崔明華，李龍珠，劉家軍，張 梅，郭俐宏，彭吉霞*

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桂枝茯苓丸對子宮內膜異位癥模型大鼠血管內皮生長因子表達的影響

崔明華1，李龍珠2a，劉家軍2b，張 梅2a，郭俐宏3，彭吉霞3*

目的 采用皮下移植自體子宮內膜組織的方法建立大鼠子宮內膜異位癥模型，觀察桂枝茯苓丸對大鼠子宮內膜異位癥模型血管內皮生長因子表達的影響。方法 50只大鼠隨機分為空白對照、模型組、米非司酮組、桂枝茯苓丸A、B組，其中模型組、米非司酮組及桂枝茯苓丸A、B組均制作大鼠子宮內膜異位癥模型。術后桂枝茯苓丸A、B組用桂枝茯苓丸灌胃治療21 d，米非司酮組灌陽性藥米非司酮，空白對照組及模型組灌等體積生理鹽水。采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定大鼠子宮內膜組織VEGF及mRNA、低氧誘導因子-1α(HIF-1α)及HIF-1 mRNA表達，測定血清雌二醇(E2)及白介素-8(IL-8)水平，免疫組織化學法檢測細胞增殖核抗原(PCNA)、雌激素受體(ERα)。結果 桂枝茯苓丸A、B組VEGF及mRNA、HIF-1α及HIF-1 mRNA在子宮內膜組織上表達下調，E2、IL-8水平及PCNA、ERα表達量均明顯降低，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 桂枝茯苓丸可抑制模型大鼠異位內膜的生長與血管生成，減輕子宮內膜異位癥血管內皮炎癥反應，對實驗性大鼠子宮內膜異位癥有治療作用。

桂枝茯苓丸；子宮內膜異位癥模型；血管內皮生長因子

0 引言

子宮內膜異位癥(Endometriosis，EM)是一類具有侵襲性的良性腫瘤，具有生長功能的子宮內膜細胞經輸卵管進入盆腔異位生長而形成的一種女性常見婦科疾病，孕齡階段婦女好發(fā)［1］。出現(xiàn)月經失調、盆腔痛、不孕、盆腔炎性包塊等臨床癥狀，孕齡階段婦女發(fā)病率10%～15%，嚴重影響女性的生育及心理健康［2］。發(fā)病誘因多認為在機體免疫力降低時缺乏對異位子宮內膜免疫監(jiān)視和識別，內膜組織細胞種植在非子宮腔被覆黏膜部位并異位生長［3］。《金匱要略·婦人妊娠病脈癥并治篇》謂桂枝茯苓丸具有活血消癥化瘀之功效，用于婦女血瘀經閉、癥塊、惡露等頑疾。本實驗用桂枝茯苓丸灌胃治療大鼠子宮內膜異位癥，觀察其對子宮內膜異位癥VEGF等表達的影響，為其臨床應用提供實驗及理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠40只，鼠齡50～60 d，體重(200±20)g，采用隨機數字表法隨機分為空白對照組、模型組、達那唑組(陽性藥物對照)、桂枝茯苓丸A、B組，每組10只。實驗動物由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供，實驗動物設施使用許可證：SYXK(鄂)2011-0031，實驗動物生產許可證：SCXK(鄂)2011-0008。動物房溫度18～25 ℃，濕度50%～75%，12 h交替光照，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，每日觀察動物進食情況，稱體重，及時清理糞便。

1.2 儀器及藥品 桂枝茯苓丸注射液(成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司，批準文號：國藥準字Z20027562)；VEGF、HIF-1α、ERα、PCNA試劑盒(北京博凌科為生物科技有限公司)，提取mRNA試劑及反轉錄試劑(美國Invitrogen公司)；IL-8試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20130507)。米非司酮(上海新華聯(lián)制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20000628，10 mg/支)。ERα、PCNA顯色劑(北京中杉金橋公司，產品編號：SC-542、ZM-0123)。

1.3 子宮內膜異位癥模型制備 參照彭艷等［4］改良子宮內膜皮下移植法，術前經陰道涂片檢查篩選處于動情期大鼠造模，所有動物在造模前夜停止喂食，不禁水，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(120 mg/kg)麻醉，仰臥位固定于手術臺。于腹正中、恥骨聯(lián)合上2 cm打開腹腔(長2～3 cm)，子宮位于膀胱后側并向腹腔上兩端延伸。術中近端離右側子宮角1 cm處結扎，遠端離卵巢1 cm處結扎后切下子宮，放入無菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中縱向剖開。分離子宮內膜與肌層，剪3塊3 mm×5 mm的子宮內膜組織備用。子宮內膜皮下移植法：在腹壁切口右側從腹肌與皮下筋膜層之間打隧道，以正好能置入子宮內膜片為宜，取1塊子宮內膜組織平整的置入右側隧道底部，4周后模型復制成功。

1.4 治療方法 于造模4周后，根據米非司酮臨床治療子宮內膜異位癥劑量(25 mg/d)，按大鼠體表面積換算米非司酮用量(換算后大鼠用量為2.5 mg/d)，桂枝茯苓丸A、B組用量分別為10、20 mg/d。A、B組分別用不同劑量桂枝茯苓丸灌胃治療；米非司酮組用陽性藥米非司酮2.5 mg/d灌胃治療；空白對照組及模型組灌等體積生理鹽水。5組均連續(xù)治療21 d。

1.5 檢測指標 參照文獻［2］，治療21 d后分別取5組大鼠子宮內膜組織暫存在-30 ℃低溫冰箱保存待測。檢測時以3 000 r/min 離心(離心半徑70 mm)取上清液，嚴格按SP試劑盒說明操作，采用雙抗體夾心ELISA法測定子宮內膜組織VEGF蛋白質及mRNA、FLH-1α及FLH-1α mRNA，ERα、PCNA及IL-8。

2 結果

2.1 桂枝茯苓丸對大鼠心肌VEGF、VEGF mRNA表達的影響 空白對照組大鼠子宮內膜VEGF、VEGF mRNA表達無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型組在子宮內膜異位癥模型制備成功后VEGF、VEGF mRNA在子宮內膜組織表達明顯增強，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。桂枝茯苓丸A、B組在治療21 d后VEGF、VEGF mRNA子宮內膜組織表達明顯下調，與空白對照組、模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但桂枝茯苓丸A、B組組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 桂枝茯苓丸對大鼠HIF-1α、HIF-1α mRNA表達的影響 治療21 d后，HIF-1α、HIF-1α mRNA在子宮內膜組織上均有表達，桂枝茯苓丸組A、B子宮內膜HIF-1α、HIF-1α mRNA子宮內膜組織上的陽性表達均明顯下調，與空白對照組、模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。桂枝茯苓丸A、B組組間差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

2.3 桂枝茯苓丸對大鼠E2、ERα的影響 ERα在空白對照組子宮內膜組織細胞胞核及細胞間質有少量表達，模型組則表達上調，血清E2含量明顯升高，桂枝茯苓丸A、B組ERa表達量及血清E2含量明顯降低，與空白對照組、模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，桂枝茯苓丸A、B組組間差異無統(tǒng)計學意義。見表3。

2.4 桂枝茯苓丸對大鼠PCNA表達量及IL-8水平的影響 桂枝茯苓丸A、B組PCNA表達量及IL-8水平明顯降低，與空白對照組、模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，桂枝茯苓丸A、B組組間差異無統(tǒng)計學意義。

表1 桂枝茯苓丸對大鼠VEGF、VEGF mRNA表達的影響(n=10)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表2 桂枝茯苓丸對大鼠HIF-1α、HIF-1α mRNA陽性表達的影響(n=10)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表3 桂枝茯苓丸對大鼠E2、ERα表達量影響(n=10)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表4 桂枝茯苓丸對大鼠PCNA表達量及IL-8的影響(n=10)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3 討論

中醫(yī)認為，子宮內膜異位癥屬于“不孕”、“癮瘕”、“痛經”范疇，其病理機制為子宮內膜細胞生長、增殖、黏附異常造成［5］，氣滯血瘀、七情內傷、肝腎功能失調等導致陰血虧虛、陰陽失調，因此，中醫(yī)以軟堅散結、活血化瘀、滋陰補腎等為治療原則［6］。桂枝茯苓丸出自于《金匱要略》，方中桃仁味苦甘平，桂枝辛甘而溫，丹皮味苦而微寒，可涼血散瘀，芍藥止痛；茯苓性甘平，滲濕祛痰，可益胃健脾、消癮而扶正氣，五藥合用，共奏活血化瘀、緩消癮塊，專治“婦人宿有癩病”［7］。 子宮內膜異位癥為雌激素依賴性疾病，子宮內膜生長時，雌激素與ERα特異性結合，激活子宮內膜細胞內信號傳導通路，促進E2大量分泌，雌激素在靶組織中產生生物學效應的強弱取決于靶細胞中雌激素受體ERα的水平［8］。而PCNA是一種核內合成DNA所必須的酸性核蛋白，其合成、表達與細胞的增殖密切相關,常作為評價細胞增殖，反映細胞增殖動力學的指標［9］。VEGF是一種高度特異性的促血管生長因子，可以促進多種血管活性物質合成、血管內皮細胞增殖遷移再生，故VEGF在臨床上常作為評價血管內皮功能的重要指標之一［10］。故本研究通過VEGF、E2、ERα、PCNA等指標來觀察分析桂枝茯苓丸對大鼠子宮內膜異位癥的治療作用。

實驗發(fā)現(xiàn)，在經過桂枝茯苓丸治療21 d后，A、B組VEGF及mRNA、HIF-1α、HIF-1α mRNA在子宮內膜組織上表達均下調，血清E2、IL-8水平明顯降低，PCNA及ERα在子宮內膜表達明顯減少。分析認為，正常子宮內膜存在少量的VEGF，子宮內膜在異位種植的過程中由于缺氧，在HIF-1α、VEGF通路的調節(jié)下，上調VEGF的表達，促進異位子宮內膜血管新生。在經桂枝茯苓丸治療21 d后，大鼠VEGF、VEGF mRNA、HIF-1α、HIF-1α mRNA在子宮內膜組織上表達均下調，說明桂枝茯苓丸可以明顯抑制HIF-1α、HIF-1 mRNA進而減少異位內膜組織VEGF及VEGF mRNA表達水平，抑制異位內膜血管內皮的分化及新生，由此改善內異癥患者盆腔內環(huán)境，從而抑制異位內膜組織的生長。這與萬貴平等［11］研究桂枝茯苓丸下調HIF-1α的水平，進而降低HIF-1α啟動的VEGF基因的表達一致。PCNA及ERα在子宮內膜表達減少的同時血清E2下降，這可能是桂枝茯苓丸通過下調HIF-1α的表達而顯著抑制異位內膜中的PCNA。其顯著抑制ERα受體，減少了雌激素與之特異性結合，使血清E2合成明顯減少，進而改善血液卵泡刺激素與血液黃體生成素水平，增強免疫力而達到緩解子宮疼痛與痙攣的目的［12］。機體重要炎癥介質IL-8、IL-6等可在機體感染及其他無菌性炎癥反應時，誘導激活T、B淋巴細胞分化，增加中性粒細胞溶酶體酶的活性及T、B淋巴細胞、單核巨噬細胞的吞噬功能。本實驗在治療后IL-8降低，提示桂枝茯苓丸通過下調IL-8，降低T、B淋巴細胞分化，干預炎癥細胞及單核巨噬細胞過多進入異位子宮內膜組織，阻斷IL-8介導激活單核巨噬細胞活化及炎性浸潤，避免盆腔由于炎癥反應出現(xiàn)局部組織粘連、纖維化造成子宮內膜異位癥的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，桂枝茯苓丸具有活血化瘀、調理經絡的治療效果［13］，其藥理作用與米非司酮(陽性對照藥物)相似，可抑制模型大鼠子宮異位內膜組織VEGF、HIF-1α表達，抑制異位子宮內膜組織生長與血管生成，阻止雌激素與ERα結合，降低E2分泌，阻斷IL-8介導炎性浸潤，減輕子宮內膜異位癥血管內皮炎癥反應，對實驗性子宮內膜異位癥有治療作用。

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Effect of guizhi fuling pill on the expression of vascular endothelial growth factors in endometriosis rats

CUI Ming-hua1,LI Long-zhu2a,LIU Jia-jun2b,ZHANG Mei2a,GUO Li-hong3,PENG Ji-xia3*

(1.Deprtment of Obstetrics and Gynecology,Taihe Hospital in Shiyan City,Shiyan 442000，China；2.a.Department of Obstetrics and Gynecology,b.Department of Gastroenterology,Hospital of Traditional Chinese Medicine of Shiyan City,Shiyan 442000,China;3.Functional Laboratory of Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China)

Objective To establish the rat endometriosis model by using the method of subcutaneous transplantation of autologous endometrial tissue,to observe the effect of guizhi fuling pill on the expression of vascular endothelial growth factors in model endometriosis rats.Methods 50 rats were randomly divided into control group,model group,mifepristone group,guizhi fuling pill A,B group.Model group,mifepristone group and guizhi fuling A,B group were made as rat endometriosis model.Guizhi fuling pill A,B group were given guizhi fuling bolus gavage for 21 d,mifepristone group was given positive medicine danazol,control group and model group were administrated with normal saline.The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method was used for the determination of rat uterine endometrial tissue VEGF and mRNA,hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) and the expression of HIF-1 mRNA,the determination of serum estradiol (E2) and interleukin-8 (IL-8) level,the proliferating cell nuclear antigen (PCNA),estrogen receptor (ERα) were detected by immunohistochemistry.Results The expression of VEGF and mRNA,HIF-1α and HIF-1 mRNA in endometrial tissue in guizhi fuling pill A,B group were down regulated,and the expression of E2,IL-8 level and PCNA,ERα volume significant reduced compared with those of model group (P<0.05).Conclusion The growth and angiogenesis of ectopic endometrium guizhi fuling pill can inhibit the growth of rat endometriosis,reduce vascular endothelial inflammation and has therapeutic effects on experimental rats with endometriosis.

Guizhi fuling pills;Endometriosis model;Vascular endothelial growth factor

2015-03-13

1.湖北省十堰市太和醫(yī)院婦產科，湖北 十堰 442000；2.湖北省十堰市中醫(yī)醫(yī)院a.婦產科，b.消化科，湖北 十堰 442000；3.湖北醫(yī)藥學院機能實驗室，湖北 十堰 442000

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201509004