■朱雪飛 王金榮 尹艷麗 陳培英 趙銀麗 蘇蘭利

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001）

苜蓿是一種優(yōu)質(zhì)的豆科牧草，在我國(guó)有著2 000多年的種植歷史。到2012年，中國(guó)苜蓿的種植面積約為133萬公頃。苜蓿的蛋白質(zhì)含量很高，青飼料中粗蛋白質(zhì)含量為15%～25%[1]，氨基酸組成全面均衡，容易被草食家畜轉(zhuǎn)化利用[2]，是優(yōu)良的蛋白飼料原料，具有“牧草之王”的美稱[3]。近年來，我國(guó)的蛋白質(zhì)飼料原料資源缺乏，開辟新的植物蛋白質(zhì)資源是解決蛋白質(zhì)飼料短缺的途徑之一，苜蓿作為一種優(yōu)良的蛋白飼料資源，提高苜蓿蛋白質(zhì)的利用率對(duì)解決蛋白飼料資源短缺具有積極的意義[4]。

雖然苜蓿是一種優(yōu)良的蛋白質(zhì)資源，但其纖維素含量較高，適口性差，目前多采用微生物發(fā)酵法改善苜蓿草粉的品質(zhì)，提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。微生物發(fā)酵法是一種常用的改善飼料原料品質(zhì)，提高蛋白質(zhì)含量的方法。Hong等采用米曲霉固態(tài)發(fā)酵豆粕，結(jié)果表明所得的發(fā)酵產(chǎn)品中粗蛋白質(zhì)的含量有明顯增加，并且胰蛋白酶抑制劑降解率高達(dá)84.44%[5]。曲敏等在采用嗜酸乳桿菌發(fā)酵制備苜蓿葉蛋白的研究中得到葉蛋白的提取率為14.90%，葉蛋白中粗蛋白質(zhì)的含量為45.08%[6]。酵母菌能夠在發(fā)酵過程中分泌大量水解酶類，利用無機(jī)氮源和碳水化合物合成微生物蛋白，降解抗?fàn)I養(yǎng)因子，并產(chǎn)生生物活性物質(zhì)。利用酵母菌發(fā)酵的豆粕有抗病、強(qiáng)化營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)生長(zhǎng)的效果[7-8]。本試驗(yàn)擬采用啤酒酵母進(jìn)行單因素發(fā)酵試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，最終得到最佳的發(fā)酵條件，以期改善苜蓿草粉的品質(zhì)，降低粗纖維含量，提高苜蓿蛋白質(zhì)的含量。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)首先采用單因素試驗(yàn)，以發(fā)酵后苜蓿粉中的粗蛋白質(zhì)含量及真蛋白質(zhì)含量為檢測(cè)指標(biāo)，篩選出最適的料水比、發(fā)酵溫度、接種量及發(fā)酵時(shí)間；在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用3因素3水平響應(yīng)面分析法對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量的增加量為檢測(cè)指標(biāo)，確定出最佳發(fā)酵條件。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 發(fā)酵菌種

試驗(yàn)所用啤酒酵母菌株來自于河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 ml，pH自然。將馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊，加水煮爛，經(jīng)8層紗布過濾，加入蔗糖，瓊脂，待瓊脂完全溶解后，121℃滅菌25 min。

種子液培養(yǎng)基（PDA液體培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，蒸餾水1 000 ml，pH自然。將馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊，加水煮爛，經(jīng)8層紗布過濾，加入蔗糖，121℃滅菌25 min。

1.2.3 苜蓿

本試驗(yàn)所用的紫花苜蓿均采集于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)基地。將苜蓿自然晾曬干燥后粉碎成草粉備用。

1.2.4 試劑及儀器

試劑：硼酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸（洛陽昊華試劑有限公司）；硫酸（洛陽昊華試劑有限公司）；蔗糖（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；瓊脂粉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；硫酸銅（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；丙酮（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）等。

儀器設(shè)備：DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；K9840自動(dòng)凱氏定氮儀（濟(jì)南海能儀器股份有限公司）；SH220石墨消解儀（濟(jì)南海能儀器股份有限公司）；電爐；馬弗爐等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 啤酒酵母菌種活化及培養(yǎng)

菌種活化：將保存于冰箱中的斜面菌種接種于PDA固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)24 h。

種子液制備：將培養(yǎng)24 h的菌種接種于液體菌種培養(yǎng)基中，28℃，120 r/min條件下震蕩培養(yǎng)14 h。

啤酒酵母生長(zhǎng)曲線測(cè)定：取適量菌種接種于液體PDA培養(yǎng)基中，28℃，120 r/min培養(yǎng)，每隔3 h取樣測(cè)定OD600nm值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600nm值為縱坐標(biāo)繪制啤酒酵母的生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以料水比、發(fā)酵溫度、接種量及發(fā)酵時(shí)間為因素進(jìn)行單因素發(fā)酵試驗(yàn)，以粗蛋白質(zhì)和真蛋白質(zhì)為檢測(cè)指標(biāo)。

采用苜蓿草粉為培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)初始料水比為：1∶0.8、1∶1.2、1∶1.5和1∶1.8，其它條件不變進(jìn)行發(fā)酵；分別選擇25、28、31、34 ℃為發(fā)酵溫度，在其它條件不變的情況下進(jìn)行發(fā)酵；將培養(yǎng)好的種子液按數(shù)量級(jí)為106、107、108和109cfu/g進(jìn)行接種，其它條件不變進(jìn)行發(fā)酵；將發(fā)酵條件分別設(shè)定為36、72、108、144 h，在其它條件不變的情況下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定粗蛋白質(zhì)和真蛋白質(zhì)的含量。根據(jù)所測(cè)粗蛋白質(zhì)和真蛋白質(zhì)含量的高低，確定各個(gè)因素的最佳試驗(yàn)水平。

1.3.2.2 響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用SAS 9.0軟件，根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取對(duì)于發(fā)酵結(jié)果影響較大的料水比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間為因素，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。建立各因素與粗蛋白質(zhì)增加量之間的數(shù)學(xué)模型，通過分析得到最佳發(fā)酵條件。

1.3.3 各指標(biāo)檢測(cè)方法

樣品的制備：發(fā)酵結(jié)束后，65℃風(fēng)干8 h，在空氣中回潮，粉碎，過40目篩。

粗蛋白質(zhì)根據(jù)GB/T6432-1994測(cè)定；真蛋白質(zhì)的檢測(cè)是先將蛋白質(zhì)沉淀，除去非蛋白含氮物質(zhì)，再用凱氏定氮法測(cè)定[9]；粗纖維參照張麗英的濾袋技術(shù)在飼料纖維素分析中的應(yīng)用檢測(cè)[10]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

在本試驗(yàn)中，對(duì)于單因素試驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用SAS 9.0軟件，單因素方差分析中的Duncan's multiplerange test多重比較法進(jìn)行分析。在響應(yīng)面試驗(yàn)中，采用SAS 9.0軟件，Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 啤酒酵母生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600nm為縱坐標(biāo)繪制啤酒酵母的生長(zhǎng)曲線，如圖1所示。啤酒酵母在培養(yǎng)6 h后，OD值快速上升，菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)期；在15 h到18 h中間，OD值逐漸平穩(wěn)，菌株進(jìn)入穩(wěn)定期。因?yàn)樵趯?duì)數(shù)期接種相對(duì)較好，所以，選擇在14 h進(jìn)行接種。

圖1 啤酒酵母的生長(zhǎng)曲線

2.2 啤酒酵母發(fā)酵苜蓿工藝參數(shù)的優(yōu)化

采用單因素試驗(yàn)篩選啤酒酵母發(fā)酵苜蓿粉工藝參數(shù)，選擇料水比、發(fā)酵溫度、接種量及發(fā)酵時(shí)間為試驗(yàn)變量，以測(cè)定粗蛋白質(zhì)及真蛋白質(zhì)含量為參考指標(biāo)，確定各因素在發(fā)酵過程的影響規(guī)律及最佳水平范圍。

2.2.1 料水比對(duì)發(fā)酵的影響（見表1）

表1 料水比對(duì)發(fā)酵苜蓿中粗蛋白質(zhì)及真蛋白質(zhì)含量的影響（%）

由表1可知，隨著培養(yǎng)基含水量的增加，粗蛋白質(zhì)和真蛋白質(zhì)的含量也在逐漸的增加，當(dāng)料水比為1∶1.5時(shí)，粗蛋白質(zhì)的含量達(dá)到26.21%，真蛋白質(zhì)含量為21.18%，高于其它的試驗(yàn)組，故選擇合適的料水比為1∶1.5。

2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵的影響（見表2）

表2 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵苜蓿中粗蛋白質(zhì)及真蛋白質(zhì)的影響（%）

通過表2可見，隨著發(fā)酵溫度的增加，粗蛋白質(zhì)及真蛋白質(zhì)均在28℃達(dá)到最大值26.73%及22.73%。結(jié)合發(fā)酵后苜蓿草粉中粗蛋白質(zhì)及真蛋白質(zhì)含量的變化可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為28℃時(shí)高于其它各組，所以選擇的適宜的發(fā)酵溫度為28℃。

2.2.3 接種量對(duì)發(fā)酵的影響（見表3）

表3 接種量對(duì)發(fā)酵苜蓿中粗蛋白質(zhì)及真蛋白質(zhì)的影響（%）

由表3可見，隨著接種量的增加，粗蛋白質(zhì)的含量增加，當(dāng)接種量為108cfu/g時(shí)，粗蛋白質(zhì)的含量為26.59%，高于其它的接種量組。真蛋白質(zhì)在接種量為109cfu/g時(shí)，達(dá)到最大，綜合真蛋白質(zhì)和粗蛋白質(zhì)的含量變化，所以，選擇接種量為108cfu/g較為適宜。

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響（見表4）

表4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵苜蓿中粗蛋白質(zhì)及真蛋白質(zhì)的影響（%）

由表4可見，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，粗蛋白質(zhì)的含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在108 h最高為26.73%，真蛋白質(zhì)的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加一直增加。結(jié)合粗蛋白質(zhì)及真蛋白質(zhì)二者含量的變化可知，選擇較為適宜的發(fā)酵時(shí)間為108 h。

2.3 響應(yīng)面發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響較大的料水比、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間為因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，進(jìn)行響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)，進(jìn)一步優(yōu)化各因素的參數(shù)值。各因素水平的編碼表見表5，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見6。

利用SAS 9.0軟件對(duì)表6中的響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，響應(yīng)面結(jié)果分析見表7?；貧w模型極顯著(P=0.000 261＜0.01)。并可得到二次多元回歸方程：Y=4.276 667+0.165X1+0.73X2+0.247 5X3-0.417 083X12-0.302 5X1X2+0.002 5X1X3-0.842 083X22-0.322 5X2X3-0.577 083X32。失擬項(xiàng)P=0.167 237＞0.05不顯著，說明模型適當(dāng)，回歸方程擬合度良好?；貧w方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.988 4，校正系數(shù)為0.967 6，表明該模型對(duì)粗蛋白質(zhì)的增加量可以96.76%的解釋。X1，X2，X3的P值均小于0.05，表明料水比、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)苜蓿發(fā)酵過程中粗蛋白質(zhì)含量的變化有顯著的影響，其中發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度的影響較大。

表5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼

表6 Box-Benhnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表7 響應(yīng)面結(jié)果方差分析

對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)，整理方程組得：X1=0.051 3，X2=0.404 8，X3=0.101，將X1、X2、X3代入回歸方程，得到預(yù)測(cè)粗蛋白質(zhì)增加量最大值為4.44%，也就是粗蛋白質(zhì)含量為26.81%。由X1、X2、X3整理得啤酒酵母發(fā)酵苜蓿的最佳條件為料水比1∶1.52，發(fā)酵時(shí)間為122.6 h，發(fā)酵溫度為28.3℃。

2.3.2 模型的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證模型的有效性，對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳條件，即料水比1∶1.52，發(fā)酵時(shí)間122.6 h，發(fā)酵溫度28.3℃進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)3次，測(cè)得粗蛋白質(zhì)的含量為26.65%，與預(yù)測(cè)值26.81%接近，相對(duì)誤差為0.60%。可見該模型可以有效地提高苜蓿粗蛋白質(zhì)的含量。

對(duì)采用最佳條件發(fā)酵的苜蓿草粉進(jìn)行纖維素的檢測(cè)，測(cè)得發(fā)酵后的苜蓿粉纖維素含量為15.73%，比未經(jīng)發(fā)酵的苜蓿纖維素含量19.30%降低了18.50%。這對(duì)于苜蓿草粉粗纖維含量高，適口性差，有較好的改善。

3 討論

本試驗(yàn)通過對(duì)啤酒酵母固態(tài)發(fā)酵苜蓿的工藝進(jìn)行研究，建立了關(guān)鍵影響苜蓿粗蛋白質(zhì)增加量的各因素間的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型：Y=4.276 667+0.165X1+0.73X2+0.247 5X3-0.417 083X12-0.302 5X1X2+0.002 5X1X3-0.842 083X22-0.322 5X2X3-0.577 083X32，確定了啤酒酵母固態(tài)發(fā)酵苜蓿的工藝條件。測(cè)得經(jīng)啤酒酵母發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)的含量為26.65%，比未發(fā)酵時(shí)粗蛋白質(zhì)含量提高19.13%，這與劉照娟采用啤酒酵母發(fā)酵苜蓿草粉時(shí)粗蛋白質(zhì)含量相符合[11]。

在進(jìn)行料水比、發(fā)酵溫度、接種量以及發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響時(shí)，料水比、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時(shí)間對(duì)于發(fā)酵結(jié)果的影響較大。

料水比過高過低，對(duì)于蛋白質(zhì)和真蛋白質(zhì)的含量均有影響，其主要原因是當(dāng)培養(yǎng)基的含水量過高，通透性不好，會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)和代謝，影響發(fā)酵結(jié)果，進(jìn)而影響粗蛋白質(zhì)及真蛋白質(zhì)的含量；當(dāng)培養(yǎng)基含水量過低會(huì)影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用，進(jìn)而影響微生物生長(zhǎng)和代謝。這與嚴(yán)鶴松的試驗(yàn)在發(fā)酵過程中料水比過高過低均會(huì)影響發(fā)酵豆粕粗蛋白質(zhì)的含量的結(jié)果一致[12]。

不同的微生物都會(huì)有其最適的生長(zhǎng)溫度，高于或者低于最適溫度，微生物的生長(zhǎng)和代謝都會(huì)受到影響，從而影響發(fā)酵結(jié)果。從吳勝華等采用啤酒酵母單菌發(fā)酵豆粕的研究中可知，高于或低于最適生長(zhǎng)溫度對(duì)胰蛋白酶抑制因子和小肽的含量均有影響[13]。

隨著接種量的增加，粗蛋白質(zhì)的含量先增加，到接種量為108cfu/g時(shí)，達(dá)到最大，稍后，稍微有減少，但效果不是太明顯，這是因?yàn)榻臃N量過大導(dǎo)致培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，代謝副產(chǎn)物積累，從而影響微生物的生長(zhǎng)，影響發(fā)酵結(jié)果[14]。

在本試驗(yàn)中，粗蛋白質(zhì)的含量增加，是因?yàn)槲⑸锏纳L(zhǎng)要利用吸收培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，培養(yǎng)基的相對(duì)質(zhì)量減少，而氮的總量不變，從而使粗蛋白質(zhì)的含量相對(duì)增加。

4 小結(jié)

通過本試驗(yàn)可以得到啤酒酵母固態(tài)發(fā)酵苜蓿提高粗蛋白質(zhì)含量的最優(yōu)條件為：料水比：1∶1.52，發(fā)酵時(shí)間為122.6 h，發(fā)酵溫度為28.3℃，粗蛋白質(zhì)的含量為26.81%；通過驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得粗蛋白質(zhì)的含量為26.65%，與理論預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差為0.60%，發(fā)酵后的苜蓿粉纖維素含量為15.73%，比未經(jīng)發(fā)酵的苜蓿纖維素含量19.30%降低了18.50%。試驗(yàn)結(jié)果表明該模型能夠使粗蛋白質(zhì)的含量相對(duì)增加，纖維素的含量相對(duì)降低，對(duì)于改善苜蓿粉品質(zhì)，提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量有較好的效果。