白殊同，鄧秋狄，謝 揚(yáng)，唐雯慧，高皖皎，佟 麗*

1南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院;2 南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510515

衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物具有多種生物學(xué)活性，其中南蛇藤抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、抗腫瘤等多種藥理學(xué)活性已被證明［1，2］。近期有研究表明，南蛇藤有抑制腫瘤細(xì)胞增殖及抑制腫瘤血管新生(Angiogenesis)作用［3］，但物質(zhì)基礎(chǔ)尚未闡明。本課題組前期研究中，從南蛇藤總萜成分中分離出一個(gè)活性成分，通過(guò)1H NMR 和13C NMR 分析，鑒定該成分結(jié)構(gòu)與Nimbidiol 相同(分子式:C17H22O3，分子量274.1524)。采用模式生物斑馬魚(yú)斑和大鼠動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)對(duì)其生物活性進(jìn)行篩選，觀(guān)察了南蛇藤活性成分Nimbidiol 對(duì)斑馬魚(yú)節(jié)間血管發(fā)育及對(duì)大鼠動(dòng)脈環(huán)生長(zhǎng)情況的影響，為明確南蛇藤抑制血管新生作用確定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品試劑與儀器

南蛇藤(Celastrus aculeatus Merr.)由華南植物園葉華古研究員采集并鑒定。Nimbidiol(由南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院謝揚(yáng)教授，分離提取鑒定后提供);靛玉紅(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):1107171-200204);血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF，Vascular endothelial growth factor，PeproTech 公司);新生牛血清(GIBCO 公司);Matrigel 膠(BD 公司);DMEM 高糖培養(yǎng)基(GIBCO 公司);胚胎培養(yǎng)水(Egg water，南方醫(yī)科大學(xué)生物學(xué)教研室提供);二甲基亞砜(DMSO分析純，南方醫(yī)科大學(xué)試劑中心);苯硫脲(PTU，Sigma 公司);磷酸鹽緩沖液(PBS，武漢博士德生物工程有限公司);高效液相色譜儀(HPLC，Agilent 公司);高速逆流色譜儀(HSCCC，上海Tauto 生物科技公司);核磁共振波譜儀(NMR，600M，Bruker 公司);電子轟擊源-高分辨質(zhì)譜儀(EI-HR-MS，Thermo Scientific 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量160～180 g，購(gòu)買(mǎi)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào):SCXK 粵2011-0015);Fli1-GFP(+/ +)雄性轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)、AB 型雌性斑馬魚(yú)(南方醫(yī)科大學(xué)生物學(xué)教研室提供)。斑馬魚(yú)飼養(yǎng)于斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛(ài)生公司)內(nèi)，培養(yǎng)水pH 值7.4，水溫28.5 ℃。斑馬魚(yú)每天接受日光燈照射14 h，黑暗環(huán)境10 h，每天由實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)人員喂食三次。

1.3 Nimbidiol 的提取分離及鑒定

過(guò)山楓原藥材烘干粉碎，過(guò)60 目篩得粗粉。粗粉經(jīng)95%乙醇浸泡、回流提取、濾液減壓濃縮得乙醇提取浸膏。將乙醇浸膏分散于水中，用超聲加熱并使其均勻分散，用石油醚、氯仿萃取后再用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯部位;乙酸乙酯部分用大孔樹(shù)脂層析柱(9 ×40 cm)，進(jìn)行分離和篩選，先用蒸餾水進(jìn)行沖洗，然后再用80%乙醇進(jìn)行洗脫，將洗脫液進(jìn)行減壓濃縮，得濃縮物1;濃縮物1 用硅膠柱(4.5×65 cm)層析進(jìn)行分離，洗脫液比例為石油醚∶丙酮=50∶1～5∶1(洗脫液均為體積比)，對(duì)5∶1 部位收集液進(jìn)行合并濃縮，得濃縮物2;濃縮物2 用硅膠柱(1.2 ×70 cm)層析進(jìn)行分離，洗脫液:石油醚∶乙酸乙酯=8∶1～6∶1，其中對(duì)中間比例部位收集液進(jìn)行合并濃縮，得濃縮物3;制備薄層色譜法得到濃縮物3，展開(kāi)劑選擇為石油醚∶丙酮(3∶1)，得單體化合物1?；衔? 溶于甲醇，以高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)化合物1 含量，其純度為95%;以1H NMR 和13C NMR 對(duì)化合物1 進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

化合物1(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)，分子式(C17H22O3);mp.171～175 ℃;EI-HR-MS m/z:274.1524 m/z(rel.int.%):274 (M+，99)，259 (100)，217 (32)，203 (24)，191 (78)，189 (94)，177 (57)，163(23)，69 (51)，57 (30)，55 (24);1H NMR (CDCl3，600 MHz)δ:7.62 (1H，br，H-14)，6.83 (1H，br，H-11)，2.15 (1H，m，H-5)，2.54-2.66 (2H，dd，H-6)，1.71 (1H，overlapped，H-1a)，1.64 (1H，m，H-1b)，1.78 (1H，m，H-2a)，1.48 (1H，overlapped，H-2b)，1.22 (1H，m，H-3a)，1.43 (1H，m，H-3b)，1.14(3H，s，H-15)，0.94 (3H，s，H-16)，0.88 (3H，s，H-17);13C NMR (CDCl3，150 MHz)δ:37.9 (C-1)，32.5 (C-2)，41.3 (C-3)，33.2 (C-4)，49.8 (C-5)，35.9 (C-6)，200.6 (C-7)，123.7 (C-8)，142.2 (C-9)，37.8 (C-10)，110.1 (C-11)，151.4 (C-12)，152.4 (C-13)，113.6 (C-14)，18.9 (C-15)，21.3(C-16)，23.2 (C-17)。鑒定結(jié)果提示化合物1 與Nimbidiol 一致［4］。

圖1 Nimbidiol 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of nimbidiol

1.4 斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)及藥物濃度配制

實(shí)驗(yàn)前一天，挑選Fli1-GFP (+/ +)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)與AB 型斑馬魚(yú)，以1:2 的比例分別放入交配盒中，以擋板將雌雄斑馬魚(yú)分隔，放置過(guò)夜。第二天早晨，取出交配盒擋板，光照刺激促使斑馬魚(yú)交配產(chǎn)卵。斑馬魚(yú)產(chǎn)卵后，收集半小時(shí)內(nèi)的胚胎，移入到潔凈培養(yǎng)皿中，并加入適量胚胎培養(yǎng)液，置于28.5 ℃孵化箱培養(yǎng)。胚胎發(fā)育11 h 后，篩選健康胚胎，用于試驗(yàn)。

將胚胎移入28.5 ℃生化培養(yǎng)箱中孵化11 h 后用于實(shí)驗(yàn)。將10 mg Nimbidiol 溶于100 μL 的DMSO 中，然后以胚胎培養(yǎng)水定容做為母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)配成不同濃度工作液(DMSO 含量低于0.1%)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定Nimbidiol 藥效濃度范圍，正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，將Nimbidiol 終濃度每個(gè)培養(yǎng)孔分別為12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L(三組含藥培養(yǎng)水中，DMSO 含量均低于0.1%)。以100 μmol/L 終濃度靛玉紅為陽(yáng)性對(duì)照組、含0.1% DMSO 培養(yǎng)水為陰性對(duì)照組［5］。

1.5 斑馬魚(yú)胚胎節(jié)間血管形成實(shí)驗(yàn)

魚(yú)卵孵化11 h 后移入24 孔板，每孔10 枚，各組設(shè)2 復(fù)孔。棄孔內(nèi)培養(yǎng)水，加入900 μL 含PTU培養(yǎng)水(培養(yǎng)水與PTU 體積比1∶1)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度，加入不同濃度藥物100 μL，且DMSO 含量控制在體積分?jǐn)?shù)0.1%以下。每孔加入藥液后置培養(yǎng)箱中，胚胎繼續(xù)孵化。待胚胎發(fā)育30 h 后，在熒光顯微鏡下觀(guān)察胚胎節(jié)間血管(Intersegmental Vessels，ISV)發(fā)育狀況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

熒光顯微鏡下觀(guān)察胚胎ISV 發(fā)育狀態(tài)并拍照記錄，對(duì)各組胚胎ISV 計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)分析;計(jì)算ISV 抑制率，抑制率(%)=(陰性對(duì)照組ISV 個(gè)數(shù)-給藥ISV個(gè)數(shù))/陰性對(duì)照組ISV 個(gè)數(shù)［6］。

1.6 大鼠動(dòng)脈環(huán)試驗(yàn)

取6～8 周齡SPF 級(jí)SD 大鼠，頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡15 min，超凈工作臺(tái)內(nèi)取胸主動(dòng)脈，放入100 mm 培養(yǎng)皿中，PBS 緩沖溶液清洗2 次，去除動(dòng)脈外周膜組織和纖維組織，將血管切成1.0～1.5 mm 長(zhǎng)的主動(dòng)脈環(huán)，PBS 清洗動(dòng)脈環(huán)2 次，DMEM 高糖培養(yǎng)基漂洗2 次。將動(dòng)脈環(huán)縱切面平行于培養(yǎng)孔底部，放進(jìn)預(yù)先鋪有Matrigel 膠的96 孔(50 μL/well)，隨后每孔加入預(yù)先融化的Matrigel 膠70 μL，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 ℃，5% CO2)孵育2 h，使膠凝固。待基質(zhì)膠凝固后，加入含10%新生牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)100 μL，每2 d 換液一次，實(shí)驗(yàn)第4 d 給藥。

設(shè)空白對(duì)照組、VEGF 對(duì)照組(刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，100 ng/mL)、Nimbidiol 高劑量組(50 μM/L)、中劑量組(25 μM/L)、低劑量組(12.5 μM/L);以完全培養(yǎng)基釋至VEGF 和藥物稀至相應(yīng)濃度，空白對(duì)照組加完全培養(yǎng)基作為對(duì)照，其余各組加入100 ng/mL 的VEGF，Nimbidiol 組加入相應(yīng)濃度的藥物，每孔培養(yǎng)基終體積100 μL。完成給藥，將96 孔板放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d 換藥一次。給藥6 d 后，終止培養(yǎng)，顯微鏡下(40 ×)觀(guān)察微血管生長(zhǎng)情況，并拍照記錄。每組設(shè)3 復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 13.0 軟件，結(jié)果以X ±S 表示，采用ONE-WAY ANONA 方法對(duì)各組ISV 均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Nimbidiol 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎血管發(fā)育形態(tài)影響

正常發(fā)育的斑馬魚(yú)胚胎背主動(dòng)脈熒光清晰可見(jiàn)(圖2A)，ISV 熒光清晰、無(wú)畸形;陽(yáng)性對(duì)照組斑馬魚(yú)背主動(dòng)脈熒光消失，ISV 長(zhǎng)度縮短且數(shù)量減少，血管生長(zhǎng)受到抑制(圖2B);Nimbidiol 低劑量組斑馬魚(yú)背主動(dòng)脈熒光可見(jiàn)，ISV 長(zhǎng)度均一且數(shù)量無(wú)明顯變化(圖2C);Nimbidiol 中劑量組斑馬魚(yú)背主動(dòng)脈熒光消失，ISV 熒光縮短且數(shù)量減少，血管生長(zhǎng)受到抑制(圖2D);Nimbidiol 高劑量組斑馬魚(yú)背主動(dòng)脈熒光消失，ISV 熒光減弱，且數(shù)量和長(zhǎng)度均減少，提示血管生長(zhǎng)受到顯著抑制(圖2E)。

圖2 胚胎發(fā)育30 h 后，各組斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育節(jié)間血管發(fā)育狀態(tài)Fig.2 The development state of internode blood vessel in zebrafish embryo (30 h)

2.2 Nimbidiol 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎節(jié)間血管數(shù)的影響

對(duì)各組ISV 均數(shù)比較可見(jiàn)，與陰性對(duì)照組比較，Nimbidiol 高、中、低劑量組斑馬魚(yú)胚胎，節(jié)間平均血管數(shù)量減少，血管生長(zhǎng)呈抑制狀態(tài)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=24.773，均P＜0.05。結(jié)果見(jiàn)表1)

2.3 Nimbidiol 對(duì)大鼠動(dòng)脈環(huán)血管生成的影響

動(dòng)脈環(huán)經(jīng)9 d 培養(yǎng)后，空白對(duì)照組動(dòng)脈環(huán)周?chē)鷥?nèi)皮細(xì)胞增殖，出現(xiàn)條索狀血管芽，最終形成新生微血管(圖3A);以VEGF 刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后，VEGF 組動(dòng)脈環(huán)周?chē)霈F(xiàn)大量新生微血管結(jié)構(gòu)，排列緊密(圖3B);經(jīng)Nimbidiol 低、中、高劑量處理后的動(dòng)脈環(huán)，周?chē)鷥?nèi)皮細(xì)胞增殖減少，毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)生成降低，微血管數(shù)量降低(圖3C、D、E)，且抑制效果與給藥劑量具有依賴(lài)關(guān)系。

表1 Nimbidiol 對(duì)斑馬魚(yú)節(jié)間血管數(shù)量的影響()Table 1 Effect of nimbidiol on internode vessels number of zebrafish ()

表1 Nimbidiol 對(duì)斑馬魚(yú)節(jié)間血管數(shù)量的影響()Table 1 Effect of nimbidiol on internode vessels number of zebrafish ()

注:與陰性對(duì)照組比較，* P＜0.05Note:compared with negative control group，* P＜0.05

圖3 Nimbidiol 對(duì)大鼠動(dòng)脈環(huán)新生血管的影響Fig.3 Anti-angiogenesis effect of nimbidiol on new blood vessels formation around arty rings

3 討論

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種發(fā)病機(jī)制尚未闡明的自身免疫系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)為對(duì)稱(chēng)性的關(guān)節(jié)滑膜炎性增生，最終造成軟骨和骨組織侵蝕。RA 患者滑膜組織呈類(lèi)腫瘤樣過(guò)度增殖，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)導(dǎo)致滑膜組織內(nèi)出現(xiàn)大量新生血管。大量新生血管的出現(xiàn)，對(duì)RA 的發(fā)展起促進(jìn)作用，新形成的血管為滑膜組織提供氧氣、營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子、炎性因子，持續(xù)刺激滑膜組織，加重增生并形成血管翳，侵蝕關(guān)節(jié)面和關(guān)節(jié)軟骨，并最終破壞關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨，使關(guān)節(jié)畸形并功能損傷［7］。因此抑制滑膜新生血管的形成，能夠延緩類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情發(fā)展，減輕骨關(guān)節(jié)損傷。

南蛇藤抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)研究已有很多報(bào)道，其相關(guān)作用機(jī)制與抑制炎癥、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫及細(xì)胞因子水平相關(guān)。但南蛇藤對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜血管新生作用尚未見(jiàn)報(bào)到。本研究通過(guò)模式生物斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀(guān)察南蛇藤活性成分Nimbidiol，發(fā)現(xiàn)其在12.5 μmol/L 時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)最低有效濃度的抑制斑馬魚(yú)血管形成活性，在一定的給藥劑量范圍內(nèi)，隨著給藥濃度的增加，Nimbidiol 的抑制血管新生效果不斷增強(qiáng)并與劑量相關(guān)，當(dāng)給藥濃度達(dá)到50 μmol/L 時(shí)，Nimbidiol 藥效最強(qiáng)，如繼續(xù)加大給藥劑量，藥物開(kāi)始出現(xiàn)胚胎毒性，出現(xiàn)死胎現(xiàn)象。

在正常的生理?xiàng)l件下，血管內(nèi)皮細(xì)胞處于一種相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài);然而，當(dāng)出現(xiàn)病理?xiàng)l件(如:RA)或者生長(zhǎng)因子刺激的情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞的活動(dòng)增強(qiáng)。通過(guò)大鼠動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)，觀(guān)察Nimbidiol 對(duì)大鼠動(dòng)脈環(huán)新生血管形成的影響;實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在體外條件下，12.5～50 μmol/L 濃度范圍內(nèi)的Nimbidiol，能夠抑制VEGF 誘導(dǎo)的動(dòng)脈環(huán)周?chē)鷥?nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，從而減少管腔狀微血管的形成和抑制血管新生過(guò)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Nimbidiol 具有明顯的抑制血管新生作用。

綜上所述，Nimbidiol 在12.5～50 μmol/L 濃度范圍內(nèi)，能夠有效抑制斑馬魚(yú)胚胎節(jié)間血管發(fā)育和大鼠動(dòng)脈環(huán)周?chē)苄律^(guò)程，具有明顯的抗血管新生作用。Nimbidiol 的抗血管新生活性，是南蛇藤抑制RA 重要活性成分之一，也表明了南蛇藤萜類(lèi)成分是其抗RA 和抗腫瘤作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，但其作用機(jī)制尚未闡明，推測(cè)其作用與抑制VEGF 信號(hào)通路活化有關(guān)，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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