張 斌，劉 瑩，王 益，王延鋒，黃 文*

1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，武漢 430070;2 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院，牡丹江 157041

金針菇(Flammulina velutipes)隸屬真菌門(mén)，層菌綱，傘菌目，口磨科，金錢(qián)菌屬，是一種藥食兩用菌。金針菇具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等活性，被認(rèn)為具有很高的藥用價(jià)值，多糖為其中的一種重要活性成分。許多學(xué)者對(duì)金針菇子實(shí)體多糖和菌絲體多糖的提取工藝、結(jié)構(gòu)特征和功能活性進(jìn)行了研究［1］，而對(duì)金針菇菌渣中多糖的研究卻很少。金針菇菌(F.velutipes Residue)即收獲金針菇子實(shí)體后剩下的廢料，其中含有一些菌絲體生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物，多糖為其中的一種。我國(guó)是世界上食用菌生產(chǎn)大國(guó)［2］，目前我國(guó)產(chǎn)量已占有世界總產(chǎn)量的70%左右，其中金針菇是我國(guó)栽培數(shù)量最多的食用菌之一。我國(guó)工廠化栽培金針菇近二十年，目前全國(guó)金針菇日產(chǎn)量在400噸左右，每年產(chǎn)生的菌渣至少有400 萬(wàn)噸［3］。菌渣已成為數(shù)量十分可觀的重要資源。然而，每年大量的菌渣，除少量被用作飼料和再栽培外［4］，大部分當(dāng)作廢料被浪費(fèi)掉。鑒于此，本文采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化微波輔助提取金針菇菌渣中多糖的工藝，并研究其體外抗氧化活性，旨在為金針菇菌渣的有效利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金針菇菌渣來(lái)自湖北省武漢市;DPPH、ABTS 購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司;維生素C 購(gòu)于上海琳帝化工有限公司;石油醚、苯酚、無(wú)水乙醇、濃硫酸、氯仿、無(wú)水乙醇等均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-2450 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海亞研電子有限公司;Avanti J-E 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter 公司;HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海申勝生物科技有限公司;RE-2000 A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;D8023CSL-K4 微波爐，廣州格蘭仕有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金針菇菌渣多糖的制備工藝

金針菇菌渣60 ℃烘干后粉碎過(guò)60 目篩子，用石油醚(30～60℃)脫脂后，烘干備用。稱取備用的菌渣干粉5.0 g，加適量蒸餾水，在微波下作用一定時(shí)間后，將樣品于10000 rpm 離心10 min，濾液適當(dāng)濃縮，加入適量體積的無(wú)水乙醇，混勻，置4℃冰箱中過(guò)夜，取出后抽濾，所得沉淀用無(wú)水乙醇、氯仿、無(wú)水乙醚反復(fù)洗滌3 次，冷凍干燥得到粗多糖。

1.2.2 菌渣多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定菌渣中多糖的含量［5］。根據(jù)試驗(yàn)所得回歸方程y=0.0131x+0.0143，R2=0.9985 計(jì)算樣品多糖的含量，從而得到每個(gè)試驗(yàn)組菌渣中多糖得率。多糖得率/%=(多糖含量g/菌渣質(zhì)量g)×100%

1.2.3 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)選取微波時(shí)間、微波功率和料液比三個(gè)因素，各因素選取五個(gè)水平，如表1 所示。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)的因素及水平Table 1 Levels and factors for single factor experiments

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface analysis

1.2.5 對(duì)比試驗(yàn)

分別采用微波輔助法與熱水浸提法進(jìn)行金針菇菌渣中多糖的提取試驗(yàn)，比較兩種方法對(duì)金針菇菌渣中多糖得率的影響。

1.2.6 金針菇菌渣中多糖的抗氧化活性的研究

分別測(cè)定了金針菇菌渣中多糖的還原能力［6］、清除ABTS+自由基的能力［7］和清除羥自由基的能力［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 金針菇菌渣多糖提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 微波時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

在微波功率640 W，料液比1∶30 的條件下，考察不同微波時(shí)間對(duì)菌渣中多糖得率的影響，結(jié)果如圖1 所示。120 s 之前菌渣多糖得率隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)不斷提高，在120 s 時(shí)達(dá)到最大。120 s 之后，微波時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，樣品中積蓄的能力過(guò)多，可能導(dǎo)致多糖的水解，從而多糖得率下降。因此選擇120 s 為最佳微波時(shí)間。

圖1 微波時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.1 The effect of microwave time on yield of polysaccharide

2.1.2 微波功率對(duì)多糖得率的影響

在微波時(shí)間120 s，料液比為1∶30 的條件下，考察不同微波功率對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果如圖2 所示。隨著微波功率的增大，多糖得率提高，當(dāng)微波功率為640 W 時(shí)，多糖得率最大;但隨著微波功率的繼續(xù)增大，多糖得率反而下降。這可能是由于微波功率在一定范圍內(nèi)時(shí)，隨著微波功率的增大，提取體系吸收的能量增加，分子運(yùn)動(dòng)加劇，溶出物增加，多糖得率提高;但微波功率過(guò)大時(shí)，會(huì)引起體系局部高溫，破壞多糖結(jié)構(gòu)，得率下降［9］。故選擇640 W 為最佳微波功率。

圖2 微波功率對(duì)多糖得率的影響Fig.2 The effect of microwave power on yield of polysaccharide

2.1.3 料液比對(duì)多糖得率的影響

在微波時(shí)間120 s，微波功率640 W 時(shí)，考察料液比對(duì)菌渣中多糖得率的影響，結(jié)果如圖3 所示。隨著料液比的增大，菌渣中多糖得率逐漸提高，料液比為1∶25 時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值;料液比再增加，多糖得率基本保持不變。這說(shuō)明一定范圍內(nèi)的料液比的增大有利于多糖溶出，當(dāng)料液比達(dá)到一定值時(shí)，多糖的溶出量已經(jīng)達(dá)到最大限度，此時(shí)料液比繼續(xù)增大，對(duì)多糖得率影響不大。而且過(guò)大的料液比造成能源和資源的浪費(fèi)，且不利于下一步試驗(yàn)的進(jìn)行［10］。

圖3 料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.3 The effect of solid-to-liquid ratio on yield of polysaccharide

2.2 金針菇菌渣多糖提取響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型的建立與分析

在單因素的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步確定影響多糖得率的主次因素及其因素之間的交互作用。根據(jù)Box-Behnken 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了微波時(shí)間、微波功率和料液比的三因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn)，方案和結(jié)果如表3 所示。

表3 三因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 3 Three factors and three levels of central composite experiment scheme and results

應(yīng)用軟件Design Expert 8.0 對(duì)表3 的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立了三元二次響應(yīng)面回歸方程:Y=-12.26625+0.085858A+0.031700B+0.33225C-1.30208E-005AB-1.66667E-004AC+1.46875E-004BC-3.15556E-004A2-2.52539E-005B2-7.96000E-003C2。

由回歸模型數(shù)據(jù)分析得到，微波輔助提取菌渣多糖的最佳工藝為微波時(shí)間115.34 s，微波功率673.10 W，料液比1∶25.88，多糖得率的預(yù)測(cè)值為7.65%。考慮到實(shí)際的試驗(yàn)操作條件，將提取工藝修正為微波時(shí)間115 s，微波功率640 W，料液比1∶26。在此條件下，試驗(yàn)三次取平均值得菌渣多糖得率為7.53%，與預(yù)測(cè)值7.65%比較相近。

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance for the developed regression equation

由表4 可以看出，回歸模型極顯著(P＜0.0001)，說(shuō)明回歸方程是可用的;失擬項(xiàng)僅為0.025，而且對(duì)應(yīng)的P=0.1829＞0.05，說(shuō)明所得方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例小;R2=0.9880 說(shuō)明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間有高度的相關(guān)性。綜上得，該回歸方程可用于菌渣中多糖得率的優(yōu)化。由F 值可以得出，影響菌渣多糖得率的各因素的主效關(guān)系為微波功率(B)＞微波時(shí)間(A)＞料液比(C)，其中微波時(shí)間(B)為極顯著，微波功率為顯著，料液比(C)為不顯著。

2.2.2 因素間的交互作用分析

圖4 為由回歸模型得到的響應(yīng)面圖形，反應(yīng)了兩兩因素之間對(duì)多糖得率的交互影響。

圖4 兩因素交互作用對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Response surface plots showing the effect of two factors on yield of polysaccharide

由圖4a 可以看出，微波時(shí)間和微波功率的響應(yīng)面坡度比較陡峭，等高線排列緊密且呈橢圓，說(shuō)明微波功率和微波時(shí)間之間的交互作用明顯。微波功率的等高線比微波時(shí)間的等高線密集，說(shuō)明微波功率的主效大于微波時(shí)間［10］。為了避免過(guò)長(zhǎng)的微波時(shí)間導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)破壞，選擇120 s 左右為最佳時(shí)間段。

由圖4b 可以看出，等高線排列略疏松且橢圓曲率比較小，說(shuō)明料液比和微波時(shí)間之間的交互作用不明顯。由于料液比對(duì)多糖得率的影響比較小，為了方便后續(xù)工作，把料液比選擇在適中水平。

由圖4c 可以看出，等高線排列緊密且呈橢圓，說(shuō)明料液比和微波功率之間的交互作用比較明顯。微波功率的等高線明顯比料液比的等高線密集，說(shuō)明微波功率的主效大于料液比。在微波功率640 W左右和料液比約1∶25 時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值。

綜上得，微波功率的主效最明顯，微波時(shí)間和料液比次之。與回歸模型分析結(jié)果一致。

2.3 兩種方法提取菌渣多糖的對(duì)比試驗(yàn)

微波輔助提取法和熱水浸提法分別提取金針菇菌渣多糖，用苯酚-硫酸法測(cè)定菌渣中多糖含量。

微波輔助提取法參照1.2.1 的論述。

熱水浸提法［11］:料液比1∶20，浸提溫度90 ℃，浸提時(shí)間3 h。

表5 兩種方法的效果比較Table 5 Comparison of two methods

從表5 可以看出，微波輔助提取法的提取時(shí)間僅為115 s，熱水浸提法的提取時(shí)間為3 h，前者明顯比后者費(fèi)時(shí)少，而且微波輔助提取法的多糖得率比熱水浸提的多糖得率提高了15.14%。微波輔助提取法的這些優(yōu)點(diǎn)恰好可以滿足即時(shí)、高效地處理每天產(chǎn)生的大量金針菇菌渣。

2.4 抗氧化能力

2.4.1 還原能力測(cè)定

樣品還原力通過(guò)將Fe3+/K3［Fe(CN)6］轉(zhuǎn)變?yōu)镕e2+的能力測(cè)定，吸光值越大，還原力越強(qiáng)，還原力大小可以間接評(píng)價(jià)樣品抗氧化能力的強(qiáng)弱。金針菇菌渣中多糖的還原力如圖5 所示。

圖5 金針菇菌渣中多糖的還原力Fig.5 The reducing powers of polysaccharides from F.velutipes residue

由圖5 可知，一定濃度范圍內(nèi)，隨著多糖濃度的增加，其還原力增強(qiáng)。根據(jù)擬合曲線y=0.006x-0.004，R2=0.998，可以看出在一定濃度范圍內(nèi)，多糖濃度與還原力之間具有一定線性關(guān)系，而且得到菌渣中多糖還原力的IC50值為8.4 mg/mL。在濃度0～10 mg/mL 范圍內(nèi)，菌渣多糖的還原力低于Vc，這可能是由于多糖是大分子物質(zhì)，還原性末端相對(duì)較少。

2.4.2 ABTS+自由基清除能力測(cè)定

ABTS+自由基水溶液呈藍(lán)綠色，在734 nm 處有最大吸收，當(dāng)遇到具有抗氧化活性的物質(zhì)時(shí)則被還原，溶液顏色變淺，吸光值降低，吸光值越小，表明樣品清除ABTS+自由基的能力越強(qiáng)。金針菇菌渣中多糖清除ABTS+自由基能力如圖6 所示。

圖6 金針菇菌渣多糖的ABTS+自由基清除能力Fig.6 ABTS+ radical-scavenging activities of polysaccharides from F.velutipes residue

由圖6 可知，多糖濃度在0～2 mg/mL，ABTS+自由基清除率顯著增大，繼續(xù)增大樣品濃度，清除率增加平緩。根據(jù)擬合曲線y=0.242 In(x)+0.540，R2=0.981，計(jì)算金針菇菌渣中多糖對(duì)ABTS+自由基的IC50值為1.01 mg/mL。在濃度0～6 mg/mL 范圍時(shí)，多糖的清除率略低于Vc 的清除率，繼續(xù)增大濃度，兩者的清除率相當(dāng)，而且都基本接近100%。

2.4.3 羥自由基清除能力測(cè)定

羥自由基是活性很強(qiáng)的自由基，可引起細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致機(jī)體衰老或癌變等。因此，生物體為防御疾病，必須清除羥自由基。金針菇菌渣中多糖清除羥基自由基能力如圖7 所示。

圖7 金針菇菌渣多糖的羥基自由基清除能力Fig.7 OH radical-scavenging activities of polysaccharides from F.velutipes residue

由圖7 可知，多糖濃度在0～4 mg/mL，ABTS+自由基清除率顯著增大，繼續(xù)增大樣品濃度，清除率趨于平緩。根據(jù)擬合曲線y=-0.016x2+0.251x+0.038，R2=0.985，計(jì)算金針菇菌渣多糖對(duì)羥基自由基的IC50值為1.95 mg/mL。在濃度0～4 mg/mL時(shí)，多糖的清除率低于Vc 的清除率，繼續(xù)增大濃度，兩者的清除率相當(dāng)，而且都基本接近100%。

3 結(jié)論

本文采用微波輔助法提取金針菇菌渣中多糖，此方法能夠高效、快速地將多糖物質(zhì)溶出。而且在微波時(shí)間、微波功率和料液比三個(gè)單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，得到提取金針菇菌渣最優(yōu)的工藝參數(shù):微波時(shí)間115 s，微波功率640 W，料液比1∶26。菌渣中多糖得率為7.53%，與預(yù)測(cè)值7.65%接近。

本研究還對(duì)優(yōu)化工藝下提取的多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，測(cè)定了此多糖的還原力、清除ABTS+自由基和清除羥基自由基的能力，多糖對(duì)還原力、ABTS+自由基和羥基自由基的IC50值分別為8.40、1.01 mg/mL 和1.95 mg/mL，且都具有一定得濃度依賴性。此結(jié)果表明金針菇菌渣中多糖具有一定的抗氧化能力，作為一種新的、天然的抗氧化劑具有良好的開(kāi)發(fā)前景。

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