徐 雯， 李曉天, 翟曉曉， 張玉靜

(鄭州大學(xué) 藥學(xué)院 河南 鄭州 450001)

關(guān)附壬素腸道吸收機(jī)理及最佳吸收部位研究

徐 雯， 李曉天, 翟曉曉， 張玉靜

(鄭州大學(xué) 藥學(xué)院 河南 鄭州 450001)

采用大鼠在體循環(huán)腸灌流吸收模型，以LC-MS法測(cè)定關(guān)附壬素(GFI)的含量來(lái)研究GFI的吸收機(jī)理及最佳吸收部位.結(jié)果表明，在整段腸回流實(shí)驗(yàn)條件下，在1～100 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)藥物吸收量與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，無(wú)高質(zhì)量濃度飽和現(xiàn)象，各質(zhì)量濃度下的吸收速度常數(shù)無(wú)明顯差異；P-糖蛋白抑制劑不影響GFI的腸吸收.在分段腸回流實(shí)驗(yàn)條件下，GFI在腸道各部位的吸收速度按十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸順序下降.GFI在大鼠體內(nèi)的吸收機(jī)制為被動(dòng)擴(kuò)散，十二指腸及空腸是最佳吸收部位.

關(guān)附壬素； LC-MS; 腸灌流實(shí)驗(yàn)

0 引言

關(guān)白附為毛茛科黃花烏頭的塊根，為常見(jiàn)中藥之一，其化學(xué)成分主要有關(guān)附庚素、關(guān)附甲素和關(guān)附壬素等，三者均為二萜類生物堿，目前鹽酸關(guān)附甲素注射液已經(jīng)作為一類新藥上市.據(jù)文獻(xiàn)[1]報(bào)道，關(guān)附壬素具有和關(guān)附甲素相似的抗心律失?；钚郧叶拘暂^低，具有良好的開(kāi)發(fā)前景.據(jù)文獻(xiàn)[2]報(bào)道，關(guān)附壬素的口服生物利用度較高.目前有關(guān)關(guān)附壬素在腸道內(nèi)吸收機(jī)理的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，作者參考相關(guān)腸吸收文獻(xiàn)[3-4],采用大鼠在體循環(huán)腸灌流的方法探討關(guān)附壬素的吸收動(dòng)力學(xué)行為，為關(guān)附壬素或含有關(guān)附壬素的中藥開(kāi)發(fā)為新的劑型提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

鹽酸關(guān)附壬素 ( GFI) 由中國(guó)藥科大學(xué)植物化學(xué)教研室提供；鹽酸菲洛普(內(nèi)標(biāo), DDPH) 由中國(guó)藥科大學(xué)藥物化學(xué)教研室提供； 乙腈(色譜純,美國(guó) Fisher公司)；三乙胺(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；烏拉坦(2015/12， 北京博奧拓達(dá)科技有限公司)；維拉帕米(武漢宏信康精細(xì)化工有限公司)；NaCl，KCl，CaCl2，MgCl2， NaH2PO4·7H2O，葡萄糖，NaHCO3，酚紅等均為分析純；超純水由Mille-Q超純水機(jī)制備.

1.2 主要儀器

BT100-2J蠕動(dòng)泵(保定蘭格恒流泵有限公司)；LC-MS 2010(島津公司)； 752C型分光光度計(jì)(上海分析儀器三廠).

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD♂大鼠，體重 230～250 g，由河南省動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供.

1.4 色譜條件

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱為C8-3( 5 μm, 250 mm×2.1 mm)，流動(dòng)相為乙腈-水(體積比30∶70)，用0.2%冰乙酸水溶液，加入三乙胺適量調(diào)pH至4.0左右, 流速為 0.2 mL/min，柱溫為40 ℃.

1.4.2 質(zhì)譜檢測(cè)條件 電噴霧離子化方式(ESI)，檢測(cè)離子為正離子.在選擇性離子檢測(cè)(SIM)狀態(tài)下，檢測(cè)離子 GFI:m/z388, DDPH：[M+H]+,m/z344.CDL 溫度為250 ℃,加熱器溫度為200 ℃，CDL電壓為25 V,探針電壓為4.5 kV, 檢測(cè)電壓為1.65 kV, N2流速為1.5 L/min.

1.5 溶液的配制

1.5.1 10 g/L GFI溶液的配制 取GFI標(biāo)準(zhǔn)品1 g加入水中，加0.1 mol/L鹽酸溶液數(shù)滴，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為GFI標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液.

1.5.2 1 g/L DDPH溶液的配制 取DDPH標(biāo)準(zhǔn)品100 mg加入水中，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為DDPH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液.

1.5.3 Krebs-Ringer緩沖液的配制 每1 L水內(nèi)含NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl20.37 g，MgCl20.22 g，NaH2PO40.22 g，葡萄糖1.4 g，NaHCO31.37 g，pH為7.4.

1.5.4 酚紅母液的配制 精密稱取酚紅50 mg置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水約70 mL超聲溶解,用蒸餾水定容.

1.5.5 酚紅標(biāo)準(zhǔn)液的配制 精密吸取酚紅母液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.6 mL，用D-PBS緩沖液分別稀釋至10 mL，配制5，10，20，30，40，50，60，80 mg/L的酚紅標(biāo)準(zhǔn)液.

1.5.6 循環(huán)液的配制 取用Krebs-Ringer緩沖液，加酚紅母液，使酚紅質(zhì)量濃度為20 mg/L.取50 mL加入規(guī)定量的GFI，使其質(zhì)量濃度分別為1,10,100,1 000 mg/L.

1.6 小腸循環(huán)液的處理

將小腸循環(huán)液于15 000 r/min離心10 min，精密吸取上清液適量，用Mille-Q超純水稀釋至一定倍數(shù)后，混勻，于15 000 r/min離心5 min，取上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取濾液10 μL進(jìn)樣測(cè)定.另取0.5 mL小腸循環(huán)液加5 mL的1 mol/L NaOH溶液顯色，用752C型分光光度計(jì)在550 nm處測(cè)定酚紅吸收度.

2 方法學(xué)研究

2.1 方法的專屬性

分別取0.1 mL空白循環(huán)液、0.1 mL空白循環(huán)液加GFI對(duì)照品和0.1 mL GFI循環(huán)液，按“1.6”項(xiàng)下操作，其色譜圖如圖1～3所示.結(jié)果表明,樣品在該色譜條件下無(wú)雜質(zhì)干擾，說(shuō)明方法的專屬性好，此條件所測(cè)的結(jié)果能代表原藥濃度.

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取含酚紅20 mg/L的Krebs-Ringer緩沖液，加入不同量的GFI標(biāo)準(zhǔn)品，分別配成含GFI質(zhì)量濃度為0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0 mg/L和酚紅質(zhì)量濃度為20 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.6”項(xiàng)下操作，記錄峰面積.利用標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作直線回歸，結(jié)果表明，在0.02～1.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，GFI的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.067 3X+0.102 4,R=0.998 9.

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取0.05，0.2，1.0 mg/L的GFI標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.6”項(xiàng)下操作，記錄峰面積，測(cè)定日內(nèi)變異和5 d的日間變異(表1).結(jié)果表明，日內(nèi)及日間變異系數(shù)在低質(zhì)量濃度和中質(zhì)量濃度時(shí)均小于15%，在高質(zhì)量濃度時(shí)小于10%，本方法測(cè)定的精密度和準(zhǔn)確度良好.

2.4 藥物在空白小腸循環(huán)液中的穩(wěn)定性

在空白小腸循環(huán)液中加入適量的GFI,配制成質(zhì)量濃度為0.05,0.2,1.0 mg/L的溶液各3份，于(37±0.5) ℃孵育3 h，測(cè)定孵育前后藥物的質(zhì)量濃度，并計(jì)算孵育后藥物質(zhì)量濃度的剩余百分比.結(jié)果表明，GFI孵育液的藥物質(zhì)量濃度分別為原藥物質(zhì)量濃度的(99.22±2.04)%(n=3),可以認(rèn)為GFI在小腸循環(huán)液中是穩(wěn)定的，藥物不被小腸循環(huán)液破壞.

2.5 腸壁對(duì)藥物的物理吸附作用

剪取清洗后的大鼠各腸段約10 cm(共4段)，將黏膜層翻出，置于供試藥液(藥物質(zhì)量濃度為10 mg/L)中,于(37±0.5) ℃孵育3 h，測(cè)定孵育前后藥物的質(zhì)量濃度，并計(jì)算孵育后藥物質(zhì)量濃度的剩余百分比.結(jié)果表明， GFI孵育液的藥物質(zhì)量濃度分別為原藥物質(zhì)量濃度的(99.47±2.01)%(n=3),可以認(rèn)為大鼠腸壁對(duì)GFI基本無(wú)物理吸附作用.

3 大鼠在體循環(huán)腸灌流實(shí)驗(yàn)

3.1 手術(shù)

手術(shù)參照大鼠在體循環(huán)實(shí)驗(yàn)方法[5]并略加改進(jìn).將禁食12 h的大鼠，用20%烏拉坦溶液麻醉并加以固定，打開(kāi)腹腔，接好循環(huán)裝置，加入50 mL GFI分別為1,10,100 mg/L的循環(huán)液，通氣攪拌，水浴(37±0.5) ℃保溫.以2 mL/min的流速循環(huán)10 min，取樣1 mL，作為零時(shí)間點(diǎn),然后將流速調(diào)至1 mL/min，分別在15 min，30 min，1 h，1.5 h，2 h，2.5 h和3 h取樣1 mL，同時(shí)補(bǔ)加相同體積的20 mg/L純酚紅液.以LC-MS法測(cè)定灌流液中GFI的含量變化，考察在不同質(zhì)量濃度下GFI在整個(gè)腸段的吸收情況.用紫外分光光度計(jì)測(cè)定灌流液中酚紅質(zhì)量濃度的變化，并校正灌流液體積的變化.和整段腸灌流實(shí)驗(yàn)操作一樣，分段腸灌流觀察的腸段區(qū)間皆取10 cm，各腸段區(qū)間如下：十二指腸段自幽門(mén)10 cm處開(kāi)始；空腸段自幽門(mén)25 cm處開(kāi)始；回腸段從盲腸上行20 cm處開(kāi)始；結(jié)腸段從盲腸后段開(kāi)始.循環(huán)液中藥物質(zhì)量濃度為10 mg/L，以考察藥物的最佳吸收部位.

3.2 P-gp抑制劑對(duì)GFI吸收的影響

在10 mg/L GFI灌流液中加入100 μmol/L P-gp抑制劑維拉帕米,并設(shè)置對(duì)照組，進(jìn)行大鼠腸灌流實(shí)驗(yàn)，其他步驟同“1.6”項(xiàng)下操作，考察P-gp抑制劑對(duì)GFI吸收的影響，判斷其吸收是否受到P-gp外排作用.

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 在體小腸吸收實(shí)驗(yàn)

在大鼠整段小腸吸收實(shí)驗(yàn)中,分別灌流高、中、低 3個(gè)不同質(zhì)量濃度的GFI供試液,循環(huán)灌流3 h后,以剩余藥量的對(duì)數(shù)值對(duì)取樣時(shí)間作圖,求得GFI吸收速度常數(shù)Ka、藥物在3 h內(nèi)的吸收量和3 h內(nèi)藥物吸收百分?jǐn)?shù),結(jié)果見(jiàn)表2.由表2可見(jiàn)，藥物吸收量隨GFI質(zhì)量濃度的增加而增大.將表2中3組數(shù)據(jù)的吸收速度常數(shù)進(jìn)行方差分析,結(jié)果表明, 高、中、低質(zhì)量濃度下GFI的吸收速度常數(shù)間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05).根據(jù)Fick定律，可以認(rèn)為在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，GFI的小腸吸收過(guò)程均屬于被動(dòng)擴(kuò)散.

4.2 P-gp抑制劑對(duì)GFI吸收的影響分析

P-gp抑制組的吸收百分?jǐn)?shù)和Ka分別為(76.27±16.88)%,(0.203±0.021) h-1；對(duì)照組的吸收百分?jǐn)?shù)和Ka分別為(77.46±18.24)%，(0.213±0.016 ) h-1.經(jīng)方差分析，兩組無(wú)明顯差異，說(shuō)明該類藥物不是P-糖蛋白底物，藥物的吸收不受P-糖蛋白抑制劑的影響.

4.3 在體小腸不同腸段吸收比較

將含有GFI質(zhì)量濃度為10 mg/L的小腸循環(huán)液在不同腸段循環(huán)灌流3 h后，用剩余藥量的對(duì)數(shù)值對(duì)取樣時(shí)間作圖,得到了GFI在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的吸收速度常數(shù)Ka，分別為(0.154±0.012)，(0.152±0.016)，(0.050±0.007)，(0.037±0.004) h-1.結(jié)果表明，GFI在大鼠的整個(gè)腸段都有吸收，但是吸收速度常數(shù)按十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸順序依次下降，兩兩比較除十二指腸和空腸無(wú)顯著性差異外，回腸與結(jié)腸和十二指腸或空腸比較均有顯著性差異，表明十二指腸及空腸是GFI的最佳吸收部位，回腸與結(jié)腸吸收較差.

5 討論

應(yīng)用大鼠在體循環(huán)腸灌流法對(duì)GFI的吸收機(jī)理及最佳吸收部位進(jìn)行了研究.由于實(shí)驗(yàn)中不損傷大的血管和神經(jīng)，藥物通過(guò)上皮后即被血液運(yùn)走，避免了胃內(nèi)容物及消化管故有運(yùn)動(dòng)的生理影響，能較真實(shí)地反映藥物在小腸的吸收情況.缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處于麻醉狀態(tài)，循環(huán)液的流動(dòng)對(duì)腸道菌有影響，且在給藥方式上只能限制在溶液狀態(tài)給藥.由于藥物的吸收受溫度的影響[6]，因此，實(shí)驗(yàn)中使供試液溫度保持在37 ℃左右，同時(shí)，將用溫水浸泡的棉紗敷在大鼠腹部，對(duì)其保濕、保溫.藥物流經(jīng)腸道時(shí)，由于藥物的吸收，使其在腸道各部位的濃度不相同，且是流速與腸腔半徑的函數(shù)，增大循環(huán)速度，可使腸道各部位的濃度接近相等；但是腸道非流動(dòng)水層的屏障厚度與循環(huán)速度有關(guān)，流速較大時(shí)將使非流動(dòng)水層變薄，而使吸收人為增加，偏離正常條件[7],實(shí)驗(yàn)采用1 mL/min流速進(jìn)行循環(huán).

藥物吸收機(jī)理可分為被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)和主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)兩種.在高濃度時(shí)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)化合物的吸收能被飽和，其吸收能被酶抑制劑抑制且具有能量依賴性.以被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式吸收的藥物在很大質(zhì)量濃度范圍內(nèi)按Fick方程吸收，在吸收面積不變的情況下，隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，吸收量線性增大，而吸收速度常數(shù)不變.主動(dòng)吸收所需的轉(zhuǎn)運(yùn)酶的數(shù)量有限，在較低質(zhì)量濃度時(shí)，隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，參與轉(zhuǎn)運(yùn)的酶沒(méi)有達(dá)到飽和，因此吸收量隨之增加，但是在較高質(zhì)量濃度時(shí)，所有的酶都已參與轉(zhuǎn)運(yùn)而達(dá)到飽和，此時(shí)再增加藥物的質(zhì)量濃度，吸收量不再增大，其吸收符合米氏方程.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在1～100 mg/L范圍內(nèi)GFI在大鼠小腸的吸收量與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，無(wú)高質(zhì)量濃度飽和現(xiàn)象，高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的吸收速度常數(shù)無(wú)明顯變化，提示GFI在大鼠小腸的吸收主要以被動(dòng)擴(kuò)散的方式.加入抑制劑維拉帕米后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明該類藥物不是P-糖蛋白底物，藥物的吸收不受P-糖蛋白抑制劑的影響.分段腸灌流實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， GFI在大鼠的整個(gè)腸段都有吸收，但是吸收速度常數(shù)為十二指腸>空腸>回腸>結(jié)腸，兩兩比較除十二指腸和空腸無(wú)顯著性差異外，其他均有顯著性差異，表明十二指腸及空腸是GFI的最佳吸收部位.

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(責(zé)任編輯：孔 薇)

Study on the Intestinal Absorption Mechanism and the Best Absorption Segments of GFI

XU Wen, LI Xiaotian, ZHAI Xiaoxiao, ZHANG Yujing

(SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

Rat intestine reperfusion experiment was carried out and LC-MS method for determining the content of GFI was used to study the absorption mechanism of GFI and the best absorption area. When the concentration was raised from 1 to 100 mg/L, the uptake of GFI increased and did not appear saturable, whereas the absorption rate constants for the high dosage groups, middle dosage groups and low dosage groups were no significance. And there were different rates of absorption in different parts of intestine, the absorption rate constant was as follows: duodenum>jejunum>ileum>colon. P-gp inhibitor had no effect on the absorption of GFI. The experiment results suggested that the absorption mechanism of GFI was mainly via passive diffusion, and the duodenum and jejunum were the best absorption segments of GFI.

GFI; LC-MS; intestine reperfusion experiment

2015-06-01

徐雯(1990—),女，浙江湖州人，碩士研究生，主要從事藥代動(dòng)力學(xué)研究；通訊作者：李曉天(1965—)，男，河南許昌人，教授，主要從事藥代動(dòng)力學(xué)研究，E-mail:lixt@zzu.edu.cn.

徐雯，李曉天,翟曉曉，等.關(guān)附壬素腸道吸收機(jī)理及最佳吸收部位研究[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版，2015，47(4)：76-80.

R969.1

A

1671-6841(2015)04-0076-05

10.3969/j.issn.1671-6841.2015.04.015