宋晶晶

（浙江省立同德醫(yī)院，浙江 杭州310012）

·實(shí)驗(yàn)研究·

水飛薊賓體外抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480生長和TGF-β誘導(dǎo)的侵襲轉(zhuǎn)移

宋晶晶

（浙江省立同德醫(yī)院，浙江 杭州310012）

目的探討水飛薊賓對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的生長及對侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用。方法 將人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480用不同濃度的水飛薊賓治療后，采用MTT法檢測水飛薊賓對SW480細(xì)胞增殖的抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測水飛薊賓是否能誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡和周期阻滯；將SW480細(xì)胞置于2ng/mL的TGF-β中培養(yǎng)，用transwell技術(shù)檢測水飛薊賓是否能抑制SW480細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力；Western blot檢測腫瘤侵襲力相關(guān)蛋白MMP-9和vimentin的表達(dá)。結(jié)果水飛薊賓可顯著抑制SW480細(xì)胞的增殖并使細(xì)胞進(jìn)入G2/M阻滯；水飛薊賓可顯著抑制SW480細(xì)胞TGF-β依賴的侵襲轉(zhuǎn)移效應(yīng)，并降低MMP-9和vimentin的表達(dá)。結(jié)論水飛薊賓抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480生長和侵襲轉(zhuǎn)移。

結(jié)腸癌；水飛薊賓；SW480；TGF-β；侵襲轉(zhuǎn)移

水飛薊賓(silibinin）是水飛薊素（silymarin）中最主要的生物活性成分，臨床上主要用于保肝護(hù)肝[1]。近年來，水飛薊賓還被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤的活性，對于多種腫瘤均具有良好的抑制作用[2-3]，然而對結(jié)腸癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用卻很少報(bào)道。

本文通過研究水飛薊賓體外對人結(jié)腸癌細(xì)胞系

SW480的生物效應(yīng)，探討水飛薊賓對SW480細(xì)胞生長及侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用。

1 材料與方法

1.1材料 本研究于2012年8月~2014年4月在浙江省立同德醫(yī)院檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室完成。人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞系購于美國ATCC(美國模式培養(yǎng)物保藏所），RPMI-1640培養(yǎng)基購于Gibco公司（11875-085），胎牛血清（FBS）購于杭州四季青生物工程有限公司 （HB0205），transwell小室購于美國Corning公司（3421）；水飛薊賓（S0417），四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，M2128），Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（APOAF-20TST），碘化丙啶（PI，P4170）購于美國Sigma公司；β-actin（#4967）、MMP-9（#3852）、vimentin抗體 （#3932）購自美國Cell signal公司；BCA試劑盒購于美國Pierce公司（#23227）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃含5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2~3天傳代一次，實(shí)驗(yàn)選用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn) 將SW480細(xì)胞按1× 103/孔接種于96孔板，加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基200μL，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)組分別加入50、100、150、200μmol/L不同濃度的水飛薊賓培養(yǎng)24、48和72小時(shí)，對照組為相同培養(yǎng)條件下不加水飛薊賓培養(yǎng)。加5mg/mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。棄上清液，往孔中加150μL二甲基亞砜（DMSO），570nm波長下用酶標(biāo)儀檢測OD值，結(jié)果以3次實(shí)驗(yàn)的平均值表示。腫瘤細(xì)胞生長抑制率=1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值。

1.2.3細(xì)胞周期檢測 在SW480細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入50、100、150、200μmol/L的水飛薊賓培養(yǎng)24小時(shí)，對照組為相同培養(yǎng)條件下不加水飛薊賓培養(yǎng)。收集細(xì)胞，用70%乙醇在4℃固定過夜后用PBS清洗，加入50μg/mL RNA酶，100μg/mL PI在

暗處染色30分鐘后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，PI的熒光強(qiáng)度表示為細(xì)胞DNA的含量，腫瘤細(xì)胞的G2/M阻滯可用G2期細(xì)胞所占比率表示[4]。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測 在SW480細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入50、100、150、200μmol/L的水飛薊賓培養(yǎng)24小時(shí)，對照組為相同培養(yǎng)條件下不加水飛薊賓培養(yǎng)。收集細(xì)胞，按照試劑說明書將PI和Annexin-V加入細(xì)胞中孵育20分鐘，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡，Annexin-V陽性細(xì)胞越多說明細(xì)胞凋亡程度越大。

1.2.5腫瘤細(xì)胞侵襲試驗(yàn) 在transwell小室中接種1×104個(gè)SW480細(xì)胞置于24孔板中，實(shí)驗(yàn)組在上室中加入2ng/mL轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）及50、100、150和200μmol/L的水飛薊賓，所用培養(yǎng)基為無血清RPMI-1640，下室培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI-1640。培養(yǎng)24小時(shí)后取出transwell小室，用PBS洗去小室內(nèi)的細(xì)胞，將transwell膜用3%多聚甲醛固定15分鐘后，用0.1%結(jié)晶紫染色20分鐘，低倍鏡（100倍）觀察4個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。

1.2.6Western blot試驗(yàn) SW480細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入50、100、150、200μmol/L的水飛薊賓培養(yǎng)24小時(shí)，對照組為相同培養(yǎng)條件下不加水飛薊賓培養(yǎng)。然后用細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂解后用BCA試劑盒做蛋白定量并將不同實(shí)驗(yàn)組調(diào)成相等蛋白濃度，Western blot檢測波形蛋白（vimentin）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)，蛋白表達(dá)量由它們在膠片上顯色后的灰度與相應(yīng)β-actin的灰度比表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（）表示，并用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，組間比較采用非配對雙邊t檢驗(yàn)以及單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1水飛薊賓對人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480增殖和凋亡的影響 MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示SW480細(xì)胞在水飛薊賓作用下細(xì)胞增殖活性受到明顯抑制，呈劑量依賴性。48小時(shí)和72小時(shí)治療組與24小時(shí)治療組比較，水飛薊賓對SW480細(xì)胞的抑制作用顯著增加，表明水飛薊賓對結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的殺傷作用有時(shí)間依賴性（表1）。另外，凋亡試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水飛薊賓能誘導(dǎo)SW480細(xì)胞發(fā)生凋亡 （第77頁圖2）。這些結(jié)果證實(shí)了水飛薊賓具有體外抗結(jié)腸癌作用。

表1 水飛薊賓對SW480細(xì)胞的抑制作用（）

與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與同濃度水飛薊賓組治療24小時(shí)抑制率比較△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 n/孔對照組 30 0 0 50μmol/L水飛薊賓組 3 4.1±1.1 9.5±2.8*19.3±3.9**△100μmol/L水飛薊賓組 3 14.5±3.7*32.8±4.7**△△44.5±4.9**△△150μmol/L水飛薊賓組 3 28.4±4.1**47.5±5.6**△△71.2±6.6**△△200μmol/L水飛薊賓組 3 42.5±6.3**72.4±5.9**△△89.4±7.5**△△抑制率（%）24h 48h 72h

2.2水飛薊賓誘導(dǎo)SW480細(xì)胞周期進(jìn)入G2/M阻滯 細(xì)胞周期的阻滯將抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，隨著水飛薊賓劑量的增加，進(jìn)入G2期的SW480細(xì)胞比例顯著增加（表2），表明水飛薊賓對SW480細(xì)胞有G2/M阻滯作用，使腫瘤細(xì)胞的增殖周期停滯，從而抑制和殺傷結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞。

表2 水飛薊賓對SW480細(xì)胞周期的生物效應(yīng)（）

與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組別 n/孔 G2/M阻滯（%）對照組 3 2.4±0.4 50μmol/L水飛薊賓組 3 4.6±0.9 100μmol/L水飛薊賓組 3 7.7±1.5*150μmol/L水飛薊賓組 3 18.7±3.3**200μmol/L水飛薊賓組 3 26.8±4.8**

2.3水飛薊賓抑制TGF-β誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移 為了研究水飛薊賓對SW480細(xì)胞侵襲和

轉(zhuǎn)移的抑制作用，將SW480細(xì)胞接種于transwell小室中，并在無血清條件下加入TGF-β模擬體內(nèi)的腫瘤侵襲過程。將SW480細(xì)胞用不同濃度的水飛薊賓治療24小時(shí)，顯微鏡計(jì)數(shù)transwell膜上的細(xì)胞數(shù)，測定SW480細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著水飛薊賓劑量的增加，transwell膜上的細(xì)胞數(shù)顯著減少（表3），表明水飛薊賓能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。為了在蛋白水平上進(jìn)一步研究水飛薊賓對SW480細(xì)胞侵襲能力的影響，用Western blot法檢測TGF-β依賴腫瘤侵襲相關(guān)蛋白vimentin和MMP-9的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著水飛薊賓劑量的增加，vimentin和MMP-9的表達(dá)降低，詳見圖1。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示水飛薊賓通過下調(diào)SW480細(xì)胞vimentin和MMP-9的表達(dá)抑制TGF-β誘導(dǎo)的腫瘤侵襲能力。

表3 水飛薊賓對SW480細(xì)胞侵襲能力的抑制作用（）

與TGF-β組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組別n/孔 細(xì)胞數(shù)（個(gè)） 灰度比（vimentin/β-actin） 灰度比（MMP-9/β-actin）對照組3187±480.35±0.060.30±0.05 TGF-β組3665±830.89±0.150.78±0.11 50μmol/L水飛薊賓+TGF-β組3598±890.81±0.130.70±0.12 100μmol/L水飛薊賓+TGF-β組3421±65**0.67±0.12*0.57±0.09*150μmol/L水飛薊賓+TGF-β組3219±42**0.38±0.08**0.41±0.06**200μmol/L水飛薊賓+TGF-β組3146±39**0.31±0.04**0.34±0.05**

3 討論

近年來，由于人們飲食習(xí)慣和生活方式的改變，結(jié)腸癌發(fā)病率逐年上升，已成為世界上最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和致死率居第二位[5]。因此研究新的治療結(jié)腸癌的藥物具有重要意義。在本研究中，作者通過MTT法和細(xì)胞周期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水飛薊賓具有良好的體外抗結(jié)腸癌生長的作用，而Annexin V染色法實(shí)驗(yàn)結(jié)果則發(fā)現(xiàn)水飛薊賓還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，這些結(jié)果都提示了水飛薊賓良好的抗腫瘤活性。

致癌基因的表達(dá)及細(xì)胞微環(huán)境的變化使組織上皮細(xì)胞逐漸癌變形成癌細(xì)胞，在腫瘤發(fā)展過程中癌細(xì)胞逐漸失去上皮細(xì)胞特征并獲得間充質(zhì)細(xì)胞特性，這一過程稱之為上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型（EMT）。通過EMT，腫瘤細(xì)胞獲得侵襲正常組織的能力，并向周邊組織逐漸形成轉(zhuǎn)移灶，它是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程，是腫瘤的發(fā)展和致死的關(guān)鍵因素[6-7]。在結(jié)腸癌的發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中的TGF-β對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。腫瘤細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子Smad4功能的失活使TGF-β從腫瘤抑制因子轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤促進(jìn)因子，并通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞骨架蛋白如vimentin及MMP-9等的表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[8-10]。而在本研究中，作者通過transwell試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水飛薊賓可有效抑制TGF-β誘導(dǎo)SW480侵襲轉(zhuǎn)移能力，而Western blot試驗(yàn)則提示其抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制可能為下調(diào)SW480細(xì)胞MMP-9和vimentin的表達(dá)。

綜上所述，水飛薊賓具有良好的結(jié)腸癌細(xì)胞抑制活性并能顯著抑制TGF-β誘導(dǎo)的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，為水飛薊賓治療結(jié)腸癌提供了理論依據(jù)。

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