shí)有用，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不但無(wú)用，還會(huì)產(chǎn)生多種不利作用，包括誘發(fā)轉(zhuǎn)基因的沉默效應(yīng)[52]和其富含的未甲基化 CpG 引起的炎癥反應(yīng)[53,54]。將這些成分去除后所得的 MC 載體，能在體內(nèi)長(zhǎng)期、穩(wěn)定、高效地表達(dá)目的基因，對(duì)比普通標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，優(yōu)勢(shì)明顯[55]。當(dāng)前，微環(huán) DNA 的制備技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成熟，通過(guò)簡(jiǎn)單方法即可制備安全、無(wú)毒、高質(zhì)量的醫(yī)用級(jí)別 MC[56,57]，并已逐漸被生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究者廣泛應(yīng)用。與基于抗體的免疫療法相比，MC 具有明顯優(yōu)勢(shì)，包括：

(1) 費(fèi)用低廉

MC 的生產(chǎn)、純化、儲(chǔ)存和運(yùn)送成本非常低廉，每一環(huán)節(jié)的費(fèi)用都只是抗體技術(shù)的一小部分；

(2) 技術(shù)簡(jiǎn)單、靈活

更易于建立起多個(gè) MC 組成的基因庫(kù)，編碼針對(duì)不同抗原表位的多種抗體；

圖 1 合成免疫治療慢性乙肝病毒感染。微環(huán)DNA表達(dá)工程抗體，其中單克隆抗體中和游離病毒，雙靶向抗體介導(dǎo)非特異T細(xì)胞殺滅感染HBV的肝細(xì)胞，兩者協(xié)同治療CHBFig . 1 Anti-HBV synthetic immunity strategy. The minicircles are used to produce a goup of mAbs a nd BsAbs, the mAbs of which are to neutralize the viruses, while the BsAbs to retarget the resting T cells to become HBV-specific CTLs that is capable of killing HBV-infected hepatocytes

(3) 易于大量生產(chǎn)

MC 適于大批量生產(chǎn)，理論上能滿(mǎn)足所有患者的需求；

(4) 安全性好

MC 本身不具有感染性，不會(huì)整合進(jìn)患者基因組，十分安全。目前，F(xiàn)DA 已批準(zhǔn)多種非病毒DNA 載體的商品化應(yīng)用，也間接證明了 MC 的安全性。

制約 MC 大規(guī)模應(yīng)用的主要因素是它的投遞問(wèn)題。然而，這一問(wèn)題近期已經(jīng)有所突破，已經(jīng)有臨床試驗(yàn)在評(píng)價(jià)體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染核酸技術(shù)的治療效果[58-60]。比如，可利用 PBMC 或源于 PBMC的 DC-CIK 細(xì)胞作為 MC 的攜帶者，轉(zhuǎn)染 MC 后回輸?shù)襟w內(nèi)產(chǎn)生抗體。雖然 B 細(xì)胞是體內(nèi)唯一生產(chǎn)抗體的細(xì)胞，但已經(jīng)有多個(gè)報(bào)道表明，抗體可用轉(zhuǎn)基因由皮膚或肌肉等細(xì)胞產(chǎn)生[61,62]。重要的是雙靶向抗體只含有天然抗體的一小部分，與天然抗體有很大區(qū)別，具有轉(zhuǎn)基因的基本特性[63-66]?；谠撜J(rèn)識(shí)，筆者用 MC 轉(zhuǎn)染人的 DCIK 細(xì)胞，生出產(chǎn)雙靶向抗體(待發(fā)表資料)。本課題組已經(jīng)合成了若干可生物降解的化合物，能在體內(nèi)或體外高效介導(dǎo)微環(huán) DNA 的轉(zhuǎn)染，目前正在進(jìn)一步優(yōu)化。隨著 DNA 投遞技術(shù)的不斷發(fā)展，投遞已不再成為 MC 應(yīng)用的制約因素。理想的治療系統(tǒng)是，將微環(huán) DNA 投送到如肝臟、肌肉一類(lèi)的穩(wěn)定的細(xì)胞群，長(zhǎng)期表達(dá)抗 HBV 工程抗體，建立穩(wěn)定的抗病毒機(jī)制。

總之，基于 MC 的合成免疫有望成為一個(gè)安全、高效、可負(fù)擔(dān)的免疫治療技術(shù)，可為攻克CHB 貢獻(xiàn)力量。筆者已經(jīng)初步證明這個(gè)設(shè)想的可行性，目前正在進(jìn)一步完善這個(gè)治療體系。

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Perspectives on Synthetic Immunity to Treat Chronic Hepatitis B Virus Infection

CHEN Ping HE Chengyi CHEN Zhiying

(Laboratory for Gene and Cell Engineering,Shenzhen Institutes of Advanced Technology,Chinese Academy of Sciences,Shenzhen518055,China)

Chronic infection of hepatitis B virus (HBV) is a severe public health problem because it affects millions of people worldwide and results in 600 thousand deaths from liver cirrhosis and hepatocarcinoma each year. Currently, no treatment is available to cure this disease. Here, we propose a synthetic immunity strategy to treat this disease. Specifically, minicircle DNA, an optimized non-viral vector, is used to express a group of engineered antibodies, of which the monoclonal antibodies act to neutralize the virus, while the bispecific antibodies (BsAbs) to render the resting T lymphocytes the function of anti-HBV CTLs to eliminate HBV-infected hepatocytes. The two classes of antibodies work in concert to cure the disease as the host immune system eliminates the virus during recovering from acute infection. With the superior features in safety, transgene expression profile and cost-effectiveness, minicircle can be used to establish a powerful anti-HBV synthetic immunity to achieve this goal.

Hepatitis B virus; chronic HBV infection; synthetic immunity; minicircle DNA; adoptive immunity

Q 812

A

2015-05-15

：2015-06-01

深圳市政府基金(SFG 2012.566 和 SKC 2012.237)

諶平，博士，研究方向?yàn)?HBV 免疫治療；何成宜，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)榛蚺c細(xì)胞治療技術(shù)；陳志英(通訊作者)，研究員，研究方向?yàn)榛蚺c免疫細(xì)胞治療，E-mail：zy.chen1@siat.ac.cn。