羅婭君， 邊清泉， 羅 英， 閔昌松

（綿陽師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，四川綿陽621000）

大孔樹脂吸附馬比木中喜樹堿的工藝

羅婭君， 邊清泉， 羅 英， 閔昌松

（綿陽師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，四川綿陽621000）

目的研究大孔吸附樹脂吸附馬比木中喜樹堿的純化工藝條件及吸附參數(shù)。方法利用高效液相色譜 （HPLC）法測量馬比木中喜樹堿的含有量，以喜樹堿吸附率和解析率為指標，通過靜態(tài)飽和吸附與解吸試驗對3種型號樹脂進行篩選，再通過動態(tài)吸附與解吸試驗對吸附工藝參數(shù)進行全面優(yōu)化。結(jié)果AB-8型大孔吸附樹脂對馬比木中喜樹堿的吸附與解析性能較好 （靜態(tài)吸附率為93.97%，解析率為75.00%）。最佳吸附條件為：喜樹堿檢測波長為253 nm，樣品液中喜樹堿的質(zhì)量濃度為0.087 mg/mL，含有量為7.25 mg/g。樣品液體積流量為0.5 mL/min，樣品液pH8，洗脫劑為80%乙醇，馬比木喜樹堿解析率為86.34%。結(jié)論AB-8型大孔吸附樹脂可有效吸附馬比木中喜樹堿，為馬比木資源的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)的依據(jù)，建立良好的理論基礎(chǔ)。

馬比木；喜樹堿；大孔吸附樹脂；高效液相色譜

馬比木Nothapodytes Pittosporoides（O1iv.）s1eum系茶茱萸科植物海桐假柴龍樹，又名海桐馬比木、海桐假柴龍樹、追風(fēng)傘、公黃珠子等。馬比木全草入藥，是一種重要的藥用植物，其功能表現(xiàn)為活血止痛、祛風(fēng)通絡(luò)，主治小兒驚風(fēng)、半身不遂、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷以及浮腫等［1］，為多年生草本，分布于湖北、湖南、四川及貴州等地［2］。它的根部主要含喜樹堿及其甲基衍生物，在臨床上被用于消化系統(tǒng)惡性腫瘤的治療［3-4］。隨著市場對喜樹堿及其衍生物的需求量的增長和國家對喜樹植株的重點保護，馬比木作為喜樹堿新藥源的替代品，已越來越受到研究者青睞。據(jù)報道，馬比木根中喜樹堿的含有量高于喜樹果中喜樹堿的含有量［5-8］，其根莖中所含喜樹堿的含有量最高可達0.392%，而喜樹果中喜樹堿的含有量較低，四川地區(qū)最高含有量為0.118%，福建地區(qū)最高含有量為0.190%［9］。

大孔吸附樹脂分離技術(shù)是繼離子交換樹脂后發(fā)展起來的一種新型分離新技術(shù)，克服了離子交換樹脂易污染、耗酸量大等缺點。近年，它在中藥復(fù)方的制備、中藥制劑的生產(chǎn)以及中草藥有效成分的提取分離方面日益受到重視［10-12］。目前，未見有關(guān)大孔吸附樹脂吸附馬比木中喜樹堿的工藝研究，為了合理利用自然資源和保護自然資源，同時提高喜樹堿的產(chǎn)量，本實驗選用3種不同型號的大孔吸附樹脂，分別探索了它們對馬比木中喜樹堿的吸附和解析效果，找到吸附率與解析率最佳的大孔樹脂，并對該大孔樹脂做動態(tài)吸附實驗，確定其最佳的工藝條件，為馬比木資源的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)的依據(jù)，并建立良好的理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

SHZ-8水浴恒溫振蕩器 （上海賀德實驗設(shè)備有限公司）；AUY120電子天平 （日本島津公司）；As-10200T超聲波清洗器 （天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；島津高效液相色譜系統(tǒng)，包括LC-20A T輸液泵，SPD-10AUP二極管陣列檢測器，CLASS-vp5.0色譜數(shù)處理工作站，CTD-6A色譜柱溫箱 （日本島津公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海亞榮生化儀器廠）；FW-177中草藥高速粉碎機 （天津市泰斯特儀器由有限公司）。

喜樹堿對照品 （上海永恒生物科技有限公司，經(jīng)高效液相分析純度為99.6%）；馬比木根 （采自貴州），經(jīng)鑒定為茶茱萸科植物海桐假柴龍樹Nothapodytes Pittosporoides（O1iv.）s1eum.的根；D101型大孔吸附樹脂（成都市科龍化工試劑廠）；AB-8型大孔吸附樹脂、S-8型大孔吸附樹脂（安徽三星樹脂科技有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 喜樹堿的測定

2.1.1 喜樹堿標準溶液的配制 取喜樹堿對照品2.6 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解，定容并搖勻，得104μg/m L喜樹堿標準溶液，放于冰箱中冷藏。

2.1.2 檢測波長的確定 精密吸取10μL的喜樹堿標準溶液，測得其紫外分光光譜圖。由光譜圖可知，喜樹堿分別在218 nm、254 nm和360 nm三處有強吸收，但是在218 nm波長處存在不明組分的吸收，將會干擾實驗的測定，在360 nm波長處，其吸收強度不如在254 nm波長處強。所以選擇檢測波長為254 nm。

2.1.3 色譜條件［13］色譜柱為Diamonsi1TMC18（5μm，4.6 mm×250mm），流動相為甲醇-水 （5.5∶4.5），體積流量0.9mL/min，檢測波長為254 nm；柱溫為35℃；進樣量為10μL。分離度大于1.5；靈敏度為0.050AUFS；理論板數(shù)按喜樹堿計算均大于4500。

2.1.4 標準曲線繪制［13］分別精密吸取 “2.1.1”項制備的標準溶液1、3、5、7、9μL，按上述色譜條件進樣，測定峰面積，以對照品溶液進樣量 （μg）為橫坐標，以峰面積均值 （μv.s）為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程為Y=1.619 9×106X-19 573.3（r=0.999 9），結(jié)果表明喜樹堿在0.2～1.8μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.5 樣品液的配制 馬比木根自然曬干粉碎，過60目篩得馬比木粉末。取100 mL錐形瓶，加入準確稱取的3.0 g樣品，再加入80 mL的甲醇在25℃條件下超聲提取，每次超聲30min，超聲2次，將兩次的提取液減壓過濾，濾液轉(zhuǎn)入250mL量瓶中，用甲醇定容，并放于冰箱中冷藏。

精密吸取提取液10μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進樣2次，用外標法計算樣品溶液中喜樹堿的質(zhì)量濃度，取平均值。250 mL樣品液中喜樹堿的質(zhì)量濃度為0.087 mg/m L，喜樹堿的含有量為7.25 mg/g。對照品和馬比木粗提物的HPLC色譜圖分別見圖1、圖2。

圖1 對照品喜樹堿的HPLC色譜圖

圖2 馬比木粗提物HPLC色譜圖

2.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸

2.2.1 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 分別稱取D101、AB-8、S-8型大孔吸附樹脂各2.0 g，根據(jù)文獻和3種樹脂的性質(zhì)進行預(yù)處理［14-16］。

D101：先用無水乙醇浸泡24 h，濕法裝柱，再用95%乙醇淋洗樹脂柱至流出液加水不混濁，然后用蒸餾水淋洗至無醇味，用蒸餾水浸泡待用。

AB-8：濕法裝柱，95%乙醇洗至流出液加水不渾濁，用蒸餾水淋洗樹脂柱至流出液無醇味，再用4%NaOH溶液2-3床體積淋洗樹脂，然后用蒸餾水淋洗樹脂柱至流出液為中性，用蒸餾水浸泡待用。

S-8：無水乙醇浸泡3～4 h，濕法裝柱，用95%乙醇淋洗樹脂柱至流出液不渾濁，再用蒸餾水淋洗樹脂柱至流出液無醇味，蒸餾水浸泡待用。

2.2.2 樹脂的再生 樹脂柱用蒸餾水淋洗至流出液無醇味，控制體積流量1～2 BV/h（BV表示床體積的倍數(shù)，即所用淋洗液的體積等于床體積的倍數(shù)），用3%HC1溶液淋洗樹脂柱2～4 h，再用蒸餾水淋洗至流出液呈中性，控制體積流量1～2 BV/h，然后用5%NaOH溶液洗樹脂柱2～4 h，最后用蒸餾水淋洗至流出液呈中性，蒸餾水浸泡樹脂，即可繼續(xù)使用。

2.2.3 靜態(tài)吸附和解吸 準確移取10mL馬比木提取液于100 mL帶塞的錐形瓶中，平行移取3份，分別加入通過預(yù)先處理好的D101、AB-8、S-8型大孔吸附樹脂各2.0 g，置于20℃，搖速恒定的水浴恒溫搖床中吸附24 h，抽濾得濾液 （抽濾后的樹脂用于靜態(tài)解析），取濾液1 mL于比色管中，用甲醇稀釋至10 mL，HPLC測定吸附液的濃度，用下式計算吸附量和吸附率。

吸附量=（C0-C1）

吸附率=（C0V0-C1VI）/C0V0×100%

式中，C0為吸附前溶液中喜樹堿的質(zhì)量濃度，μg/mL；C1為吸附后溶液中喜樹堿的質(zhì)量濃度，μg/mL；V0為吸附前溶液的體積，mL；V1為吸附后溶液的體積，mL。

取靜態(tài)吸附抽濾后的樹脂分別加入到100 mL具塞的3個錐形瓶中，再分別加入20 mL體積分數(shù)為95%乙醇，置于20℃，搖速恒定的水浴恒溫搖床中解析24 h，抽濾得到濾液，取濾液1 mL于比色管中，HPLC測定解析液質(zhì)量濃度，用下式計算解析率。

解析率=C2V2/（C0V0-C1V1）×100%

式中，C0、C1、V0、V1同上，C2為解析液中喜樹堿的質(zhì)量濃度 （μg/mL）；V2：解析液的體積 （m L）。3種大孔吸附樹脂對喜樹堿的靜態(tài)飽和吸附率和解析率如表1。

表1 3種大孔樹脂對喜樹堿的靜態(tài)吸附和解吸情況

在考察大孔樹脂對喜樹堿的靜態(tài)吸附與解析效果時，主要考慮其極性、比表面積、孔徑不同以及喜樹堿的分子體積等因素。這些因數(shù)的共同作用使得大孔樹脂對喜樹堿的吸附能力的強弱不同，解吸程度也存在著差別。為了保證最大程度地提取天然藥物中的有效成分，對大孔吸附樹脂的要求不僅要達到吸附率高，而且還要滿足解吸率高。表1表明，D101、AB-8型大孔吸附樹脂對喜樹堿的吸附率都較大。D101的吸附率最大，但解析率較低，綜合考慮吸附量與解析率，AB-8樹脂性能最佳，故優(yōu)選AB-8樹脂來進一步研究其對喜樹堿的富集純化工藝。

2.3 AB-8動態(tài)吸附和解吸

2.3.1 上樣液體積流量對大孔吸附樹脂吸附率的影響 取樹脂柱，濕法裝入已經(jīng)預(yù)處理過的AB-8型大孔吸附樹脂2.0 g，準確移取上樣液10 mL上柱，調(diào)節(jié)體積流量分別為0.5、1、2、2.5、3.5mL/min進行吸附，用潔凈干燥的錐形瓶接收流出液。分別取1mL流出液于比色管中，用甲醇稀釋至10 mL，HPLC法測定吸附液的濃度，不同體積流量下樹脂的吸附率見圖3。

圖3 不同體積流量對吸附率的影響圖 （n=3）

在生產(chǎn)工藝中考慮到生產(chǎn)成本，一般控制體積流量在0.5～5 mL/min。由圖3可知，樣品液的體積流量越小，大孔樹脂的吸附率越大，但是體積流量過小，消耗的時間越長。綜合考慮吸附率與吸附時間，當(dāng)上樣液體積流量為0.5mL/min時，大孔樹脂對喜樹堿的吸附率達到94.62%，同時吸附時間也較合適。所以，選擇控制上樣液為體積流量0.5 m L/m in。

2.3.2 上樣液pH對大孔吸附樹脂吸附率的影響 取樹脂柱，濕法裝入已經(jīng)預(yù)處理過的AB-8型大孔吸附樹脂2.0 g，準確移取4份上樣液各10mL，2份用5%HC1溶液調(diào)pH為3、5，2份用4%NaOH溶液調(diào)pH為8、10，控制體積流量0.5 mL/min對其吸附，用潔凈干燥的錐形瓶接收流出液。分別取1 mL流出液于比色管中，用甲醇稀釋至10 mL，HPLC法測定吸附液的濃度，不同pH下樹脂的吸附率見圖4。

圖4表明，隨著上樣液pH的增加，吸附率逐漸增大。喜樹堿在堿性條件下會生成相應(yīng)的羧酸鹽，增加了大孔樹脂對它的吸附量，但是考慮到喜樹堿鈉鹽的不穩(wěn)定性。所以，選擇調(diào)節(jié)上樣液的pH=8。

圖4 上樣液pH對吸附率的影響圖（n=3）

2.3.3 洗脫劑乙醇體積分數(shù)對解析率的影響 樹脂柱濕法裝入已經(jīng)預(yù)處理過的AB-8型大孔吸附樹脂2.0 g，準確移取上樣液10 mL，調(diào)節(jié)pH=8和控制體積流量為0.5 m L/m in對其吸附。用20 mL體積分數(shù)分別為50%、60%、70%、80%、95%的乙醇洗脫樹脂柱，用潔凈干燥的錐形瓶接收洗脫液。各取1 mL洗脫液于比色管中，用甲醇稀釋至10 m L，HPLC法測定解析液的濃度，不同體積分數(shù)下乙醇對喜樹堿的解析率見圖5。

圖5 不同體積分數(shù)的乙醇對喜樹堿的洗脫效果圖 （n=3）

從圖5可以看出，隨著乙醇的體積分數(shù)增加，對喜樹堿的解析率也不斷增大。當(dāng)乙醇的體積分數(shù)為80%時，喜樹堿的解析率最高為86.34%，所以選擇80%的乙醇作為洗脫劑。

2.3.4 驗證試驗 取3根樹脂柱，AB-8樹脂濕法裝柱，pH為8的上樣液10mL上柱，控制體積流量為0.5mL/min對其吸附。80%的乙醇洗脫樹脂柱，用潔凈干燥的錐形瓶接收洗脫液。HPLC測得3次實驗的喜樹堿質(zhì)量分數(shù)分別為46.9%、45.9%、46.4%，平均質(zhì)量分數(shù)為46.4%，說明該工藝對喜樹堿有較好的富集純化作用。

3 討論

本實驗用靜態(tài)與動態(tài)吸附法篩選出了適合馬比木中喜樹堿分離的大孔樹脂，實驗結(jié)果表明AB-8型大孔樹脂是一種比較理想的樹脂，對喜樹堿的吸附量大，解析率高，適合喜樹堿的分離純化。當(dāng)10 mL上樣液的體積流量為0.5 mL/min、pH 8、20mL 80%乙醇作為洗脫劑時，純化后喜樹堿的質(zhì)量分數(shù)為46.4%。大孔樹脂法操作簡單，成本低廉，經(jīng)過大孔樹脂純化后喜樹堿高度富集，雜質(zhì)減少，該工藝能為馬比木的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，促進喜樹堿抗癌藥物的開發(fā)和研究，有利于自然資源的充分利用和可持續(xù)發(fā)展。

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R284.2

B

1001-1528（2015）08-1859-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.053

2014-03-14

四川省教育廳自然科學(xué)基金重點項目 （12ZA079）；綿陽市科技局重點資助項目 （13G002-2）

羅婭君（1973—），女，博士，教授，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。E-mai1：1uo1aowu@126.com