韓永成，劉 偉，陳 寧，崔永霞，黃麗杰

河南中醫(yī)學(xué)院分析測(cè)試中心，鄭州 450008

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb 的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花［1］。金銀花含有綠原酸、咖啡酸、異綠原酸、阿魏酸、木犀草苷、蘆丁、金絲桃苷、忍冬苷、槲皮素等成分［2］?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究證明其具有廣譜抗菌、解熱消炎作用，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較多［3-5］。

目前，同時(shí)測(cè)定金銀花中有機(jī)酸和黃酮類(lèi)含量的文獻(xiàn)報(bào)道較少，且測(cè)定金銀花中有效成分主要采用HPLC 法［1］，但未見(jiàn)UHPLC 法的研究報(bào)道。超高效技術(shù)與傳統(tǒng)的采用5.0 μm 顆粒度的色譜柱填料的HPLC 技術(shù)相比能獲更高的柱效，且在更寬的線速度范圍內(nèi)柱保持恒定，因而有利于提高流動(dòng)相速度，縮短分析時(shí)間，提高分析通量;使新型液相色譜的峰容量、分析效率、靈敏度較常規(guī)HPLC 有了很大的提高，可為復(fù)雜體系的分離分析提供良好的平臺(tái)［6］。2010 版《中國(guó)藥典》僅以綠原酸和木犀草苷為指標(biāo)評(píng)價(jià)金銀花質(zhì)量，為了更好地控制金銀花的質(zhì)量及綜合評(píng)價(jià)金銀花的整體質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)研究UHPLC 法同時(shí)測(cè)定金銀花中的綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C。

1 儀器與試藥

Agilent1290 UHPLC 超高效液相色譜儀(1290二元梯度泵、1260DAD 檢測(cè)器)(美國(guó)Agilent 公司);色譜乙腈(美國(guó)天地試劑公司);市售純凈水;其他試劑均為分析純。綠原酸對(duì)照品(批號(hào):110753-200212)，蘆丁(批號(hào):100080-200707)，木犀草苷(批號(hào):111520-200201)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，含量≥98%;異綠原酸A(批號(hào):MUST-09061601)，異綠原酸B(批號(hào):MUST-09061602)，異綠原酸C(批號(hào):MUST-09061603)均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，含量均≥98%。實(shí)驗(yàn)所需藥材，采自于不同產(chǎn)地的金銀花，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院董誠(chéng)明教授鑒定為金銀花:忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb 的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Agilent ZORBAX RH C18(50 mm × 2.1 mm，1.8 μm)，流動(dòng)相為0.2% 磷酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序:0～2 min，13% B;2～3.1 min，13%～25%B;3.1～8 min，25% B;流速0.2 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量0.5 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 對(duì)照品適量分別置50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，制成綠原酸39.6 μg/mL、蘆丁46.2μg/mL、木犀草苷40.0 μg/mL、異綠原酸A 44.6 μg/mL、異綠原酸B 38.9 μg/mL、異綠原酸C 36.8 μg/mL 的溶液;精密取40.0 μg/mL 木犀草苷、44.6 μg/mL 異綠原酸A、36.8 μg/mL 異綠原酸C 1mL 分別置10mL 容量瓶中，70%乙醇定容;分別取以上標(biāo)品母液1mL 混合，作為混合對(duì)照品。密封存放于4 ℃冰箱中備用，臨用時(shí)需用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取金銀花粉末0.25 g，置具塞150 mL 錐形瓶中，精密加70%乙醇30 mL，超聲(功率250W，頻率35KHZ)提取45 min，放冷，抽濾，用70%乙醇洗滌濾紙，合并濾液，置50 mL 棕色容量瓶定容。臨用時(shí)需用0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別取“2.2”項(xiàng)下的綠原酸39.6 μg/mL、蘆丁46.2 μg/mL、木犀草苷4.0 μg/mL、異綠原A 4.5 μg/mL、異綠原酸B 38.9 μg/mL、異綠原酸C 3.7 μg/mL 標(biāo)品溶液，分別以0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μL 進(jìn)樣量進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回歸方程和線性范圍Table 1 Regression equations and linear ranges of the 5 investigated components

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2”混合對(duì)照品溶液，以0.5 μL 進(jìn)樣量，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算得綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 峰面積的RSD 分別為0.13%、0.14%、0.15%、0.20%、0.16%、0.18%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取封丘賈莊金銀花樣品，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定峰面積，結(jié)果綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 峰面積的RSD分別為0.57%、0.42%、0.45%、0.51%、0.46%、0.37%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批金銀花樣品(封丘賈莊)精密稱(chēng)取0.25 g(6 份)，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，測(cè)定樣品中綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 的含量，測(cè)得質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 分別為為0.34%、0.42%、1.05%、0.87%、1.01%、1.12%，表明重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的金銀花(封丘賈莊)6 份，精密稱(chēng)取0.125 g，精密加入一定量對(duì)照組分，其余按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品，作為加樣回收供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 的平均回 收 率 分 別 為 98.99%、98.90%、98.43%、96.88%、99.16%、97.35%;RSD 分別為0.49%、0.23%、0.30%、0.56%、0.35%，1.06%(n=6)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 2 Results for recovery tests (n=6)

注:樣品加入46.2 μg/mL 蘆丁標(biāo)品溶液4.000 mL，加入量40.0 μg/mL 木犀草苷標(biāo)品溶液0.475 mL，加入量44.6 μg/mL 異綠原酸A 標(biāo)品溶液0.750 mL，揮干后再處理。Note:4.000 mL of rutin standard solution (46.2 μg/mL)，0.475 mL of luteoloside standard solution (40.0 μg/mL)and 0.750 mL of 3，5-O-dicaffeoylquinic acid standard solution (44.6 μg/mL)were added into the sample solution.Processed after volatilizing to dryness.

2.9 樣品測(cè)定

取不同產(chǎn)地金銀花樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各樣品中綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 的含量，結(jié)果見(jiàn)表3 和圖1、2。

表3 不同產(chǎn)地金銀花中綠原酸和木犀草苷含量測(cè)定結(jié)果(n=3，mg/g)Table 3 content determination results of chlorogenic acid and luteoloside(n=3，mg/g)

圖1 混合標(biāo)品(A)及金銀花供試品(B)的UHPLC 色譜圖Fig.1 UHPLC chromatograms of mixed standards (A)and L.japonica sample (B)

3 討論

3.1 提取溶劑的考察

對(duì)于藥材中綠原酸和木犀草苷的提取，2010 版《中國(guó)藥典》金銀花項(xiàng)下綠原酸提取采用50%甲醇，木犀草苷提取則采用70%乙醇，本試驗(yàn)采用50%乙醇、50%甲醇、70%乙醇、70%甲醇提取進(jìn)行單因素考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用70%乙醇作為溶劑提取的綠原酸、木犀草苷及六種有效成分總含量較高。

3.2 流動(dòng)相的考察

分別考察了甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水不同比例的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果表明采用乙腈-0.2%磷酸水進(jìn)行梯度洗脫，分離度和峰型均較好。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的考察

2010 版《中國(guó)藥典》綠原酸和木犀草苷分別以327、350 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)，而異綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)為330 nm，蘆丁在350 nm 處有較大吸收。綠原酸在350 nm 處吸收值是327 nm 吸收值的80%左右，而木犀草苷在327 nm 處吸收值比350 nm 處低20%左右。由于金銀花中綠原酸含量較木犀草苷及蘆丁等成分的含量較高，在色譜圖的3D 圖譜中以上各有效成分在350 nm 處都有較好吸收，因此本實(shí)驗(yàn)選擇350 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 UHPLC 與HPLC 的比較

UHPLC 較HPLC 峰容量、靈敏度、分析速度和檢測(cè)限都有了很大的提高。采用UHPLC，在8 min內(nèi)完成對(duì)金銀花中綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 含量測(cè)定，而HPLC測(cè)定其中的幾個(gè)成分需要60 min 左右完成測(cè)試［7，8］。采用UHPLC 代替HPLC，在保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，提高了分析效率，節(jié)約了大量的分析時(shí)間，減少了溶劑的消耗，降低分析成本［9］。但UHPLC 的色譜柱柱子成本相對(duì)常規(guī)色譜柱較高。

3.5 結(jié)果分析

由測(cè)定結(jié)果可以看出，不同產(chǎn)地綠原酸和木犀草苷含量相差較大，綠原酸以新鄉(xiāng)、封丘及平邑產(chǎn)地含量相對(duì)較高，而禹州和商丘的含量比較低;木犀草苷以新鄉(xiāng)、封丘和平邑含量較高;有效成分的總含量也是以封丘和平邑的較高;所以可初步確定封丘和山東平邑產(chǎn)的金銀花質(zhì)量較好，可以以此產(chǎn)地為GAP 考察目標(biāo)，分析其生長(zhǎng)環(huán)境，以此規(guī)范種植金銀花提高其質(zhì)量。

本實(shí)驗(yàn)建立UHPLC 法同時(shí)檢測(cè)金銀花綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 的含量，在此色譜條件下所測(cè)成分分離完全，該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，分析速度快且重現(xiàn)性較好，可為金銀花的質(zhì)量控制研究提供新的分析方法和科學(xué)依據(jù)。

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