任春梅+程兆榜+朱慧+邰麗娟+陸鳳霞+鮑傳華+范永堅+周益軍

摘要：采用PEG二次沉淀和蔗糖硫酸銫密度梯度離心，得到提純的3種麥類土傳花葉病毒（小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、中國小麥花葉病毒）。透射電鏡觀察分別可見線狀、直桿狀病毒粒子，測定濃度分別達5.44、8.08、4.09mg/mL。提純病毒免疫新西蘭大白兔制備抗血清，得到的3株抗血清經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法測定效價分別達1∶12800、1∶25600、1∶6400。應用樣品和多抗稀釋的方陣試驗，建立3種多抗的雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法（TAS-ELISA），并對采自江蘇省、安徽省、河南省、山東省的麥子病樣進行檢測，結果顯示，陽性檢出率較高，說明這3種病毒仍是我國麥子流行的主要病毒。

關鍵詞：小麥黃花葉病毒；大麥黃花葉病毒；中國小麥花葉病毒；抗血清制備；血清學檢測

中圖分類號：S435.121.4+9文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0143-03

小麥黃花葉病毒（wheatyellowmosaicvirus，WYMV）、大麥黃花葉病毒（barleyyellowmosaicvirus，BaYMV）、中國小麥花葉病毒（Chinesewheatmosaicvirus，CWMV）是3種典型的麥類土傳病毒，其引起的麥類土傳病害嚴重影響麥子的產(chǎn)量及品質，三者均由土壤中的禾谷多黏菌（Polymyxagraminis）傳播，前兩者屬于大麥黃花葉病毒屬（Bymovirus），CWMV屬于真菌傳桿狀病毒屬（Furovirus）[1]。WYMV主要分布于日本、韓國、中國[2]，BaYMV主要分布在日本、西北歐、中國，近年來在我國長江中下游及淮河地區(qū)發(fā)生較為嚴重[3-4]。分子生物學檢測技術靈敏度高但操作繁瑣且花費大，血清學方法操作簡單且一次性可以處理大量樣品而應用較為廣泛，但其核心抗體價格比較昂貴且質量要求比較高。本研究以提純的3種麥類土傳病毒的病毒粒子為抗原，制備3種病毒的多克隆抗體，并以制備的抗體建立了3種病毒的TAS-ELISA方法，對田間樣品進行了檢測應用，旨在為此類病毒診斷、抗病品種選育等提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

WYMV、CWMV、BaYMV來自江蘇省農業(yè)科學院試驗病圃中有典型癥狀的小麥、大麥葉片，病圃原始病土分別來源于江蘇省高郵市（WYMV）、江蘇省鹽城市（BaYMV）、江蘇省大豐市（CWMV），病葉-20℃保存。RSV、RBSDV毒源由筆者所在實驗室鑒定保存。試驗用兔為飼養(yǎng)于江蘇省農業(yè)科學院畜牧研究所兔場的新西蘭大白兔。弗氏佐劑購于Sigma公司。堿性磷酸酯酶標記的第二抗體購于美國Agdia公司。超純蔗糖、硫酸銫購于上海生工生物有限公司。BeckmanOptimaL-100XP超速離心機，其他生化試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1病毒的提純

取小麥、大麥3種病毒病葉各400g，剪碎加3×抽提緩沖液，攪拌機攪碎，2層紗布過濾。加1/4濾液體積的CCl4，冰浴攪拌5min，靜置10min，8000r/min離心15min。取上清，加6%PEG-6000、3%NaCl、1%TritonX-100，冰浴攪拌至全部溶解，4℃下放置6h或過夜。8000r/min離心20min，沉淀用懸浮緩沖液懸浮，10000r/min離心15min，取上清。上清加5mL30%蔗糖墊（含0.3%TritonX-100），25000r/min離心2h。沉淀用懸浮緩沖液懸浮，12000r/min離心10min，取上清。采用蔗糖硫酸銫不連續(xù)密度梯度離心法進一步純化，22000r/min離心3h。離心管上端1/3處為病毒層，用樣品緩沖液稀釋，40000r/min離心1h。用0.5mL樣品緩沖液懸浮沉淀，得到提純病毒液，取20μL4℃保存，用于電鏡檢測；另取480μL-20℃保存。

1.2.2病毒的電鏡觀察及紫外檢測

提純病毒液經(jīng)適當稀釋，取1滴滴于Parafilm膜上，取有支持膜的銅網(wǎng)，膜向下置于液滴表面，放置數(shù)分鐘，挾起銅網(wǎng)，從銅網(wǎng)邊緣吸去余液，似干未干之時將膜向下置于2%磷鎢酸液（PTA）滴上染色30s至2min，吸干余液，置于JEOLJEM-1200E-X電鏡下觀察病毒粒子形態(tài)。以pH值為7.2的0.01mol/LPB緩沖液為參照，用該緩沖液稀釋病毒液再用紫外分光光度計測D260nm、D280nm值，計算病毒濃度、產(chǎn)量[5]。

1.2.3抗血清制備

于試驗前1周到兔場選取體質量約2kg的健康新西蘭大白兔公兔6只，每種病毒用2只，編號分別為W1和W2、Ba1和Ba2、C1和C2，于實驗室飼養(yǎng)觀察1周以度過應激反應期。兔免疫前取耳緣靜脈2mL左右血液作為健康血清。免疫分6次進行，每隔1周注射1次，第1、第2、第3次采取大腿2點及背部皮下多點注射，注射所用病毒劑量為0.5mg；第3次注射結束10d后，取0.5mg病毒分別加強免疫，采用耳緣靜脈注射，連續(xù)免疫3次，每次間隔1周。第1次注射用等體積完全佐劑充分乳化，后面5次用等體積不完全佐劑充分乳化。最后1次免疫10d后預采血進行效價測定，達到要求后進行大量采血。取血前1d晚上停止喂食，只少量飲水。采用心臟采血方式，每次取血完后將血漿放入滅菌培養(yǎng)皿中，室溫下放置2h，移入4℃冰箱擺成斜面放置過夜。吸取血清，6000r/min離心10min，棄殘余血球沉淀，上清即為抗血清[6]。

1.2.4抗血清效價測定

第6次免疫后第10天預采血2mL，采用TAS-ELISA法[7]測定抗血清效價?？寡灏?/100、1/200、1/400、1/800、1/1600、1/3200、1/6400、1/12800、1/25600、1/51200、1/102400、1/204800梯度進行稀釋，同時取注射前的血清（本底血清）按同樣的梯度進行稀釋作為陰性對照，取包被液作為空白對照，試驗組及對照組每個稀釋度均做3個平行。

1.2.5抗血清特異性評價

對3種病毒的抗血清進行特異性評價。經(jīng)鑒定單獨感染RSV、RBSDV、WYMV、BaYMV、CWMV等5種病毒的病葉用0.05mol/L包被緩沖液（pH值為9.6）稀釋20倍包被ELISA板，分別以3種病毒的免疫原作為陽性對照，健康葉汁為陰性對照，每處理重復3次，采用TAS-ELISA法測定3種抗血清的特異性。

1.2.6TAS-ELISA最適條件確定

采用方陣試驗對3種病毒的抗血清進行TAS-ELISA最適條件測定。酶標板縱向從上而下，用pH值為9.6的碳酸緩沖液從1∶156.25至1∶20000倍比稀釋3種多抗，酶標板橫向從左至右用樣品緩沖液以1∶10～1∶5120倍比稀釋，酶標抗體稀釋倍數(shù)為5000倍，分別以3種病毒為陽性對照（病毒稀釋80倍，抗體同上倍比稀釋），健康葉汁為陰性對照（葉片同上倍比稀釋，抗體156.25倍稀釋），每處理設3次重復，P/N>2.1作為陽性判斷標準。基于“1.2.5”節(jié)中同屬的WYMV與BaYMV抗血清有輕微的血清學交叉反應，作TAS-ELISA最適條件測定時，僅攜帶WYMV的樣品同上倍比稀釋，用BaYMV抗體同上倍比稀釋進行檢測，陽性及陰性對照設置同上，每處理設3個重復。僅攜帶BaYMV的樣品用WYMV抗體采用同上處理方式進行檢測，以尋找避開2種抗血清交叉反應的檢測樣品及各自抗血清最佳稀釋倍數(shù)。

1.2.7抗血清的檢測應用

利用3種病毒抗血清的TAS-ELISA方法對大麥、小麥樣品進行檢測，在江蘇省高郵市、寶應市、儀征市、常州市、泰州市姜堰區(qū)、興化市、鹽城市鹽都區(qū)、淮安市、大豐市，安徽省壽縣及來安縣，河南省遂平縣，山東省臨沂市、泰安市、濟寧市等地的大麥、小麥中采集3種病毒疑似樣品，用溫室生長的大麥、小麥健康葉片作陰性對照，病圃中經(jīng)檢測為3種病毒的病葉為陽性對照，每處理設3個重復，以P/N>2.1作為陽性判斷標準。

2結果與分析

2.13種提純病毒的電鏡觀察及濃度檢測

提純的3種病毒經(jīng)2%磷鎢酸負染后在透射電鏡下觀察（圖1），3種病毒經(jīng)蔗糖硫酸銫不連續(xù)密度梯度離心后均有較純且濃密的病毒粒子，同屬的WYMV、BaYMV可見直線狀或彎線狀病毒粒子，粒子長度達200nm以上，WYMV粒子比BaYMV粒子長；CWMV為直桿狀病毒粒子，粒子長度100～300nm，直徑約為20nm。用紫外分光光度法測得提純病毒濃度分別為5.44mg/mL（WYMV）、8.08mg/mL（BaYMV）、4.09mg/mL（CWMV）。

2.23種病毒抗血清效價的測定

分別獲得2株抗血清，以間接ELISA法測定2株抗血清的效價。由圖2可知，免疫前的本底血清在3種病毒免疫反應中都較弱，制備的3種抗血清分別在稀釋12800倍（WYMV）、25600倍（BaYMV）、6400倍（CWMV）下仍有明顯的血清學反應，表明三者的抗血清效價分別達1∶12800、1∶25600、1∶6400，3種抗血清均可用于后續(xù)免疫學試驗。

2.33種病毒抗血清特異性評價

由表1可知，同屬大麥黃花葉病毒屬的WYMV與BaYMV有弱的血清學交叉反應，2種病毒的抗血清與CWMV、RSV、RBSDV反應均較弱。CWMV抗血清特異性較強，除自身病毒外，與其他4種病毒的反應均接近于健康植株的反應。

2.43種抗血清的TAS-ELISA方法建立

方陣試驗結果表明，作包被的3種多抗血清倍比稀釋后進行TAS-ELISA測定，WYMV、BaYMV、CWMV多抗分別在1∶10000、1∶20000、1∶5000稀釋度下，P/N值均大于2.1。3種病毒的樣品稀釋度為1∶10～1∶640時都較理想，當稀釋度為1∶1280時，P/N值小于2.1，可以確定1∶640為檢測極限稀釋度?？紤]到實際應用時檢測靈敏度較高，初步確定3種病毒樣品稀釋度都選擇1∶160，多抗稀釋度分別選擇1∶5000（WYMV）、1∶10000（BaYMV）、1∶2500（CWMV）作為TAS-ELISA的最適工作濃度。表2顯示，BaYMV樣品稀釋80倍、WYMV多抗稀釋5000～10000倍時，病樣的吸光度約為健樣的2倍，說明抗體稀釋5000倍是臨界值。表3顯示，當WYMV樣品稀釋160倍時，BaYMV多抗稀釋度為10000倍時是臨界值。由此可知，WYMV、BaYMV樣品適度為160倍，抗體稀釋度分別選擇1∶8000、1∶12000。

2.53種病毒抗血清的檢測應用

應用3種抗血清的TAS-ELISA檢測方法，對采自全國4個省16個縣（市、區(qū)）的60個樣品進行檢測。由表4可知，WYMV分布最為廣泛，除了在江蘇省鹽城市的大麥及淮安市、大豐市2地的小麥樣品中均未檢到外，其余縣市均有分布，陽性檢出率在20%以上。CWMV不僅在大豐市、淮安市2個老病區(qū)的樣品上檢測到，而且在興化市的樣品中也檢測到，興化市樣品中有1株還存在WYMV與CWMV復合侵染的情況。鹽城市的大麥樣品上均為BaYMV，說明這3種病毒仍是麥類較為流行的病毒。大麥樣品中均未檢測到WYMV，小麥樣品中也未檢出BaYMV，說明應用筆者建立的TAS-ELISA檢測方法可以有效避免2種抗血清的交叉反應。

3結論與討論

WYMV、BaYMV、CWMV都是由禾谷多黏菌傳播的。禾谷多黏菌是1種專性寄生于植物根部的低等真核生物，本身沒有致病性，但是可以傳播多種禾谷類作物病毒，引起禾谷類作物嚴重減產(chǎn)。此類病毒在病葉中的含量很低，較難提純，主要原因是組織搗爛時病毒粒子容

易斷裂，且提純過程中病毒粒子容易聚集、不易懸浮、易丟失等。筆者選用PEG沉淀法，先用CCl4分離植物與病毒蛋白，用聚乙二醇沉淀病毒，懸浮液中加入0.1%巰基乙醇與0.3%TitonX-100，有效地解決病毒易聚集的問題。采用蔗糖硫酸銫不連續(xù)密度梯度法提純病毒，克服了蔗糖密度梯度難以成帶的問題，結果表明，采用此法提純病毒時梯度離心后管中出現(xiàn)1條非常明顯的病毒帶，此帶經(jīng)進一步離心后得到濃度高且較純的病毒，3種提純

病毒紫外檢測均呈典型核蛋白吸收曲線，透射電鏡觀察到類似的病毒粒子，檢測濃度在4.09mg/mL以上。進一步使用3種提純病毒免疫新西蘭大白兔，制備了3種病毒的抗血清。經(jīng)測定，制備的3種抗血清效價分別達1∶12800（WYMV）、1∶25600（BaYMV）、1∶6400（CWMV）。CWMV特異性較強，同屬的WYMV與BaYMV抗體存在較弱的血清學交叉反應，為了避免檢測中出現(xiàn)假陽性問題，筆者對檢測樣品及抗體進行倍比稀釋方陣試驗，確定了能夠避免交叉反應的稀釋倍數(shù)，建立了3種抗體的TAS-ELISA檢測方法，并對田間樣品進行了應用檢測。雖然之前已有這3種病毒相關抗體的報道[8-9]，但是制備抗體的毒源材料有差異，制備抗體的效價也不同。應用筆者建立的3種抗體的TAS-ELISA方法對田間樣品檢測結果顯示，3種病毒在江蘇省均有分布，特別是WYMV在江蘇省7個縣（市）均有分布，帶毒率也較高，說明WYMV對江蘇省小麥的危害仍然存在。

參考文獻：

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病毒紫外檢測均呈典型核蛋白吸收曲線，透射電鏡觀察到類似的病毒粒子，檢測濃度在4.09mg/mL以上。進一步使用3種提純病毒免疫新西蘭大白兔，制備了3種病毒的抗血清。經(jīng)測定，制備的3種抗血清效價分別達1∶12800（WYMV）、1∶25600（BaYMV）、1∶6400（CWMV）。CWMV特異性較強，同屬的WYMV與BaYMV抗體存在較弱的血清學交叉反應，為了避免檢測中出現(xiàn)假陽性問題，筆者對檢測樣品及抗體進行倍比稀釋方陣試驗，確定了能夠避免交叉反應的稀釋倍數(shù)，建立了3種抗體的TAS-ELISA檢測方法，并對田間樣品進行了應用檢測。雖然之前已有這3種病毒相關抗體的報道[8-9]，但是制備抗體的毒源材料有差異，制備抗體的效價也不同。應用筆者建立的3種抗體的TAS-ELISA方法對田間樣品檢測結果顯示，3種病毒在江蘇省均有分布，特別是WYMV在江蘇省7個縣（市）均有分布，帶毒率也較高，說明WYMV對江蘇省小麥的危害仍然存在。

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