徐慧君，譚細(xì)鳳

（武警浙江總隊(duì)嘉興醫(yī)院，浙江嘉興314000）

·實(shí)驗(yàn)研究·

桔梗皂苷D聯(lián)合多柔比星協(xié)同殺傷Hela細(xì)胞及其機(jī)制研究

徐慧君，譚細(xì)鳳

（武警浙江總隊(duì)嘉興醫(yī)院，浙江嘉興314000）

目的探討桔梗皂苷D是否能增強(qiáng)多柔比星對宮頸癌細(xì)胞的殺傷活性及機(jī)制。方法MTT法檢測多柔比星單獨(dú)治療及聯(lián)合桔梗皂苷D治療對宮頸癌細(xì)胞系Hela的殺傷活性。用熒光定量PCR方法檢測人正常宮頸上皮細(xì)胞系CRL-2614及宮頸癌細(xì)胞系Hela、SiHa和C-33a的PKM2表達(dá)水平。將Hela細(xì)胞用桔梗皂苷D和多柔比星處理后，用熒光定量PCR方法檢測Hela細(xì)胞PKM2的表達(dá)水平。將Hela細(xì)胞用桔梗皂苷D和多柔比星處理后，檢測Hela細(xì)胞葡萄糖的攝取能力和乳酸生成能力。構(gòu)建PKM2真核表達(dá)載體，MTT法檢測PKM2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對桔梗皂苷D聯(lián)合多柔比星對Hela細(xì)胞活力抑制率的影響。結(jié)果對照組，1μmol/L桔梗皂苷D組，5μmol/L桔梗皂苷D組，10μmol/L桔梗皂苷D組，0.1 mg/L多柔比星組，0.5 mg/L多柔比星組，1 mg/L多柔比星組對Hela細(xì)胞活力的抑制率分別為0、（4.5±0.4）%、（21.2±1.8）%、（55.4±4.2）%、（7.0±1.1）%、（27.6±2.1）%、（60.8± 5.2）%，不同濃度桔梗皂苷D組間及多柔比星組間對Hela細(xì)胞的抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。1μmol/L桔梗皂苷D對Hela細(xì)胞的抑制率為（4.1±0.4）%，0.1 mg/L多柔比星對Hela細(xì)胞的抑制率為（7.2±0.6）%，兩者聯(lián)合對Hela細(xì)胞的抑制率達(dá)到 （59.5±3.9）%。正常宮頸上皮細(xì)胞系CRL-2614及宮頸癌細(xì)胞系Hela、SiHa、C-33a的PKM2相對表達(dá)量為別為1.00±0.03、17.5±0.6、12.4±0.4、13.8±0.5，三種宮頸癌細(xì)胞系的PKM2表達(dá)量與CRL-2614細(xì)胞系相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對照組相比，桔梗皂苷D組的PKM2相對表達(dá)水平，葡萄糖相對攝取量及乳酸相對生成量均顯著下降，且與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。轉(zhuǎn)染PKM2表達(dá)載體后，桔梗皂苷D聯(lián)合多柔比星對Hela細(xì)胞的抑制率從 （60.1±4.2）%下降到 （22.4±2.1）%，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論桔梗皂苷D通過下調(diào)PKM2的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的糖代謝，協(xié)同多柔比星殺傷宮頸癌Hela細(xì)胞系。

宮頸癌；桔梗皂苷D；丙酮酸激酶M2；糖代謝；Hela；多柔比星

宮頸癌是全球發(fā)病率第二位的婦科腫瘤，每年有超過50萬患者被診斷為宮頸癌，化療目前仍是治療宮頸癌的主要手段[1]。多柔比星是一種抗腫瘤藥物，通過抑制腫瘤細(xì)胞DNA/RNA的生物合成起到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的，但腫瘤細(xì)胞的藥物抵抗往往制約著多柔比星的臨床應(yīng)用[2]。因此，尋找其他的藥物與多柔比星進(jìn)行聯(lián)合用藥以增強(qiáng)多柔比星的抗腫瘤活性是目前腫瘤治療研究的重點(diǎn)。本研究從2013年1月~2015年5月完成于本院實(shí)驗(yàn)室，研究的目的在于探討桔梗皂苷D是否能增強(qiáng)多柔比星對宮頸癌細(xì)胞的殺傷活性，并研究其具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌細(xì)胞系Hela、SiHa、C-33a及人正常宮頸上皮細(xì)胞系CRL-2614購于中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。所有細(xì)胞系培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并將細(xì)胞置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通入5% CO2。細(xì)胞每2~3天傳代一次，傳代時(shí)，用胰酶消化液使細(xì)胞進(jìn)入懸浮狀態(tài)并用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，將細(xì)胞懸液按1:3稀釋后傳代。

1.1.2試劑 多柔比星， 噻唑藍(lán) [3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium

bromide，MTT]購于美國Sigma-Aldrich公司，桔梗皂苷D購于美國Sigma-Aldrich公司（SMB00424）。DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco。Trizol試劑，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，pcDNA3.1，Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen。葡萄糖檢測試劑盒 （Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase assay kit）購于美國Molecular Probes公司，乳酸檢測試劑盒（Lactate assay kit）購于美國BioVision公司。SYBR Green試劑購于日本TaKaRa。PKM2和GAPDH（內(nèi)參）PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下:PKM2上游:5’-GCCTGGCGCCCATTACCA-3’，下游:5’-CCCACTGCAGCACTTGAAG-3’;GAPDH上游:5′-CACTCCTCCACCTTTGA-3′，GAPDH下游:5′-CCACCACCCTGTTGCTG-3′。

1.2方法

1.2.1熒光定量PCR檢測PKM2的表達(dá) 分別檢測Hela、SiHa、C-33a以及CRL-2614中PKM2的表達(dá)水平，所有細(xì)胞的總RNA用Trizol試劑提取，之后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書步驟進(jìn)行cDNA的合成。以該cDNA為模板，在PCR體系中加入PKM2或GAPDH的引物，再加入SYBR Green試劑，按照SYBR Green操作說明書步驟進(jìn)行PKM2基因的定量PCR實(shí)驗(yàn)，PKM2的相對表達(dá)由2-△△CT法計(jì)算[3]。

1.2.2Hela細(xì)胞葡萄糖的攝取及乳酸的檢測 用葡萄糖檢測試劑盒檢測DMEM培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度，用C0表示。將Hela細(xì)胞按1×104/孔接種在96孔板上，加入200μL DMEM培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入桔梗皂苷D及多柔比星處理2小時(shí) （對照組不加藥物處理2小時(shí)），按照試劑盒說明書步驟檢測培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度，用C表示，則各組葡萄糖絕對攝取量△C=C0-C。葡萄糖的相對攝取量可用以下公式計(jì)算：葡萄糖相對攝取量=（△C對照組-△C治療組）/△C對照組。乳酸的相對生成量檢測步驟及計(jì)算方法與葡萄糖相同。

1.2.3質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 將PKM2基因的開放閱讀框架全序列（Gene ID:NM_001206796）以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成pcDNA3.1-PKM2重組真核表達(dá)質(zhì)粒[4]，質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine 2000按照試劑操作說明書步驟進(jìn)行，將pcDNA3.1-PKM2（2 mg/L）轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞中，培養(yǎng)24小時(shí)。

1.2.4MTT法檢測藥物對腫瘤細(xì)胞殺傷活性 將Hela細(xì)胞按 5×103/孔接種在 96孔板上。將pcDNA3.1-PKM2（2 mg/L）轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞中，孵育24小時(shí)。然后再分別加入1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L桔梗皂苷 D及 0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L多柔比星培養(yǎng)48小時(shí)。之后加5mg/mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。棄上清，在570nmol/L波長下用酶標(biāo)儀檢測OD值，細(xì)胞活力抑制率用以下公式計(jì)算：抑制率=（OD對照組-OD治療組）/OD對照組×100%。為了研究桔梗皂苷D對多柔比星的協(xié)同抗腫瘤作用，作者根據(jù)兩者單獨(dú)治療對Hela細(xì)胞的殺傷活性來選擇桔梗皂苷D及多柔比星的聯(lián)合治療濃度。選擇桔梗皂苷D或多柔比星單獨(dú)治療僅輕微殺傷Hela細(xì)胞時(shí)的濃度作為兩者聯(lián)合的濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（）表示，并用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，采用非配對雙邊t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1桔梗皂苷D與多柔比星對Hela細(xì)胞的抑制作用 桔梗皂苷D及多柔比星單獨(dú)治療對Hela的殺傷活性如表1所示。由于1μmol/L桔梗皂苷D或0.1 mg/L多柔比星僅輕微殺傷Hela細(xì)胞，因此選擇這兩個(gè)濃度的桔梗皂苷D或多柔比星進(jìn)行聯(lián)合治療，探討兩者的協(xié)同效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)桔梗皂苷D聯(lián)合多柔比星可協(xié)同殺傷Hela細(xì)胞，見表2。

表1 桔梗皂苷D與多柔比星對Hela細(xì)胞的抑制作用（）

與對照組比較▲P<0.05，▲▲P<0.01；與1μmol/L桔梗皂苷

組別 n/孔 細(xì)胞活力抑制率（%）對照組 3 0±0.1 1μmol/L桔梗皂苷D組 3 4.5±0.4▲5μmol/L桔梗皂苷D組 3 21.2±1.8**10μmol/L桔梗皂苷D組 3 55.4±4.2##**0.1 mg/L多柔比星組 3 7.0±1.1▲▲0.5 mg/L多柔比星組 3 27.6±2.1□□1 mg/L多柔比星組 3 60.8±5.2△△□□

表2 桔梗皂苷D聯(lián)合多柔比星對Hela細(xì)胞的抑制作用（）

與對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與桔梗皂苷D組比較##P<0.01；與多柔比星組比較△△P<0.01

組別 n/孔 細(xì)胞活力抑制率（%）對照組 3 0±0.1桔梗皂苷D組 3 4.1±0.4*多柔比星組 3 7.2±0.6**聯(lián)合治療組 3 59.5±3.9##△△**

2.2宮頸癌細(xì)胞系PKM2的表達(dá) 三種宮頸癌細(xì)胞系Hela、SiHa和C-33a的PKM2表達(dá)水平均顯著高于人正常宮頸上皮細(xì)胞系CRL-2614，詳見表3。

表3 宮頸癌細(xì)胞系上調(diào)PKM2的表達(dá)（）

與CRL-2614細(xì)胞比較*P<0.05

細(xì)胞系 n/孔 相對表達(dá)量CRL-2614 3 1.00±0.03 Hela 3 17.5±0.6*SiHa 3 12.4±0.4*C-33a 3 13.8±0.5*

2.3桔梗皂苷D顯著下調(diào)Hela細(xì)胞PKM2的表達(dá)水平并抑制其糖代謝 選擇1μmol/L桔梗皂苷D及0.1 mg/L多柔比星進(jìn)行聯(lián)合治療，探討兩者聯(lián)合對Hela細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)。如表4所示，桔梗皂苷D能顯著下調(diào)Hela細(xì)胞PKM2的表達(dá)水平并抑制其葡萄糖的攝取和乳酸的生成，而多柔比星則對PKM2表達(dá)水平及糖代謝無影響。

表4 桔梗皂苷D及多柔比星對Hela細(xì)胞PKM2表達(dá)及糖代謝的影響（）

與對照組比較**P<0.01；與桔梗皂苷D組比較##P<0.01；與多柔比星組比較△△P<0.01

組別 n/孔 PKM2相對表達(dá)水平 葡萄糖相對攝取量 乳酸相對生成量對照組 3 1.00±0.03 1.00±0.04 1.00±0.06桔梗皂苷D組 3 0.39±0.03**0.67±0.06**0.60±0.06**多柔比星組 3 1.01±0.07 1.02±0.06 0.97±0.05聯(lián)合治療組 3 0.40±0.04##△△0.65±0.06##△△0.61±0.05##△△

2.4過表達(dá)PKM2顯著抑制桔梗皂苷D對多柔比星抗腫瘤作用的協(xié)同效應(yīng) 選擇1μmol/L桔梗皂苷D及0.1 mg/L多柔比星進(jìn)行聯(lián)合治療，如表5所示，體外轉(zhuǎn)染PKM2表達(dá)載體顯著抑制桔梗皂苷D聯(lián)合多柔比星對Hela細(xì)胞的協(xié)同殺傷效應(yīng)。

表5 PKM2表達(dá)載體顯著抑制桔梗皂苷D對多柔比星抗腫瘤作用的協(xié)同效應(yīng)（）

與對照組比較**P<0.01；與聯(lián)合治療組比較##P<0.01

組別 n/孔 細(xì)胞活力抑制率（%）對照組 3 0±0.01聯(lián)合治療組 3 60.1±4.2**聯(lián)合治療+ pcDNA3.1-PKM2組 3 22.4±2.1##

3 討論

桔梗皂苷D是桔?？傇碥盏闹饕钚猿煞郑哂锌寡?、鎮(zhèn)痛和免疫調(diào)節(jié)的作用，近期的文獻(xiàn)報(bào)道，桔梗皂苷D還具有顯著的抗肝癌和肺癌的生物活性，能誘導(dǎo)肝癌和肺癌細(xì)胞凋亡和周期阻滯[5-7]。在本研究中，作者同樣發(fā)現(xiàn)桔梗皂苷D在較高濃度時(shí)（10μmol/L）有較好的抗宮頸癌活性，Hela細(xì)胞活力抑制率為（55.4±4.2）%，而更為重要的是，桔梗皂苷D在較低濃度時(shí)（1μmol/L）能聯(lián)合多柔比星協(xié)同殺傷Hela細(xì)胞，提高化療藥物多柔比星對宮頸癌細(xì)胞的治療效果，1μmol/L桔梗皂苷D對Hela細(xì)胞的抑制率為 （4.1±0.4）%，0.1mg/L多柔比星對Hela細(xì)胞的抑制率為 （7.2±0.6）%，兩者聯(lián)合后對

Hela細(xì)胞的抑制率達(dá)到（59.5±3.9）%。

腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要特征是與正常細(xì)胞相比，它們的糖代謝異常旺盛。腫瘤細(xì)胞能攝取更多的葡萄糖，但大部分葡萄糖卻不進(jìn)入氧化磷酸化釋放能量，反而進(jìn)行有氧糖酵解合成更多的中間產(chǎn)物，最后生成乳酸，而這些中間產(chǎn)物往往是合成核酸和蛋白質(zhì)的原料[8]。丙酮酸激酶M2（PKM2）是有氧糖酵解過程中的關(guān)鍵酶，腫瘤細(xì)胞PKM2往往異常高表達(dá)以促進(jìn)有氧糖酵解的進(jìn)行[9-10]。有文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤細(xì)胞的化療藥物耐藥和腫瘤細(xì)胞的糖代謝異常有關(guān)[11-12]，因此作者進(jìn)一步研究桔梗皂苷D對多柔比星的協(xié)同效應(yīng)是否和腫瘤細(xì)胞的糖代謝有關(guān)。

首先作者通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三種宮頸癌細(xì)胞系（Hela，SiHa和C-33a）的PKM2表達(dá)水平均高于正常宮頸上皮細(xì)胞系CRL-2614 10倍以上，表明腫瘤的發(fā)生可能和PKM2的異常表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)桔梗皂苷 D能顯著降低 Hela細(xì)胞的PKM2表達(dá)水平并減弱Hela細(xì)胞對葡萄糖的攝取和乳酸的生成，表明桔梗皂苷D能顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的糖代謝和有氧糖酵解。為了證實(shí)桔梗皂苷D聯(lián)合多柔比星對宮頸癌細(xì)胞的協(xié)同殺傷效應(yīng)依賴于PKM2的下調(diào)，作者構(gòu)建了PKM2重組表達(dá)質(zhì)粒，使PKM2在Hela細(xì)胞中過表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)Hela細(xì)胞中的PKM2發(fā)生過表達(dá)后，桔梗皂苷D聯(lián)合多柔比星對 Hela細(xì)胞的抑制率從 （60.1± 4.2）%下降到（22.4±2.1）%。所有這些結(jié)果都證實(shí)了桔梗皂苷D聯(lián)合多柔比星協(xié)同殺傷宮頸癌細(xì)胞的機(jī)制是靶向于PKM2基因。

綜上所述，桔梗皂苷D具有化療藥物增效的作用，其分子機(jī)制可能為通過下調(diào)PKM2的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的糖代謝以增強(qiáng)化療藥物對宮頸癌細(xì)胞的殺傷活性。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為桔梗皂苷D與化療藥物的聯(lián)合治療方案提供了理論依據(jù)。

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