王菲+尹燕雷+馮立娟+楊雪梅+王長君

摘要：綜述了國內外學者在果樹抗寒性研究方面的新進展，包括細胞結構及其動態(tài)變化、組織器官類型、生理生化機制、分子生物學和抗寒途徑等方面。同時，對今后果樹抗寒性著重研究的領域提出展望。

關鍵詞：果樹；抗寒性；生理生化機制；分子生物學； 研究進展

中圖分類號：S66-3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）09-0141-05

寒害是全世界果樹生產面臨的一個嚴峻問題，它不僅會損傷樹體還嚴重影響果實產量和品質，使農戶蒙受巨大的經(jīng)濟損失。本文通過對果樹抗寒生理生化機制、分子機制和抗寒途徑等方面進行綜述，以期為今后果樹抗寒機理的深入研究、抗寒種質的篩選、抗寒生物技術的應用提供科學的依據(jù)。

1細胞形態(tài)與組織器官方面研究

1.1葉片細胞結構及其動態(tài)變化與抗寒性

葉片細胞結構是果樹對環(huán)境長期適應的結果，它能夠反映果樹抗寒性強弱，但相關性因果樹品種而不同。核桃葉片總厚度與柵欄組織厚度均與抗寒性強弱呈正相關[1]，澳洲堅果氣孔密度大的抗寒性強[2]，番荔枝葉脈突起度大的抗寒性強[3]。此外，質壁分離現(xiàn)象也與抗寒性密切相關。蘋果在越冬期間皮層細胞質壁分離出現(xiàn)得早、復原得快，即原生質體孤立程度強烈，這類品種抗寒性強[4]。

1.2組織器官類型與抗寒性

皮層與木質部是果樹枝和干的組成部分，兩者體積比與抗寒性緊密相關[5]，木質部越多則該樹種或品種的抗寒性越強。果樹各組織器官在不同時期抗寒性一般表現(xiàn)為木質部>葉芽>花芽[6]，在枝條組織上表現(xiàn)為韌皮部>木質部>形成層>髓。

2抗寒性生理生化機制研究進展

2.1膜系統(tǒng)的結構和成分與抗寒性

“膜脂相變”學說[7]指出低溫下生物膜發(fā)生相變，結構的破壞導致植物受到不同程度的傷害。降溫超過一定程度，膜因收縮產生孔道或龜裂使得透性變大、膜上結合酶活性喪失、細胞失去相應的代謝功能。與其它細胞成分相比，生物膜更易受到低溫傷害。果樹抗寒性與膜脂不飽和度呈正相關。低溫條件下，細胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性的提高，對于提高果樹抗寒力、增強適應性是十分重要的。

2.2膜脂過氧化、抗氧化系統(tǒng)與抗寒性

“超氧化物學說”在20世紀中葉由Havman首先提出。果樹受到低溫脅迫時會產生過氧化作用，這是由增加的活性氧和自由基導致的。丙二醛（MDA）含量變化能夠反映果樹受低溫傷害的程度，因為它是膜脂過氧化的產物。在杏的研究中發(fā)現(xiàn)MDA含量與抗寒性呈負相關[8]，并將其作為耐寒株系和品種的篩選依據(jù)。果樹本身所含的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）及抗壞血酸氧化酶（ASP）等，能夠消除活性氧、避免毒害，組成自身免疫的保護酶系統(tǒng)。蘋果花芽中SOD、POD活性越高，耐寒力越強[9]。在生物體內，保護酶系統(tǒng)協(xié)同作用，能夠保證自由基濃度不超過臨界值，自由基就不會造成傷害。

2.3細胞滲透調節(jié)物質與抗寒性

2.3.1無機離子與抗寒性低溫傷害促使無機離子外滲[10]，是因為膜透性增加甚至失去半透性。膜能否恢復半透性，視果樹受害程度而定，而這又取決于植株的抗寒性。果樹受到低溫傷害時，或許外部形態(tài)[11]尚未發(fā)生任何變化，但電解質外滲現(xiàn)象一般會存在，這種現(xiàn)象出現(xiàn)的早晚也可作為抗寒力強弱的體現(xiàn)。細胞膜透性增加與電解質外滲率呈正相關，與果樹抗寒性呈負相關，這在蘋果[12]、葡萄[13]、獼猴桃[14]、柑橘[15]等的抗寒研究中都得到證實和應用。

2.3.2可溶性糖與抗寒性可溶性糖作為滲透調節(jié)物質，可以降低凝固點，從而保護細胞質免于過度脫水。果樹受到低溫脅迫時，可溶性糖含量增加，這在芒果[16]、香蕉[17]、菠蘿蜜[18]等的研究中都有體現(xiàn)。另外，糖為脂肪和淀粉等物質的合成提供代謝底物，這些物質的累積對果樹安全越冬是十分重要的。

2.3.3可溶性蛋白與抗寒性隨著溫度逐漸降低，細胞內蛋白質對果樹抗寒力的提高起著重要作用[19]?？购θ醯钠贩N可溶性蛋白質增加有限?？扇苄缘鞍椎淖兓粌H體現(xiàn)在數(shù)量上，也體現(xiàn)在種類上即有新的蛋白產生。新蛋白質有的作為酶促進抗寒代謝反應發(fā)生，有的能夠加固膜系統(tǒng)，還有的作為抗寒蛋白使細胞液在冰凍低溫下維持冷凍狀態(tài)。

2.3.4脯氨酸與抗寒性果樹遭遇逆境時，脯氨酸便會積累，這是因為逆境激活了脯氨酸的合成過程[20]，同時抑制了脯氨酸的降解過程。逆境消除后，脯氨酸又被分解利用，這是個迅速的過程。脯氨酸不僅是一種滲透調節(jié)物質，而且還可作為活性氧的清除劑穩(wěn)定蛋白質、DNA和膜[21]，降低凝固點防止細胞脫水，作為能量庫調節(jié)細胞氧化還原勢。果樹經(jīng)低溫脅迫后，游離脯氨酸含量迅速提高，可作為抗寒性評價指標之一，這點在葡萄、櫻桃、蘋果等果樹上都有體現(xiàn)和應用。脯氨酸的合成部位在根部，之后再運輸?shù)降厣喜科鹱饔谩?/p>

2.4激素與抗寒性

抗寒相關激素研究最多的為脫落酸（ABA），它是一種信號因子，會對逆境產生響應。果樹在低溫鍛煉過程中積累的ABA對提高抗寒性效果明顯[22]。在梨樹上，當游離脫落酸 （F-ABA）含量增加時，結合脫落酸 （C-ABA）含量就會降低，則抗寒性提高[23]。外施ABA可以增強果樹的抗寒力，同時還可促進休眠、降低冬芽和枝條含水量。

學者們在最初研究抗寒相關激素時選擇的是赤霉素（GAs）?？购Φ墨@得與該激素含量下降有關，因為這種現(xiàn)象使長勢減弱。在杏樹[24]等多種果樹上通?？购詮姷钠贩NGAs含量低于抗寒性弱的。

ABA和GAs含量的比值與果樹抗寒性密切相關。ABA/GA比值增高時，低溫半致死溫度也會相應增加。果樹遭遇低溫時，ABA/GA比值增高，表明抗寒力提高；低溫解除后，ABA/GA比值下降，抗寒力降低，低溫及ABA首先誘導ABA/GAs的積累，再由ABA/GAs啟動特異性板機，最終合成抗寒特異蛋白質，進而提高柑橘的抗寒力。endprint

2.5細胞內水的形態(tài)與抗寒性

細胞內水分以兩種形式存在，即自由水和束縛水，兩者所占的比例可以反映果樹抗寒性。低溫促使自由水減少，束縛水比例增加[25]，抗寒性產生并逐步提高。冬季杏樹束縛水比重增加越快，表明該品種越抗寒。在梨樹上，是否抗寒以比值1為界，當比值大于1時，該品種才具抗寒性。

3分子生物學領域抗寒性研究進展

分子生物學在20世紀中期以后發(fā)展迅速，理論和方法日趨完善，抗寒機理也隨之邁向分子領域，并取得了顯著進展?？箖龌虻念愋秃凸δ?、抗凍蛋白的分離和表達調控、以及低溫信號轉導調節(jié)機制等方面，成為學者們研究抗寒性的重點?？购蚬こ桃殉蔀楣麡溥z傳育種的一條重要途徑，因其具有育種周期短、物種改良空間大的優(yōu)點。目前已經(jīng)分離鑒定出許多抗寒相關基因，將抗寒基因轉入草莓[26]、香蕉[27]、蘋果[28]等，明顯提高了植物抗寒性。

3.1抗寒基因與抗寒特異性蛋白種類

抗寒基因分功能基因和調控基因兩種，前者保護膜免受低溫傷害，包括冷誘導基因（COR）、抗氧化酶基因、脂肪酸去飽和酶基因等[29]；后者調控信號傳導、基因表達和蛋白活性，主要有CBF、ICE、b-ZIP、WRKY、NAC等轉錄因子基因[30]。

抗寒特異性蛋白分為保護性蛋白和調節(jié)蛋白，前者種類很多，有抗凍蛋白、微管蛋白、COR蛋白、脫水蛋白、水通道蛋白、伴侶蛋白、解毒酶[31]等；后者包括轉錄因子、蛋白激酶和磷酸肌醇代謝酶類。有些學者依據(jù)抗寒蛋白與ABA的關系，將蛋白合成途徑分為ABA依賴和非ABA依賴兩種。近年來，學者們在質膜抗寒蛋白的分離、功能鑒定[32]和表達調控等方面做了大量工作。有些果樹經(jīng)低溫鍛煉會產生冷擊蛋白；微管結合蛋白與激素變化和信號轉導有關；磷脂酶參與信號轉導[33]，對環(huán)境脅迫和植物激素作出響應，增強抗寒性。

3.2鈣信使系統(tǒng)與果樹抗寒性

胞內Ca2+信號轉導機制與植物抗寒性密切相關[34]，鈣信使系統(tǒng)可通過調節(jié)與冷相關的基因表達而參與植物對低溫脅迫的反應與適應。核桃葉肉細胞中的鈣調素（CaM）主要定位于細胞核和葉綠體中[35]，線粒體中也有一定量的CaM存在。CaM含量變化反映果樹抗寒性強弱，抗寒品種低溫脅迫初期其含量增加，后期含量降低遲于不抗寒品種。膜的密閉性是鈣信號傳遞的基礎，通過突觸結合蛋白SYT1功能區(qū)[36]使耐冷性得以表達。高滲條件下質膜上鈣聯(lián)蛋白累積，H+-ATP酶在上游被調控從而加速離子流出。

3.3果樹基因工程研究進展

近年來，果樹抗寒研究逐步深入到分子水平，并取得非常大的成績?；蛐蛄蟹治黾夹g的產生和載體構建技術的成熟，使抗寒基因轉入果樹成為可能。CBF是抗寒相關基因COR的轉錄激活因子，將其導入蘋果、葡萄[37]，發(fā)現(xiàn)經(jīng)低溫誘導，轉化株系葉片中的SOD、POD活性、脯氨酸含量與對照相比均有所提高。在香蕉抗寒基因的研究中，通過農桿菌介導法已經(jīng)成功將AFP基因導入胚型懸浮細胞系中，現(xiàn)已經(jīng)獲得轉基因植株，并且檢測呈陽性。通過氮離子注射技術在杏莖段中轉入了AFP基因， 研究結果表明， 抗寒生理指標與氮離子束濃度[38]有關。在柑橘的研究上，由篩選到的差異表達cDNA構建差減文庫，獲得了一個首次在柑橘上發(fā)現(xiàn)特有編碼冷相關COR413蛋白基因的EST序列，為探明柑橘抗寒的分子機制提供了理論依據(jù)。

4抗寒途徑研究進展

4.1抗寒育種

減輕寒害的根本途徑是抗寒育種。中國果樹選種至少已有3 000年以上歷史，20世紀50年代初期開始有計劃的果樹育種，已先后育出蘋果、葡萄、梨、杏、柑橘等抗寒新品種40多個，對避免和減少寒害損失起到了重要作用。

4.1.1常規(guī)抗寒育種常規(guī)抗寒育種途徑有雜交育種、芽變選種、實生選種、誘變育種以及砧木育種等。兩個耐寒扁桃品種‘晉扁1號和‘晉扁2號是從品種‘ Tuono實生苗中選育出來的，能在-24.3℃低溫下安全越冬；‘敖東寒桃[39]為優(yōu)良抗寒品種，在東北地區(qū)適宜栽植，為實生單株選育； “紅旗特早玫瑰” 是葡萄新品種，不僅耐寒而且特早熟，為芽變選種育成。據(jù)保守統(tǒng)計，我國梨抗寒新品種有28個為雜交育種選育；美國阿肯色州立大學通過雜交選育的葡萄抗寒品種‘信心無核[40]，種植面積遍及美國北部和加拿大，是世界葡萄抗寒育種的一個里程碑。吉林省農業(yè)科學院果樹研究所選育出抗寒力極強的蘋果矮化砧木‘GM256，在生產上得到廣泛應用。

4.1.2現(xiàn)代生物技術抗寒育種這種育種方式主要以細胞和基因工程兩種技術為手段，以培育抗寒突變體或轉基因植株為目的。1983年，世界首例轉基因植物——抗病毒煙草在美國問世，如今獲得成功的轉基因植物己涉及到35科120種。植物抗寒基因工程的研究取得豐碩成果，歸納起來主要有五種途徑，即脂肪酸去飽和代謝關鍵酶基因途徑、脯氨酸（Pro）基因途徑、糖類代謝基因途徑、超氧化物歧化酶（SOD）途徑和魚類抗凍蛋白途徑等。沈洪波等[41]以脯氨酸的類似物羥脯氨酸（HYP）為選擇壓，成功地獲得了來自錦橙株心愈傷組織的抗寒植株，經(jīng)測定其抗寒性比對照增加2.4℃，葉片中幾種游離氨基酸含量都比對照增加。萬琳深等[14]應用體細胞雜交獲得獼猴桃屬種間體細胞雜種試管苗， 并分析了它們的抗寒性。植物抗寒基因工程的所用基因，按照物種來源不同分為植物抗寒基因和魚抗凍蛋白基因兩種。果樹遺傳改良以基因工程為手段是個重要的研究領域，獲得轉基因植株的果樹愈來愈多。

4.2使用藥劑提高果樹抗寒性

給果樹噴施激素是提高果樹抗寒力常用的農業(yè)措施。作為抗寒基因表達的啟動子，激素含量的變化，動態(tài)調節(jié)著果樹抗寒性的產生和提高。目前，廣泛用于果樹的抗寒誘導激素種類有脫落酸（ABA）、矮壯素（CCC）、比久（B9）、馬來酰肼（MH）、多效唑（PP333） 等。胡春霞[42]研究表明，南果梨噴施PP333后越冬枝條中丙二醛含量和相對電導率比對照顯著降低，脯氨酸和可溶性糖含量比對照顯著增加，這些都表明南果梨抗寒性得到加強。endprint

5展望

果樹抗寒研究今后需要加強的工作主要有：（1）優(yōu)良抗寒基因的尋找、鑒定和克隆；（2）多種果樹種類和品種轉化體系的構建；（3）培育能夠同時抵抗多種逆境的轉基因果樹，因為果樹受到致命傷害常是多種不良環(huán)境共同影響所致；（4）深入研究激素在抗寒基因表達中的作用，用以指導生產上利用化控技術增強果樹抗寒性；（5）在現(xiàn)有基礎上深入研究蛋白質等大分子物質與抗寒性關系；鈣信號基因和核酸調控表達機理，尚需更全面系統(tǒng)地研究，且要在更多果樹樹種和品種上進行推廣。

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