蔓莖堇菜總三萜的提取工藝優(yōu)選

閔慶喜， 馮煥枝， 張 琳， 曹麗萍， 戴嬌嬌， 朱全紅

(南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣東 廣州510515)

蔓莖堇菜Viola Diffusa G. 為堇菜科堇菜屬Viola 植物，又稱匍伏堇、天芥菜、茶匙黃、七星蓮、黃瓜香、黃瓜草［1-2］。以全草入藥，性涼微苦，具有清熱解毒、散淤消腫、去腐生肌、清肺止咳之效［3］。民間使用歷史悠久，主治瘡瘍腫毒，眼結膜炎，肺熱咳嗽，百日咳，黃疸型肝炎，水火燙傷，跌打損傷，毒蛇咬傷等［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明該植物具有抗菌、抗炎、抗氧化、保肝、調(diào)節(jié)免疫功能、抗心肌缺血等［4-10］藥理活性。蔓莖堇菜的化學成分主要有黃酮、萜類、糖類以及黏液質(zhì)類等成分［1，11-12］。目前蔓莖堇菜的提取工藝研究僅見總黃酮的報道，陳由強等［13］采用紫外-可見分光光度法，以蘆丁為對照品測定了蔓莖堇菜總黃酮的量，并對總黃酮的提取工藝進行了初步探討。本實驗室前期對蔓莖堇菜中分離得到的三萜類成分進行了體外抗乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)活性試驗，結果表明三萜類成分具有較好的抗HBV 活性［14］。鑒于此，本實驗采用單因素及正交試驗的方法，對蔓莖堇菜總三萜成分的提取工藝進行了初步優(yōu)化研究，以期為蔓莖堇菜總三萜有效部位的研究提供參考。

1 材料與儀器

蔓莖堇菜采自福建省永春縣，經(jīng)南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院馬驥教授鑒定為堇菜科堇菜屬植物蔓莖堇菜Viola diffusa G.，齊墩果酸對照品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號110709-200505，純度≥99%)，乙酸乙酯、乙醇等均為分析純。

HP8453 型紫外-可見分光光度計(美國Agilent 公司);JA2003 型天平(上海良平儀器儀表有限公司);CP225D 型電子分析天平(德國Sartorius 公司);DK-S26 型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司);TC-15 套式恒溫器(海寧市新華醫(yī)療器械廠);DET-200 型粉碎機(浙江大德機械有限公司)。

2 方法與結果

2.1 總三萜的測定方法

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸對照品20.00 mg，置于100 mL 量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL 齊墩果酸對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取單因素試驗藥液或正交試驗藥液，濃縮至一定量后定容至100 mL 量瓶中，加其提取溶劑至刻度，搖勻即得。

2.1.3 測定波長的選擇 精密量取對照品溶液0.6 mL 和供試品溶液0.2 mL，置具塞試管中，按文獻［12］方法處理，冰浴冷卻后，轉移至10 mL 量瓶中加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，再迅速冰浴冷卻，放至室溫后進行全波長掃描，隨行空白對照。結果表明，對照品溶液在560 nm 處有最大吸收峰，故選擇560 nm 作為樣品測定的波長。

2.1.4 標準曲線的繪制 精密量取上述齊墩果酸對照品溶液 0.20、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80 mL，分別置具塞試管中，按“2.1.3”項下處理，于560 nm 波長測定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標，質(zhì)量濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線，其線性回歸方程為A =0.031 8C-0.003 6 (r2=0.999 1)，齊墩果酸在0.004 ～0.036 mg/mL 范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2 單因素考察

2.2.1 提取時間考察 精密稱取4 份蔓莖堇菜，每份約2.0 g，置于圓底燒瓶中，加入90%乙醇50 mL，回流提取2 次，分別提取1、2、4、6 h，過濾，制備供試品溶液，按“2.1.4”項下方法測定總三萜含量。結果總三萜得率分別為1.21、2.64、1.97、1.78 mg/g，表明在提取時間為2 h 時提取物中總三萜的含有量最高，2 h 后含有量下降，這可能是三萜類化合物長時間受熱，導致其結構改變而引起的。因此選擇回流提取時間為2 h。

2.2.2 溶劑用量考察 精密稱取5 份蔓莖堇菜，每份約2.0 g，置于圓底燒瓶中，分別加入40、50、60、80，100 mL90%乙醇，回流提取2 次，每次提取2 h，過濾，制備供試品溶液，按“2.1.4”項下方法測定總三萜含有量。結果總三萜得率分別為0.89、1.53、1.96、1.76、1.08 mg/g，表明蔓莖堇菜總三萜含有量隨溶劑用量增加而增加，在60 mL 時達到最大，之后緩慢下降。因此選擇溶劑用量為60 mL。

2.2.3 提取次數(shù)考察 精密稱取4 份蔓莖堇菜，每份約2.0g，置于圓底燒瓶中，加入90%乙醇50 mL，分別回流提取1、2、3、4 次，每次提取2 h，過濾，制備供試品溶液，按“2.1.4”項下方法測定總三萜含有量。結果總三萜得率分別為2.20、3.79、2.76、2.58 mg/g，表明在提取2 次時，總三萜含有量達到了最大，為3.79 mg/g。從生產(chǎn)工藝的角度考慮，選用2 次。

2.2.4 溶劑體積分數(shù)考察 精密稱取4 份蔓莖堇菜，每份約2.0 g，置于圓底燒瓶中，分別加入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、無水乙醇50 mL，回流提取2 次，每次提取2 h，過濾，制備供試品溶液，按“2.1.4”項下方法測定總三萜的含有量。結果總三萜得率分別為2.20、3.62、5.36、1.33 mg/g，表明隨著乙醇體積分數(shù)的增加，蔓莖堇菜總三萜的含有量也增加，在乙醇體積分數(shù)為90%時達到最大，溶出率最高。所以提取溶劑選擇90%乙醇。

2.3 正交試驗考察 根據(jù)單因素試驗結果，選取溶劑體積分數(shù)、時間、次數(shù)3 個影響總三萜含有量的主要因素，每個因素試驗3 個水平，進行L9(34)正交試驗。因素水平表見表1，試驗結果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗設計及結果

表3 方差分析

由極差分析可知，三個因素影響總三萜提取率的順序為A (溶劑體積分數(shù))＞C (提取時間) ＞B (提取次數(shù))。為了檢驗各因素對提取率影響的顯著性，進行了方差分析，利用空白列來估計誤差?？側频淖罴烟崛」に嚍锳3B2C1，即80%乙醇提取2 次，每次1.5 h。

2.4 驗證試驗 稱取同一批次蔓莖堇菜3 份，按照優(yōu)選的工藝條件A3B2C1進行驗證試驗，按“2.1.4”項下方法測定總三萜的量。結果總三萜平均得率為16.87 mg/g，RSD為0.6%。表明優(yōu)化工藝下提取的總三萜的量最高，此工藝穩(wěn)定可靠，可行性好。

3 討論

本實驗用乙醇作提取溶劑，以0.5 mL 5%香草醛-冰醋酸、1.2 mL 高氯酸作為顯色劑，采用比色法測定總三萜量，采用正交試驗篩選出蔓莖堇菜總三萜的最佳提取條件為80%乙醇提取2 次，每次1.5 h。在測定過程中發(fā)現(xiàn)，放熱問題對測定結果的穩(wěn)定性影響較大。因此，需在加熱顯色后進行冰浴，且定容后放熱較多，需再一次迅速冰浴冷卻，放至室溫后測定。另外，測定時間的同步與否也對試驗結果有一定影響。

本實驗采用齊墩果酸為對照品進行定量測定，但目前關于蔓莖堇菜化學成分的文獻，還未見有齊墩果酸的報道，因此本實驗在對照品的選擇上存在一定缺陷。但是由于三萜類化合物結構具有相似性，而結構相似的化合物在紫外-可見分光光度計上測得的吸收波長相近，因此，以齊墩果酸為對照品進行定量測定具有參考性。在今后的研究中，課題組將制備出前期實驗中從蔓莖堇菜提取得到的具有抗HBV 活性的三萜類化學成分，以此作為對照品對蔓莖堇菜有效部位進行定量測定，準確客觀地反映出有效部位中有效成分的含有量。

［1］ 福建省中醫(yī)藥研究院. 福建藥物志:第2 卷［M］. 福州:福建科學技術出版社，1994:11.

［2］ 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會. 中華本草:第5冊［M］. 上海:上?？茖W技術出版社，1999:458-459.

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［14］ 戴嬌嬌. 蔓莖堇菜化學成分及體外抗乙型肝炎病毒的研究［D］. 廣州:南方醫(yī)科大學，2012.