高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定人體尿液中11種代謝物

王磊君+李鋼+鄭賽晶+費(fèi)婷+劉鴻+戚大偉

摘 要 采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)定量檢測(cè)人體尿樣中丙烯醛、苯、1，3-丁二烯、苯乙烯、巴豆醛的巰基尿酸類代謝物及氰化氫代謝物。將解凍后的尿樣經(jīng)高速離心后，取100 μL上清液，加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液及850 μL水后上樣分析。色譜分析采用XSELECT HSS T3 C18色譜柱（150 mm×2.1 mm i.d，2.5 μm），以乙腈-15 mmol醋酸銨溶液梯度洗脫，流速250 μL/min，柱溫40 ℃，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）下采用負(fù)離子掃描模式進(jìn)行定量分析。本方法共檢測(cè)了16名吸煙者和6名非吸煙者的尿樣，發(fā)現(xiàn)日吸煙量大于25支的吸煙者尿樣中的煙氣成分代謝物濃度高于非吸煙者。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù); 尿液; 代謝物

1 引 言

卷煙燃燒會(huì)產(chǎn)生大量的揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs），其中就包括丙烯醛、苯、1，3-丁二烯、氰化氫、苯乙烯、巴豆醛等，這些揮發(fā)性有機(jī)物具有較強(qiáng)的致癌或致突變作用[1～3]，吸入后會(huì)對(duì)人體的代謝物產(chǎn)生影響。有些代謝物是吸入卷煙煙氣后由煙氣成分代謝產(chǎn)生的，稱為外源性代謝物;有些則是人體本來(lái)就存在的代謝物，只是因?yàn)槲鼰煂?dǎo)致其含量變化，稱為內(nèi)源性代謝物。隨著吸煙與健康這一話題的日漸升溫，急需建立一種方便可靠的VOCs暴露量評(píng)價(jià)方法，直接針對(duì)代謝物進(jìn)行分析。

目前， 通常采取檢測(cè)呼出氣體、血液及尿液中VOCs代謝物的含量評(píng)價(jià)VOCs的接觸水平。其中檢測(cè)尿樣中VOCs的代謝物對(duì)人體的侵入性低，且取樣方便，同時(shí)尿液中的代謝物相對(duì)于血液中母體化合物生物半衰期更長(zhǎng)、更穩(wěn)定，所以目前檢測(cè)尿液中的代謝物逐漸代替了其它評(píng)價(jià)方法。已有一些文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定這些有害氣體在尿液中的代謝物，包括苯的代謝物苯巰基尿酸（S-PMA）、1，3-丁二烯的代謝物 N-乙?；?S-（3，4-二羥基丁基）-L-半胱氨酸（DHBMA）等[4～8]，主要是針對(duì)一些特定的職業(yè)環(huán)境進(jìn)行的研究，只能評(píng)價(jià)個(gè)別VOCs的影響，而對(duì)于煙氣這種含有多種VOCs的復(fù)雜體系，同時(shí)測(cè)定多種VOCs代謝物的分析方法鮮有報(bào)道。本研究建立了同時(shí)測(cè)定11種代謝物的分析方法，評(píng)價(jià)煙氣中氰化氫、苯乙烯、巴豆醛、苯、1，3-丁二烯對(duì)于人體的接觸水平。本方法前處理簡(jiǎn)單，適合高通量分析，特別適合煙氣中VOCs代謝物研究。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

1200液相色譜儀，配有G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1311A四元混合泵以及G1316A柱溫箱（美國(guó)安捷倫公司）;Eppendorf 5810R 高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）; API4000三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源（ESI）和Analyst1.6軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。乙腈、甲醇（質(zhì)譜級(jí)，德國(guó)默克公司）;醋酸銨（色譜純，德國(guó)默克公司）;代謝物標(biāo)樣及其內(nèi)標(biāo)（詳見(jiàn)表1），其中MHBMA-1和MHBMA-2為1∶1混合物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以兩種物質(zhì)的總量計(jì)（純度均>99%，加拿大多倫多化學(xué)試劑公司）;Milli-Q Intergral純水/超純水一體化系統(tǒng)（德國(guó)Merck Millipore 公司）。

2.2 標(biāo)樣與尿樣樣品準(zhǔn)備

用甲醇將各同位素內(nèi)標(biāo)配制成1 g/L的工作液。采用流動(dòng)相將11種待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量

2.3 液相色譜及質(zhì)譜條件

液相色譜條件：色譜柱 XSELECT HSS T3 C18色譜柱（150 mm×2.1 mm i.d，2.5 μm，美國(guó)Waters公司）; 流動(dòng)相： A為15 mmol/L醋酸銨溶液，B為乙腈; 流速： 0.25 mL/min; 梯度洗脫程序： 0～2 min， 97% A; 2～4 min，97%～5% A; 4～10 min， 5%～10% A; 10～10.5 min， 10%～50% A; 10.5～12.5 min， 50% A; 12.5～13 min， 50%～3% A; 13～20 min， 3% A。

質(zhì)譜條件： 電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子掃描方式，多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）模式; 噴霧（IS）電壓為： Symbolm@@ 4500 V; 霧化氣（Gas1，氮?dú)猓?為344.5 kPa; 氣簾氣（Curtain Gas，氮?dú)猓簤毫椋?206.7 kPa; 輔助霧化氣（Gas2，氮?dú)猓毫?10.0 kPa; 離子源溫度（TEM）為： 600 ℃。

2.4 數(shù)據(jù)分析

為研究吸煙組與非吸煙組尿液代謝物之間的相關(guān)性，依據(jù)卷煙抽吸量不同，采用兩樣本雙向t檢驗(yàn)計(jì)算p值，來(lái)評(píng)估兩組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。當(dāng)p<0.05時(shí)，認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。

3 結(jié)果與討論

3.1 分析條件的優(yōu)化

采用針泵注射的方式掃描標(biāo)準(zhǔn)溶液并得到相應(yīng)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）離子對(duì)，并優(yōu)化各質(zhì)譜參數(shù)（見(jiàn)表2）?？疾炝薃gilent Porshell SB、Waters XSELECT HSS T3、Waters XBridge等色譜柱，最后選擇了分離度更好的XSELECT HSS T3柱，在乙腈-醋酸銨水溶液流動(dòng)相體系下，可以實(shí)現(xiàn)MHBMA的3種同分異構(gòu)體的分離，11種目標(biāo)物的分離效果見(jiàn)圖1。

3.2 質(zhì)譜斷裂機(jī)理研究

研究表明，疏基尿酸類物質(zhì)在負(fù)離子模式下易丟失m/z 129中性分子^[9]，這一特性可以證實(shí)疏基尿酸的存在。例如MHBMA主要以[M-H] Symbolm@@ 離子形式存在，圖2為MHBMA [M-H] Symbolm@@ 離子m/z 232的二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜圖及其碎片離子示意圖。質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明，m/z 232離子在二級(jí)質(zhì)譜中發(fā)生斷裂，生成主要特征離子為m/z 103。這個(gè)特征離子的產(chǎn)生有m/z 232離子及其半胱氨酸主鏈上鍵斷裂，失去m/z 129（C5H7O3N）而得。endprint

3.3 分析方法驗(yàn)證

以11種代謝物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)定量離子的峰面積比（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X（μg/L）進(jìn)行回歸運(yùn)算，得到相應(yīng)的線性回歸方程。11種代謝物的相關(guān)系數(shù)在0.990～0.999之間，表明待測(cè)物有良好的線性關(guān)系。以信噪比（S/N）不低于3時(shí)的進(jìn)樣濃度為檢測(cè)限（LOD），結(jié)果表明，本方法11種代謝物的檢測(cè)限在0.5～30 μg/L之間（表3），除MHBMA3與PMA外，檢出限均優(yōu)于文獻(xiàn)值。

在經(jīng)過(guò)處理的空白尿液樣本中添加低、中、高3種不同濃度的樣品，每個(gè)濃度6份樣品，分別計(jì)算回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明，方法平均回收率為89.8%～123.8%，RSD值在3.1%～14.4%之間（見(jiàn)表3）， 表明本方法結(jié)果準(zhǔn)確，可以滿足定量要求。

3.4 吸煙和非吸煙者尿液樣本的測(cè)定

采用LC-MS/MS法測(cè)試了6名非吸煙者與16名吸煙者24 h尿液中11種代謝物的濃度。從表4可見(jiàn)，吸煙者尿液中幾種代謝物平均值如3HPMA、CEMA、HPMMA等的含量明顯高于非吸煙者，以CEMA為例，日吸煙量高于25支的樣本的平均濃度達(dá)142.8 ng/mL，與非吸煙組對(duì)照計(jì)算得p=0.05（圖3a），說(shuō)明吸煙能顯著影響丙烯醛在尿液中的排出量。1，3-丁二烯的代謝物MHBMA1-3也表現(xiàn)出相同規(guī)律。另外一些巰基尿酸物質(zhì)及氰化氫代謝物ATCA在吸煙者和非吸煙者尿液中含量差異不明顯。以ATCA〖為例（圖3b），日吸煙量高于25支的樣本的p=0.37，并無(wú)明顯相關(guān)性，可能是氫氰酸的代謝也可能來(lái)

自食品或者氨基酸的生物分解^[18]，吸煙者的整體平均值仍高于非吸煙者。同樣，苯的代謝物PMA與DHBMA也可能源于山梨酸，而這是一種食品中常見(jiàn)的防腐劑^[19]。一些代謝物的不相關(guān)性的問(wèn)

題的主要原因可能是：①當(dāng)?shù)乜諝赓|(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生明顯影響，有些揮發(fā)性有機(jī)物如氰化物和苯乙烯并非全部來(lái)自于煙氣，在食品和環(huán)境大氣中也廣泛存在;②不同受試者代謝能力及飲食習(xí)慣有所不同，這些揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)入體內(nèi)的途徑也更多，需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

建立了同時(shí)測(cè)定尿液中氰化氫、苯乙烯、巴豆醛、丙烯醛、苯、1，3丁二烯的相應(yīng)11種代謝物ATCA， PHEMA， MA， HPMMA， CEMA， 3HPMA， PMA， MHBMA1-3和DHBMA的LC-MS/MS方法。該方法操作簡(jiǎn)單選擇性好，靈敏度高，適合于分析吸煙者尿液中相關(guān)代謝物。通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析，可以發(fā)現(xiàn)吸煙者尿液中11種代謝物的平均水平高于非吸煙者，但不同樣本間差異性較大，這應(yīng)該與個(gè)體的代謝能力、飲食習(xí)慣以及當(dāng)?shù)氐目諝赓|(zhì)量有較大關(guān)系，這些差異仍需要深入研究。

References

1 Uchiyama S， Tomizawa T， Inaba Y， Kunugita N. J. Chromatogr. A ， 2013， 1314： 31-37

2 WANG Chun-Lan， WANG Jun-Xia， HU Jing， HU Yu-Ling， LI Gong-Ke. Chinese J. Anal. Chem.， ?2013， ?41（7）： 1069-1073

王春蘭， 汪軍霞， 胡 靜， 胡玉玲， 李攻科. 分析化學(xué)， 2013， ?41（7）： 1069-1073

3 PENG Hui-Min， WU Ming-Jian， REN Feng-Lian， HE Zhi-Hui， LIAN Wen-Liu. Chinese J. Anal. Chem.， ?2007， ?35（2）： 289-292

彭慧敏， 吳名劍， 任鳳蓮， 何智慧， 練文柳. ?分析化學(xué)， 2007， ?35（2）： 289-292

4 Sapkota A， Halden R U， Dominici F， Groopman J D， Buckley T. J. Chem. Biol. Interact.， ?2006， ?160（1）： 70-79

5 Eckert E， Leng G， Gries W， Gen T. J. Chromatogr. B， ?2012， ?889-890： 69-76

6 Petrikovics I， Yu J C C， Thompson D E. J. Chromatogr. B， ?2012， ?891-892： 81-84

7 Schettgen T， Musiol A， Alt A， Kraus T. J. Chromatogr. B， ?2008， ?863（2）： 283-292

8 Carmella S G， Chen M， Han S， Briggs A， Jensen J， Hatsukami D K， Hecht S S. Chem. Res. Toxicol.， ?2009， ?22（4）： 734-741

9 Wagner S， Scholz K， Donegan M， Burton L， Wingate J， Vlkel W. Anal. Chem.， ?2006， ?78（4）： 1296-1305

10 Logue B A， Kirschten N P， Petrikovics I， Moser M A， Rockwood G A， Baskin S I. J. Chromatogr. B， ?2005， ?819（2）： 237-244endprint

11 Schettgen T， Musiol A， Kraus T. Rapid Commun. Mass Spectrom.， ?2008， ?22（17）： 2629-2638

12 Manini P， Andreoli R， Poli D， Palma G D， Mutti A， Niessen W M. Rapid Commun. Mass Spectrom.， ?2002， ?16（24）： 2239-2248

13 Negri S， Maestri L， Andreoli R， Manini P， Mutti A， Imbriani M. Toxicol. Lett.， ?2006， ?162（2-3）： 225-233

14 Alwis K U， Blount B C， Britt A S， Patel D， Ashley D L. Anal. Chim. Acta.， ?2012， ?750： 152-160

15 Schettgen T， Musiol A， Alt A， Ochsmann E， Kraus T. Anal. Bioanal. Chem.， ?2009， ?393（3）： 969-981

16 Hoet P， Smedt E D， Ferrari M， Imbriani M， Maestri L， Negri S， Wilde P D， Lison ?D， Haufroid V. Int. Arch. Occup. Environ. Health， ?2009， ?82（8）： 985-995

17 Paci E， Pigini D， Cialdella A M， Faranda P， Tranfo G. Biomarkers， ?2007， ?12（2）： 111-122

18 Logue B A， Maserek W K， Rockwood G A， Keebaugh M W， Baskin S I. Toxicol. Mech. Methods， ?2009， ?19（3）： 202-208

19 Lovreglio P， Barbieri A， Carrieri M， Sabatini L， Fracasso M E， Doria D， Drago I， Basso A， Errico M N， Bartolucci G B， Violante F S， Soleo L. Int. Arch. Occup. Environ. Health， ?2010， ?83（3）： 341-356

Simultaneous Determination of 11 Volatile Organic Compounds

Metabolites in Human Urine Using High Performance Liquid

Chromatography Coupled with Electrospray

Ionization Tandem Mass Spectrometry

WANG Lei-Jun， LI Gang*， ZHENG Sai-Jing， FEI Ting， LIU Hong， QI Da-Wei

（Technical Center， Shanghai Tobacco Group， Shanghai 200082， China）

Abstract We developed and validated a method using high performance liquid chromatography （HPLC） coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry （ESI-MS/MS） to simultaneously quantify 11 urinary volatile organic compound （VOC） metabolites. The frozen urinary samples were unfrozen at room temperature and centrifuged to remove settled precipitate. 100 μL of the supernatant and 50 μL of internal standard were added and then diluted by 850 μL of water so as to be analyzed by LC-MS/MS. The compounds were separated on a XSELECT HSS T3 column using acetonitrile as mobile phase A and 15 mmol/L ammonium acetate as mobile phase B at a flow rate of 250 μL/min. The analytes were determined qualitatively and quantitatively under multi-reaction monitoring （MRM） and negative polarity mode. The limits of detection ranged from 0.5-30 μg/L and the spiked recoveries of the analytes ranged from 89.8%-123.8% with RSDs of 3.1%-14.4%. This method was applied to 22 h urine samples collected from 16 smokers and 6 non-smokers. The results showed that the contents of the metabolites in smoker′s urine were higher than those of nonsmokers， especially， smoking more than 25 cigarettes per day.

Keywords Liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Urine; Metabolites

（Received 11 June 2014; accepted 12 September 2014）endprint