血清m icroRNA?152和m icroRNA?602檢測(cè)在肝癌診斷及手術(shù)療效評(píng)估中的應(yīng)用

周軼冰

（佳木斯市中心醫(yī)院普外科，黑龍江佳木斯154002）

doi：10.3969/j.issn.1672－5565.2015.03.08

血清m icroRNA?152和m icroRNA?602檢測(cè)在肝癌診斷及手術(shù)療效評(píng)估中的應(yīng)用

周軼冰

（佳木斯市中心醫(yī)院普外科，黑龍江佳木斯154002）

為探討microRNA?152和microRNA?602檢測(cè)在肝癌診斷及手術(shù)療效評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)佳木斯市中心醫(yī)院2012年3月～2015年3月的19例肝癌血清標(biāo)本中microRNA?152和microRNA?602的表達(dá)水平，分析microRNA?152和microRNA?602在乙型肝炎病毒（HBV）陽(yáng)性組、HBV陰性組和健康對(duì)照組血清樣本中的表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV陽(yáng)性血清樣本中microRNA?152的表達(dá)水平（0.65±0.29）明顯低于健康組（1.21±0.32），microRNA?602在HBV陽(yáng)性血清樣本中的表達(dá)（0.63±0.31）明顯高于健康組（0.44±0.15），且水平表達(dá)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）?？梢?jiàn)血清樣本中的microRNA?152和microRNA?602可以用于HBV陽(yáng)性肝癌診斷的血清標(biāo)記物，microRNA?152可以用于HBV陽(yáng)性肝癌術(shù)后效果評(píng)價(jià)的血清標(biāo)記物。

HBV；肝癌；MicroRNA?152；MicroRNA?602

肝癌是目前世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率排第三位，多發(fā)于東南亞及非洲。在我國(guó)，肝癌引發(fā)的死亡率占第二位，我國(guó)每年肝癌新發(fā)病例占全世界的55％，尋找有效的肝癌診斷標(biāo)記物，研究肝癌治療手段及評(píng)估手術(shù)治療效果至關(guān)重要。MicroRNA是一類(lèi)小分子核糖核酸，長(zhǎng)度大約20～25個(gè)核苷酸，一個(gè)microRNA可調(diào)節(jié)包括轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子以及受體在內(nèi)的成百上千個(gè)靶基因，這就使得microRNA可以對(duì)細(xì)胞從增殖到分化再到凋亡的整個(gè)生命周期進(jìn)行有效的調(diào)控，還可以參與個(gè)體胚胎發(fā)育的生物學(xué)過(guò)程、機(jī)體代謝的生理過(guò)程以及腫瘤發(fā)生、發(fā)展的生命過(guò)程等［1－2］。

近年來(lái)有很多學(xué)者都致力于microRNA的研究，例如microRNA?18、microRNA?21、microRNA?221、microRNA?122、microRNA?125a、microRNA?150等均在肝癌組織和正常組織中的表達(dá)顯示著明顯的差異性。各種研究表明了microRNA不僅可以作為肝癌早期診斷標(biāo)記物，還可以作為肝癌治療效果評(píng)價(jià)的標(biāo)記物。但是目前大多數(shù)的關(guān)于肝癌相關(guān)microRNA的研究都建立于腫瘤組織標(biāo)本上，由于組織學(xué)腫瘤標(biāo)記物存在標(biāo)本采集受限、無(wú)法連續(xù)檢測(cè)和隨訪(fǎng)跟蹤不便等缺點(diǎn)，不便于在臨床開(kāi)展。

MicroRNA?152和microRNA?602被證明在HBV相關(guān)性肝癌組織中存在異常表達(dá)，而在肝癌患者血清中的表達(dá)尚未明確。本文主要探討microRNA?152 和microRNA?602檢測(cè)在肝癌診斷及手術(shù)療效評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)佳木斯市中心醫(yī)院2012年3月～2015年3月的19例肝癌血清標(biāo)本中microRNA?152和microRNA?602的表達(dá)水平，分析microRNA?152和microRNA?602在HBV陽(yáng)性組、HBV陰性組和健康對(duì)照組血清樣本中的表達(dá)差異［3］。

1 材料與方法

1.1 統(tǒng)計(jì)資料來(lái)源

收集佳木斯市中心醫(yī)院普外科2012年12月～2015年3月經(jīng)病理切片證實(shí)為原發(fā)性肝癌且行手術(shù)切除的19例肝癌患者的血清標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，其中HBV陽(yáng)性11例，HBV陰性8例，男性12例，女性7例，年齡分布在56±4.6。HBV陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組中ALT≤40U·L－1者4例，ALT＞40U·L－1者7例；AFP＜5μg·L－1者8例，AFP≥5μg·L－1者3例；腫瘤大小≥3cm者8例，腫瘤大?。?cm者3例；Ⅰ期2例，Ⅱ期5例，Ⅲ期4例。HBV陰性實(shí)驗(yàn)組中ALT≤40U·L－1者7例，ALT＞40U·L－1者1例；AFP＜5μg·L－1者4例，AFP≥5μg·L－1者4例；腫瘤大小≥3cm者5例，腫瘤大?。?cm者3例；Ⅰ期1例，Ⅱ期3例，Ⅲ期4例。收集15例正常血清樣本作為健康對(duì)照組，男性8例，女性7例，年齡分布在55±9.2，ALT≤40U·L－1者14例，ALT＞40U·L－1者1例；AFP＜5μg·L－1者15例。各組別之間性別、年齡均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。經(jīng)過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本資料的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，HBV?DNA定量、腫瘤大小以及腫瘤分期在HBV陽(yáng)性肝癌患者和HBV陰性肝癌患者的樣本中表達(dá)水平有顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

提取血清中的microRNA，采用熒光定量PCR各實(shí)驗(yàn)組血清樣本中microRNA?152和microRNA?602的表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測(cè)，分析 microRNA?152和microRNA?602在各實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)差異。

1.2 方法

首先用上海拜力生物科技有限公司生產(chǎn)的AM1560試劑盒提取并純化總的microRNA。然后用特殊設(shè)計(jì)的頸環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，通過(guò)RT?PCR技術(shù)將microRNA單鏈逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ) DNA，即cDNA，再以此為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)行DNA擴(kuò)增。最后通過(guò)熒光探針?lè)ǘ縋CR技術(shù)檢測(cè)樣品中 microRNA?152和 microRNA?602的表達(dá)水平［4－6］。提取血清中microRNA的方法如下：

①抽取大約2mL外周血，放入EDTA管內(nèi)，輕輕混勻，是血與管內(nèi)抗凝物質(zhì)充分接觸，防止血細(xì)胞破裂。

②將盛有4mL全血的EDTA管放入4℃冰箱，在2h內(nèi)分離血漿。

③離心10min，將上層液相小心吸出，避免吸取中間白色細(xì)胞層。

④將上層液相轉(zhuǎn)入事先預(yù)冷的1.5mL離心管子，離心10min，以便進(jìn)一步分離血漿和血細(xì)胞。

⑤將第三步離心以后得到的血漿，以500μL的體積分裝，并轉(zhuǎn)入－80℃冰箱長(zhǎng)期保存。

⑥使用AM1560試劑盒提取microRNA，具體操作方法見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

⑦使用紫外分光光度儀ZF型測(cè)定microRNA的濃度和純度，具體操作方法見(jiàn)說(shuō)明書(shū)［7－9］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析［10］，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的年齡、AFP、HBV?DNA等定量臨床參數(shù)采用非配對(duì)t檢驗(yàn)來(lái)確定組間差異，使用均數(shù)x－±s表示，各實(shí)驗(yàn)組間microRNA?152和microRNA?602表達(dá)水平的差異顯著性使用U檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有P均為雙側(cè)［11］。

2 結(jié)果分析

利用熒光定量PCR對(duì)健康對(duì)照組和HBV陽(yáng)性肝癌患者術(shù)前、術(shù)后的血清樣本進(jìn)行microRNA?152 和microRNA?602的定量檢測(cè)和分析，RT－PCR電泳圖見(jiàn)圖1和圖2。

實(shí)驗(yàn)表明：（1）microRNA?152在HBV陽(yáng)性肝癌患者術(shù)前實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)明顯低于其在健康對(duì)照組中的表達(dá)（t＝3.75，P＝0.001），也明顯低于術(shù)后實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)（t＝3.92，P＝0.003），且差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；（2）microRNA?602在HBV陽(yáng)性肝癌患者術(shù)前實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)明顯高于其在健康對(duì)照組中的表達(dá)（t＝3.13，P＝0.002），其術(shù)后實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)也要高于健康對(duì)照組中的表達(dá)（t＝3.47，P＝0.001），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)圖3和圖4。

圖1 MicroRNA?152在HBV陽(yáng)性肝癌實(shí)驗(yàn)組中的RT?PCR電泳圖Fig1. MicroRNA?152 in HBV positive liver cancer rt?pcr electrophoresis figure in experimental group

圖2 MicroRNA?602在HBV陽(yáng)性肝癌實(shí)驗(yàn)組中的RT?PCR電泳圖Fig2 MicroRNA?602 in HBV positive liver cancer rt?pcr electrophoresis figure in experimental group

圖3 MicroRNA?152在HBV陽(yáng)性肝癌各實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)情況Fig.3 MicroRNA?152 in HBV positive expression in the experimental group of liver cancer

圖4 MicroRNA?602在HBV陽(yáng)性肝癌各實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)情況Fig.4 MicroRNA?602 in HBV positive expression in the experimental group of liver cancer

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)健康對(duì)照組和HBV陰性肝癌患者術(shù)前、術(shù)后的血清樣本進(jìn)行microRNA?152和 microRNA?602的定量檢測(cè)和分析，RT?PCR電泳圖見(jiàn)圖5和圖6。

實(shí)驗(yàn)表明：（1）MicroRNA?152在HBV陰性肝癌患者在術(shù)前實(shí)驗(yàn)組與健康對(duì)照組中的表達(dá)沒(méi)有顯著差異（t＝2.03，P＝0.07），術(shù)后實(shí)驗(yàn)組與健康對(duì)照組中的表達(dá)也沒(méi)有顯著差異（t＝2.32，P＝0.09），都不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；（2）MicroRNA?602在HBV陰性肝癌患者在術(shù)前實(shí)驗(yàn)組與健康對(duì)照組中的表達(dá)沒(méi)有顯著差異（t＝2.18，P＝0.12），術(shù)后實(shí)驗(yàn)組與健康對(duì)照組中的表達(dá)也沒(méi)有顯著差異（t＝2.09，P＝0.11），都不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)圖7和圖8。

圖5 MicroRNA?152在HBV陰性肝癌實(shí)驗(yàn)組中的RT?PCR電泳圖Fig.5 MicroRNA?152 in HBV negative liver cancer rt?pcr electrophoresis figure in experimental group

圖6 MicroRNA?152在HBV陰性肝癌實(shí)驗(yàn)組中的RT?PCR電泳圖Fig.6 MicroRNA?602 in HBV negative liver cancer rt?pcr electrophoresis figure in experimental group

圖7 MicroRNA?152在HBV陰性肝癌各實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)情況Fig.7 MicroRNA?152 in HBV negative expression in the experimental group of liver cancer

圖8 MicroRNA?602在HBV陰性肝癌各實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)情況Fig.8 MicroRNA?602 in HBV negative expression in the experimental group of liver cancer

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，HBV陽(yáng)性肝癌患者手術(shù)前血清樣本中microRNA?152的表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照組和手術(shù)后血清樣本中的表達(dá)水平，但microRNA?152 在HBV陰性肝癌患者術(shù)前、術(shù)后以及健康對(duì)照組的血清樣本中沒(méi)有顯著性差異，已有研究表明microRNA主要來(lái)源于細(xì)胞分泌，而HBV感染會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞中microRNA?152的表達(dá)水平明顯下調(diào)，所以HBV陽(yáng)性肝癌患者血清中microRNA?152表達(dá)水平顯著降低的主要原因在于HBV感染后抑制了肝細(xì)胞中microRNA?152的表達(dá)水平，從而抑制了細(xì)胞的主動(dòng)分泌功能，導(dǎo)致肝癌血清中microRNA?152的表達(dá)水平下調(diào)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，microRNA?152在肝癌患者術(shù)后血清樣本中的表達(dá)水平顯著高于術(shù)前血清樣本中的表達(dá)水平，這主要因?yàn)?，?shí)驗(yàn)所選的術(shù)后血清樣本都在手術(shù)后2日內(nèi)完成，手術(shù)對(duì)肝細(xì)胞造成的損傷還沒(méi)有恢復(fù)，可能導(dǎo)致肝細(xì)胞中microRNA?152漏入血液中，從而導(dǎo)致了術(shù)后血清樣本中microRNA?152的表達(dá)水平顯著升高。由于實(shí)驗(yàn)條件有限，無(wú)法進(jìn)行大樣本量的實(shí)驗(yàn)，為了能夠更加深入的研究microRNA?152的機(jī)制，還需要長(zhǎng)期跟蹤隨訪(fǎng)，進(jìn)行大樣本量的長(zhǎng)期研究。

該研究還表明，microRNA?602在HBV陽(yáng)性肝癌患者術(shù)前和術(shù)后血清樣本中的表達(dá)水平都顯著高于健康對(duì)照組血清樣本中的表達(dá)水平，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），但microRNA?602在術(shù)前與術(shù)后血清樣本中的表達(dá)無(wú)顯著性差異。我們還發(fā)現(xiàn)microRNA?602在血清樣本中的表達(dá)水平在早期已經(jīng)出現(xiàn)升高，有可能是由于microRNA?602在損傷早期，尚未有形態(tài)學(xué)上的變化之前，已經(jīng)通過(guò)某種機(jī)制由肝細(xì)胞轉(zhuǎn)移到血液循環(huán)。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)［12－15］，microRNA?602在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織中的表達(dá)水平，雖然研究的樣本類(lèi)型不同，但是研究結(jié)果都指示了microRNA?602可能成為一種新的用于HBV陽(yáng)性肝癌早期診斷的血清標(biāo)記物，而microRNA?602在兩種不同樣本中表達(dá)之間的聯(lián)系還有待我們進(jìn)一步的研究。

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)在 HBV陽(yáng)性肝癌患者術(shù)前血清樣本中microRNA?152和microRNA?602存在表達(dá)異常的現(xiàn)象，在HBV陽(yáng)性肝癌患者術(shù)前和術(shù)后血清樣本中microRNA?152的表達(dá)也有顯著性的差異，這些研究表明了microRNA?152和microRNA?602可以用于HBV陽(yáng)性肝癌早期診斷的血清標(biāo)記物，而且microRNA?152也有成為一種重要的HBV陽(yáng)性肝癌手術(shù)治療效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)，但是microRNA?152和microRNA?602在肝臟細(xì)胞中并不具有特異性，它們能否如該研究預(yù)期的一樣，成為HBV陽(yáng)性肝癌早期診斷的血清標(biāo)記物還有待更進(jìn)一步的證實(shí)，尤其microRNA?152在術(shù)前和術(shù)后血清樣本中差異表達(dá)的確切機(jī)制更加需要大量樣本的研究。

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Study on the expression and diagnostic significance ofm icroRNA?152 and microRNA?602 in hepatocellular carcinoma

ZHOU Yibing
（Jiamusi Center Hospital General Surgery，Heilongjiang Jiamusi 154002，China）

To explore the application value ofmicroRNA?152 and microRNA?602in the diagnosis of liver cancer and evaluation of therapeutic effects.The serum microRNA was extracted，and the levels of circulatingmicroRNA?152 and microRNA?602 were quantified by real?time quantitative RT?PCR.Expression differences ofmicroRNA?152 and microRNA?602 were analyzed in every experimental groups.Results show the expression level of the HBV positive hepatocellular carcinomamicroRNA?152 was significantly lower than that in the healthy group（p＜0.05），while the expression level of microRNA?602 was higher than that in the healthy group（p＜0.05）.It is speculated that microRNA?152 and microRNA?602may be employed as novel serum markers for the diagnosis of HBV?positive liver cancer and microRNA?152 may be employed as novel serum markers for the evaluation of therapeutic effect.

Hepatitis B Virus；Hepatocellular Carcinoma；MicroRNA?152；MicroRNA?602

A

1672－5565（2015）03－192－06

2015－05－12；

2015－07－14.

周軼冰，男，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤的血清標(biāo)記物；E?mail：ttabb1021＠163.com.