韓廣建，李興林，別振宇，張國運

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

印楝(Azadirachta indica A.Juss)，楝科楝屬植物，生長于印巴次大陸，內(nèi)含多種生物活性物質(zhì)，其中，活性最強(qiáng)的是印楝素[1].印楝素，四環(huán)三萜類化合物，屬于檸檬苦素類物質(zhì)，主要存在于印楝種仁中，具有廣泛的生物殺蟲效果.由于種仁的生產(chǎn)力有限，人們通過植物組織培養(yǎng)的技術(shù)對印楝素進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn).影響印楝組織培養(yǎng)的因素有很多[2-3]，比如碳素、氮素、激素、溶氧量等.

氮素對植物生理代謝和生長有重要作用.印楝細(xì)胞中氮素含量的多少及氮素的存在形式都直接影響著印楝組織的生長和代謝產(chǎn)物的積累.氮素主要以硝態(tài)氮(-N)和銨態(tài)氮(-N)的形式被植物直接吸收和利用[4-5].在印楝的組織培養(yǎng)研究中，Prakash 等[6]指出，僅以硝態(tài)氮為氮素時，培養(yǎng)物有較高的細(xì)胞生長(7.1,g/L)和印楝素積累(每克細(xì)胞1.76,mg，每升培養(yǎng)物12.49,mg)，而高銨態(tài)氮對細(xì)胞生長和印楝素形成有抑制作用.但是，同時以硝態(tài)氮和銨態(tài)氮為氮素時，有利于印楝素在胞內(nèi)胞外積累的有效分配.Sujanya 等[7]研究表明，以MS 培養(yǎng)基[8]為基準(zhǔn)，在其他成分及濃度相同條件下，當(dāng)硝態(tài)氮與銨態(tài)氮的物質(zhì)的量比為4∶1 時，印楝素從胞內(nèi)幾乎完全轉(zhuǎn)移到了胞外.然而，作者對產(chǎn)生這種結(jié)果的機(jī)理沒有探討.眾所周知，可溶性蛋白是植物中酶的重要組成部分，其直接或間接影響著植物生長代謝活動，是重要的生理生化指標(biāo)之一.基于此，本文旨在探討不同氮素對印楝愈傷組織和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的影響，主要通過考察細(xì)胞中生物量、可溶性蛋白、印楝素以及檸檬苦素類物質(zhì)(AZRL)含量篩選最佳氮素，為利用細(xì)胞工程手段生產(chǎn)印楝素提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 印楝來源

印楝種子購于云南天宇種子公司，種植于天津科技大學(xué)泰達(dá)校區(qū).印楝幼葉采摘于印楝種子萌發(fā)生長兩年后的幼株.

1.2 主要試劑及儀器

印楝素標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma 公司；檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品，上海純優(yōu)生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品，上海索萊寶生物科技有限公司.

TDL-40B 型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；TU-1810 型紫外-可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Agilent 1200 型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司.

1.3 印楝愈傷組織的誘導(dǎo)

取幼嫩的葉片作為外植體，在流動自來水下沖洗3～5,h.然后將外植體移至無菌超凈臺上，用2%,的NaClO 浸泡消毒約10,min，無菌蒸餾水沖洗3 次，再用75%,酒精消毒3 次，每次30,s，并且每次酒精消毒后均用無菌蒸餾水沖洗3 次.繼之，用無菌濾紙將外植體(幼葉)表面上的水珠吸干凈，并將葉片的鋸齒狀邊緣部分以及葉柄去除，之后再切割成約1,cm2的小塊，分別轉(zhuǎn)接到含有蔗糖3%,、瓊脂0.65%,的MS[8]+NAA(1.0,mg/L)+6-BA(3.0,mg/L)、MS+NAA(1.0,mg/L)+6-BA(3.0,mg/L)+KNO3(1.99,g/L)、MS+NAA(1.0,mg/L)+6-BA(3.0,mg/L)+KNO3(3.98,g/L)固體培養(yǎng)基上，在(25±2)℃下進(jìn)行黑暗培養(yǎng)[9].經(jīng)20,d 后，分別將上述3 種愈傷組織在相應(yīng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng).

1.4 印楝細(xì)胞培養(yǎng)的建立

在氮素的物質(zhì)的量比不同的培養(yǎng)基上，分別取第3 次繼代培養(yǎng)的淺黃松散愈傷組織適量，在無菌條件下切碎，稱取 5,g(以鮮質(zhì)量計)，相應(yīng)地轉(zhuǎn)接到100,mL 含有3%,蔗糖的MS+NAA(1.0,mg/L)+6-BA(3.0,mg/L)、MS+NAA(1.0,mg/L)+6-BA(3.0,mg/L)+KNO3(1.99,g/L)、MS+NAA1.0,mg/L)+6-BA(3.0,mg/L)+KNO3(3.98,g/L)液體培養(yǎng)液中.然后在(25±2)℃、轉(zhuǎn)速125,r/min、光/暗周期8,h/16,h[7]的條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng).每隔12,d 繼代培養(yǎng)1 次，繼代培養(yǎng)接種量為30%,.

1.5 測定方法

1.5.1 印楝細(xì)胞生物量的測定

參考Raval 等[10]描述的生物量測定方法.將細(xì)胞懸浮液3,000,r/min 離心20,min，收集離心沉淀物，放入預(yù)稱量的鋁盤中稱質(zhì)量，與接種量相比，二者之差即為細(xì)胞鮮質(zhì)量.然后對鮮細(xì)胞進(jìn)行60,℃干燥至質(zhì)量恒定，即為細(xì)胞干質(zhì)量.

1.5.2 可溶性蛋白含量的測定[11-12]

最大吸收波長掃描：精確稱取牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品0.020,0,g，用蒸餾水定容至100,mL，即得200,μg/mL 的BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液.然后分別量取BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.0、0.2、0.4、0.6,mL，用蒸餾水補(bǔ)充至1.0,mL，并加5,mL 的考馬斯亮藍(lán)G-250 溶液，充分混勻后靜置5,min，然后在400～600,nm 波長范圍內(nèi)掃描.結(jié)果在590,nm 處呈現(xiàn)最大吸收峰.

可溶性蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定：分別量取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0,mL BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液于6 支10,mL 試管中，并用蒸餾水補(bǔ)充至1.0,mL.然后向各試管中加入5,mL 考馬斯亮藍(lán)G-250 溶液，混勻后靜置5,min，在590,nm 波長處測定其吸光度.以吸光度對可溶性蛋白含量做回歸處理，得到回歸方程y＝0.995,1,x+0.099,7，R2＝0.993,6.

樣品液的制備：稱取印楝組織或細(xì)胞鮮樣0.5,g，加入3,mL 磷酸緩沖液(PBS)和適量石英砂，冰浴研磨后移入10,mL 離心管中，再用5,mL pH 7.8 緩沖液沖洗，一并轉(zhuǎn)入10,mL 離心管中，于4,℃、12,000g離心15,min，收集上清液即為可溶性蛋白質(zhì)提取液，4,℃冰箱保存?zhèn)溆?

樣品液中可溶性蛋白含量的測定：取上述提取液1.0,mL，加5,mL 的考馬斯亮藍(lán)G-250 溶液，在旋渦混合器上混合處理，靜置5,min，在590,nm 處測定吸光度.結(jié)合回歸方程和式(1)計算出鮮樣中可溶性蛋白質(zhì)含量(mg/g).

式中：m1為查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的每管可溶性蛋白的質(zhì)量，mg；V1為提取液總體積，mL；V2為測定所提取液體積，mL；m2為取樣量，g.

1.5.3 印楝素含量的測定[13]

印楝素標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定：精確稱取印楝素標(biāo)準(zhǔn)品0.002,0,g，用色譜純甲醇定容至 10,mL，即得0.2,mg/mL 的印楝素標(biāo)準(zhǔn)溶液.然后分別量取印楝素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0,mL，用色譜純甲醇補(bǔ)充至1.0,mL，過膜(0.22,μm)后用高效液相色譜儀進(jìn)行測定.以吸收峰面積對印楝素含量做回歸處理，得到回歸方程y＝1.611,x+62.231，R2＝0.991,3.依據(jù)回歸方程可計算樣品中印楝素的含量.

印楝素高效液相測定條件：固定相為C18 柱(250,mm×4.6,mm，45,℃)，流動相為甲醇與水(體積比為55∶45)，流量1.0,mL/min，檢測波長217,nm，出峰時間約為4.8,min.

樣品中印楝素含量的測定：稱取1.0,g(以干質(zhì)量計)愈傷組織(或懸浮細(xì)胞)，浸泡于10,mL 甲醇中進(jìn)行提取，并按體積比60∶40 的比例向甲醇提取液中添加無菌蒸餾水，然后用與甲醇提取液體積相同的二氯甲烷萃取15,min，萃取兩次，合并兩次萃取液，之后進(jìn)行40,℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā).旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的產(chǎn)物用5,mL 色譜純甲醇重溶并過膜(0.22,μm)，運用高效液相色譜(HPLC)法進(jìn)行印楝素含量測定.由回歸方程計算樣品溶液中印楝素的含量.

1.5.4 檸檬苦素含量的測定

檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定：精確稱取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品5.00,mg 置于50,mL 容量瓶中，用二氯甲烷定容，即得0.1,mg/mL 的檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)溶液.分別量取0.0、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.4,mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液置于7 支10,mL 試管中，用二氯甲烷分別定容至1.4,mL；加入0.02,g/mL 香草醛甲醇溶液0.4,mL，混勻后室溫放置2,min；添加0.6,mL 濃硫酸，并迅速振蕩10,s，再加入1.4,mL 的甲醇溶液；靜置10,min 后于579,nm 處測定其吸光度.以吸光度對檸檬苦素含量做回歸處理，得到回歸方程 y＝2.696,5,x-0.120,4，R2＝0.993,0.依據(jù)回歸方程計算樣品中檸檬苦素的含量.

樣品中檸檬苦素含量的測定[14]：將印楝組織在40,℃下烘干至質(zhì)量恒定；稱取樣品0.15,g(以干質(zhì)量計)，浸泡于10,mL 甲醇中進(jìn)行提取，并按體積比60∶40 的比例向甲醇提取液中添加無菌蒸餾水，然后用與甲醇提取液體積相同的二氯甲烷萃取15,min，萃取兩次，合并兩次萃取液，之后進(jìn)行40,℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā).旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的產(chǎn)物用5,mL 二氯甲烷重溶，即得樣液.取1.4,mL 樣液于試管中，加入0.02,g/mL 香草醛甲醇溶液0.4,mL，混勻后室溫靜置2,min；然后加入 0.6,mL 濃硫酸，并迅速振蕩10,s；再加入1.4,mL 的甲醇溶液，以二氯甲烷作為空白對照，測定其吸光度.由回歸方程計算樣品溶液中檸檬苦素的含量.

1.5.5 數(shù)據(jù)處理

通過Excel 和SPSS 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計檢驗和顯著性分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 氮素對生物量的影響

硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比對生物量的影響見表1.在3 種不同的硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比下，印楝愈傷組織和懸浮細(xì)胞中的生物量均隨硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比的增加而增加，并在硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比為4∶1 時達(dá)到最大，分別為35.85,g/L和92.13,g/L.硝態(tài)氮含量增加的同時培養(yǎng)系統(tǒng)中的氮素含量也增加，而氮素的增加有利于生物量的增加.這與Rodrigues 等[15]所報道高氮素增加了生物量的結(jié)果相同.

表1 硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比對生物量的影響(n＝3)Tab.1 Effect of the ratio of nitrate to ammonium on the biomass of Azadirachta indica A.Juss (n＝3)

同時，由表1 也可以看出：在3 種不同硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比的情況下，懸浮細(xì)胞的生物量兩兩間有顯著性差異；但是愈傷組織的生物量，在硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比為2∶1 和3∶1 時沒有顯著性差異.這可能是由于印楝細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)時，有利于細(xì)胞對氧的吸收，有利于細(xì)胞的新陳代謝，從而有利于細(xì)胞的生長.溶氧量對細(xì)胞生物量的影響在多種文獻(xiàn)中[15-16]也有報道.

2.2 氮素對可溶性蛋白含量的影響

如表2 所示，在3 種不同的硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比下，印楝愈傷組織中的可溶性蛋白含量隨硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比的增加而增加，在硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比為4∶1 時達(dá)到最大(12.67,mg/g)，但在硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比為3∶1 和4∶1 時，二者的可溶性蛋白含量幾乎相同，并沒有顯著性差異.

印楝懸浮細(xì)胞中的可溶性蛋白隨硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比的增加而先升高再降低，在硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比為3∶1 時達(dá)到最大(10.18,mg/g).并且，在硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比為4∶1 的懸浮細(xì)胞中的可溶性蛋白比2∶1 的少，但也沒有顯著性差異.

表2 硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比對可溶性蛋白含量的影響(n＝3)Tab.2 Effect of the ratio of nitrate to ammonium on soluble protein content of Azadirachta indica A.Juss(n＝3)

可溶性蛋白質(zhì)是植物所有蛋白質(zhì)組分中最活躍的一部分，包括各種酶源、酶分子和代謝調(diào)節(jié)物[17].硝酸鹽含量的增加，可能刺激了印楝愈傷組織中代謝酶的活性，從而使得硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比為3∶1 和4∶1 的愈傷組織中可溶性蛋白含量提高.但是，同種植物不同組織的生物特性也不盡相同，因此，即使都是由幼葉產(chǎn)生的在相同氮素比例下的愈傷組織和懸浮細(xì)胞，二者中的可溶性蛋白變化趨勢不同，含量也不同.

2.3 氮素對印楝素含量的影響

在3 種不同的硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比下，印楝愈傷組織中的印楝素含量隨硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比的增加而增加，并在硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比為4∶1 時達(dá)到最大(37.55,μg/g，以鮮質(zhì)量計)，硝態(tài)氮的增加提高了代謝物印楝素的含量(表3)，這與Prakash 等[6]所報道的硝酸鹽有利于印楝素的積累結(jié)果相似.但是，印楝懸浮細(xì)胞中的印楝素含量卻是隨著硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比的增加而先升高再降低，在硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比為3∶1 時達(dá)到最大(35.61,μg/g，以鮮質(zhì)量計)，這與Sujanya 等[7]所報道的當(dāng)硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比為3∶1 時胞內(nèi)印楝素含量達(dá)到最大的結(jié)果相近.

由印楝素在愈傷組織中的遞增變化以及在懸浮細(xì)胞中先增后減的變化結(jié)果可以看出，相同的誘導(dǎo)源，不同的印楝組織細(xì)胞，其生理特性也不同.這與Kumar 等[18-19]所報道的生理特性和環(huán)境因素影響印楝組織中的印楝素含量結(jié)果相一致.

表3 硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比對印楝素含量的影響(n＝3)Tab.3 Effect of the ratio of nitrate to ammonium on azadirachtin content of of Azadirachta indica A.Juss (n＝3)

2.4 氮素對檸檬苦素含量的影響

如表4 所示，在3 種不同的硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比下，印楝愈傷組織中的檸檬苦素含量隨硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比的增加而增加，并在硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比為4∶1 時達(dá)到最大(116.10,μg/g，以鮮質(zhì)量計)，而在懸浮細(xì)胞中的檸檬苦素含量卻隨著硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比的增加而先升高再降低，在硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比為3∶1 時達(dá)到最大(123.20,μg/g，以鮮質(zhì)量計).但是，無論在愈傷組織中還是在懸浮細(xì)胞中，印楝素含量與檸檬苦素含量表現(xiàn)出同樣的變化趨勢，并且在各個不同的硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比下，印楝素含量總保持低于檸檬苦素含量水平，并呈正相關(guān)，這由印楝素屬于一種檸檬苦素類物質(zhì)[20]的性質(zhì)決定.

表4 硝態(tài)氮與銨態(tài)氮物質(zhì)的量比對檸檬苦素含量的影響(n＝3)Tab.4 Effect of the ratio of nitrate to ammonium on limonoid content of of Azadirachta indica A.Juss(n＝3)

盡管培養(yǎng)物中可溶性蛋白含量與印楝素和檸檬苦素含量的變化趨勢相同，但同樣的可溶性蛋白含量，在愈傷組織和懸浮細(xì)胞中卻表現(xiàn)出不同的變化趨勢.在愈傷組織中表現(xiàn)出遞增趨勢，而在懸浮細(xì)胞中表現(xiàn)出先升后降的趨勢，這可能與其組織中相關(guān)代謝酶的活性變化有關(guān)[21].

3 結(jié)論

［1］Prakash G，Bhojwani S S，Srivastava A K.Production of azadirachtin from plant tissue culture：State of the art and future prospects[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering，2002，7(4)：185-193.

［2］楊國榮.印楝固體組織培養(yǎng)條件及對印楝素含量的影響[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

［3］Plata N，Islam I K，Jayram S.Effect of methyl jasmonate and pcoumaric acid on anthocyanin composition in a sweet potato cell suspension culture[J].Biochemical Engineering Journal，2003，14(3)：171-177.

［4］曹翠玲，李生秀，苗芳.氮素對植物某些生理生化過程影響的研究進(jìn)展[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999，27(4)：96-101.

［5］Malagoli M，Canal A D，Quaggiotti S.Differences in nitrate and ammonium uptake between Scots pine and European larch[J].Plant and Soil，2000，221：1-3.

［6］Prakash G，Srivastava A K.Statistical media optimization for cell growth and azadirachtin production in Azadirachta indica(A.Juss)suspension cultures[J].Process Biochemistry，2005，40(12)：3795-3800.

［7］Sujanya S，Debi B P，Sai I.In vitro production of azadirachtin from cell suspension cultures of Azadirachta indica[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2008，33(1)：113-120.

［8］Murashige T，Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture[J].Physiologia Plantarum，1962，15(3)：473-497.

［9］Singh M，Chaturvedi R.Statistical optimization of media for enhanced azadirachtin production from redifferentiated zygotic embryo cultures of neem(Azadirachta indica A.Juss.)[J].In Vitro Cellular &Developmental Biology Plant，2012，48(1)：92-98.

［10］Raval K N，Hellwig S，Prakash G，et al.Necessity of a two-stage process for the production of azadirachtinrelated limonoids in suspension cultures of Azadirachta indica[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2003，96(1)：16-22.

［11］鄧麗莉，潘曉倩，生吉萍，等.考馬斯亮藍(lán)法測定蘋果組織微量可溶性蛋白含量的條件優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2012，33(24)：185-189.

［12］古炳明，曾寶，熊藝花，等.紫外-可見分光光度法測定巴豆中可溶性蛋白的含量[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2013，42(8)：43-45.

［13］Srivastava S，Srivastava A K.In vitro azadirachtin production by hairy root cultivation of Azadirachta indica in nutrient mist bioreactor[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2012，166：365-378.

［14］Yaylayan V A，Dai Jianming，Raghavan G S V.Extraction and colorimetric determination of azadirachtinrelated limonoids in neem seed kernel[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47(1)：3738-3742.

［15］Rodrigues M，F(xiàn)estucci-Buselli R A，Silva L C.Azadirachtin biosynthesis induction in Azadirachta indica A.Juss cotyledonary calli with elicitor agents[J].Brazilian Archives of Biology and Technology，2014，57(2)：155-162.

［16］Prakash G，Srivastava A K.Azadirachtin production in stirred tank reactors by Azadirachta indica suspension culture[J].Process Biochemistry，2007，(42)：93-97.

［17］蔡柏巖，葛菁萍，祖?zhèn)?施磷水平對不同基因型大豆葉片及子?？扇苄缘鞍缀康挠绊慬J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2007，13(6)：1185-1188.

［18］Kumar J，Parmar B S.Neem oil content and its key chemical constituents in relation to the agroclimatic factors and regions of India[J].Pestic Res，1997(9)：216-225.

［19］de Carvalho D C，da Silva A L L，Schuck M R.Fox grape cv.Bord?(Vitis labrusca L.)and grapevine cv.Chardonnay(Vitis vinifera L.)cultivated in vitro under different carbohydrates，amino acids and 6-Benzylaminopurine levels [J].Brazilian Archives of Biology and Technology，2013，56 (2)：191-201.

［20］Siddiqui S，Siddiqui B S，F(xiàn)aizi S.Tetracyclic triterpenoids and their derivatives from Azadirachta indica[J].Journal of Natural Products，1988，51(1)：30-43.

［21］王凌健，方欣，楊長青，等.植物萜類次生代謝及其調(diào)控植物萜類次生代謝及其調(diào)控[J].中國科學(xué)：生命科學(xué)，2013，43(12)：1030-1046.