張寶良，馬玉婷，孔 偉，竇世玲，尹世東，黃萬光

(甘肅省家畜繁育中心，733000)

牛細(xì)管凍精解凍后常溫保存對受胎率的影響試驗(yàn)

張寶良，馬玉婷，孔 偉，竇世玲，尹世東，黃萬光

(甘肅省家畜繁育中心，733000)

[目的]為測試牛細(xì)管冷凍精液解凍后在常溫水中的保存時(shí)間對精子活力的影響，為非定點(diǎn)配種尋求有效簡便的凍精攜帶方法，觀察精子在不同解凍溫度下的存活時(shí)間及受胎率。[方法]選擇5個(gè)解凍溫區(qū)及不同時(shí)間解凍肉牛細(xì)管凍精，解凍后置于常溫水(17～19℃)中保存，觀測解凍溫度和精子存活時(shí)間對受胎率的影響。[結(jié)果] 50℃、60℃、70℃、解凍后精子的保存時(shí)間差異不顯著，保存至72h時(shí)精子活力均低于0.35；受胎率差異不顯著；隨保存時(shí)間延長，受胎率呈下降趨勢，在48h以內(nèi)情期受胎率和總受胎率分別維持在61.8%～67.1%和91.9～95.8。[結(jié)論]70℃各時(shí)間段解凍后保存效果最佳，60℃解凍組次之，二者在精子活力≥0.35時(shí)情期受胎率和總受胎率達(dá)到63.0%、92.5%，略高于當(dāng)?shù)攸S牛兩項(xiàng)受胎率的平均值61.1%、91.7%，解凍后細(xì)管精液置于常溫水中攜帶到較遠(yuǎn)的區(qū)域輸精對精子活力、母牛受胎率無影響。

細(xì)管凍精；解凍時(shí)間；解凍溫度；精子活力；保存時(shí)間；受胎率

人工授精技術(shù)做為當(dāng)今發(fā)展養(yǎng)牛業(yè)的重要技術(shù)措施，具有提高優(yōu)秀種公牛的利用率，大幅度減少種公牛飼養(yǎng)量，節(jié)約飼料和管理費(fèi)用，以及不受時(shí)間、地域和種公牛生命的限制等優(yōu)越性，在牛繁殖改良中發(fā)揮著極其重要的作用。很多地區(qū)各種自然條件的限制不能使人工授精技術(shù)優(yōu)勢充分發(fā)揮；一是隨著我國肉牛養(yǎng)殖業(yè)的轉(zhuǎn)型和養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)的變化，拉牛上站配種時(shí)代已基本結(jié)束，送技術(shù)上門和主動服務(wù)成為市場主流，現(xiàn)場操作受諸多條件限制，缺乏必要的交通工具，下鄉(xiāng)服務(wù)液氮容器的攜帶就很困難，再者成本也較高，對儲存的其余凍精影響也很大。二是養(yǎng)殖場規(guī)模較大的場區(qū)，配種室距授配母牛距離較遠(yuǎn)，配種母牛較多，凍精解凍后沒有好的便捷方法攜帶，外界溫度不易控制，對精子活力和受胎率影響較大。對針對這些問題，本試驗(yàn)采用不同溫度、不同解凍時(shí)間解凍牛細(xì)管凍精，通過常溫水長時(shí)間保存，對比分析解凍后精子活力及生存時(shí)間，旨在尋找最佳解凍溫度、解凍時(shí)間及常溫水中保存時(shí)間，提高細(xì)管凍精解凍后活力和受胎率，解決以上問題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物及材料

1.1.1 動物來源 試驗(yàn)動物選自甘肅省家畜繁育中心繁育場和涼州區(qū)12個(gè)配種站點(diǎn)的201頭膘情中上，發(fā)情正常，無生殖道疾病的適齡母牛。

1.1.2 試驗(yàn)器材 甘肅省家畜繁育中心種公牛站按GB4143-2008生產(chǎn)的0.25ml牛細(xì)管冷凍精液、數(shù)字解凍器、10L液氮罐、載玻片、蓋玻片、光學(xué)顯微鏡、溫度計(jì)、恒溫板、鑷子等。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 用數(shù)字精液解凍裝置在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃五個(gè)溫區(qū)解凍牛細(xì)管凍精，將不同溫區(qū)最佳時(shí)間段解凍效果好的凍精置于常溫水中保存，12 h前每隔4 h、12 h后間隔12h檢測記錄精子活力，在兩個(gè)時(shí)間段檢測出現(xiàn)活力低于0.35時(shí)，再逆時(shí)推檢直至所有解凍細(xì)管凍精活力低于0.30，最終篩選出精子活力大于0.35的最長保存時(shí)間，再進(jìn)行人工授精，測定保存后精子對的受胎率的影響。

1.2.2 解凍方法 在數(shù)字精液解凍器上設(shè)置好解凍溫度，待達(dá)到所需溫度時(shí)，用鑷子從液氮罐中迅速抽取一支細(xì)管凍精，輕輕甩掉液氮，立即將其放入準(zhǔn)備好的解凍器中并輕輕搖晃，達(dá)到設(shè)定時(shí)間后把細(xì)管取出，置于裝滿自來水500 mL小口瓶(受季節(jié)不同，水溫有浮動，平均維持在14℃左右)中室內(nèi)保存，解凍好試驗(yàn)所需數(shù)量細(xì)管凍精后，取三支細(xì)管凍精擦干，剪去兩頭封口端用取10ul精液于載玻片上加蓋玻片后，在帶有恒溫板(恒溫板溫度設(shè)置38℃)的光學(xué)顯微鏡下觀察精子活力，每個(gè)鏡片觀察3～5個(gè)以上視野，進(jìn)行活力評判并記錄。

1.2.3 配種方法 選擇解凍后常溫水中保存精子存活時(shí)間≥48 h、活力≥0.35的解凍溫區(qū)解凍后的凍精，于2 h、12 h、24 h、48 h后給發(fā)情母牛適時(shí)輸精，每次使用凍精1～2支。在21 d、45 d、60 d、90 d觀察和直腸檢查母牛受孕狀態(tài), 測定情期受胎率和總受胎率，將≥21 d未發(fā)情確定為情期受胎率，>90 d以上未發(fā)情，直腸檢查已受孕按總受胎率計(jì)算。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用Excel 和SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果用平均值來表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 解凍溫度和時(shí)間對精液活力的影響

鏡檢三個(gè)視野直線前進(jìn)精子數(shù)達(dá)0.35以上為合格，不同解凍溫度、時(shí)間下的精子活力見圖1。由圖1可知，不同解凍溫度、時(shí)間下的精子活力各異。溫度越高，所需解凍時(shí)間越短，但隨解凍時(shí)間的延長，精子死亡也越快。同一解凍溫度下解凍時(shí)間長短不同，精子活力也不相同，不同解凍溫區(qū)都有一個(gè)最佳解凍時(shí)間段。90℃細(xì)管凍精的最佳解凍時(shí)間范圍為3～4 s，解凍活力0.4～0.45；80℃最佳解凍時(shí)間為4～5 s，解凍活力0.45；70℃最佳解凍時(shí)間范圍為4～6 s，解凍后活力0.41～0.45，顯著高于其他時(shí)間段解凍后的活力；60℃最佳解凍時(shí)間范圍為7～8 s，解凍后活力0.40，高于其他時(shí)間段解凍后的活力；50℃的最佳解凍時(shí)間范圍為20～30 s，解凍后活力0.4～0.43；而80℃2 s、70℃2 s、60℃2 s和3 s、50℃2 s和3 s解凍后精子沒能復(fù)蘇；90℃5 s、807 s、70℃8 s、60℃12 s解凍后凍精精子全部死亡。

2.2 常溫水中保存對精子活力的影響

不同溫度、時(shí)間解凍細(xì)管凍精后的保存效果如表1所示。由表1可見：不同溫度、時(shí)間解凍細(xì)管凍精后，隨保存時(shí)間延長，精子活力均呈下降趨勢。其中90℃和80℃解凍組精子活力下降幅度較快，保存時(shí)間較短。在0～4 h內(nèi)精子活力差異不顯著(\%P>0.05)；\%8 h以后活力下降明顯，顯著低于前幾個(gè)小時(shí)(\%P\%<0.05)；保存至24h、36h時(shí)精子活力均低于0.35。70℃、60℃、50℃解凍組精子活力下降幅度緩慢，保存時(shí)間達(dá)72 h時(shí)，各組活力降至0.35以下，時(shí)間明顯長于90℃和80℃兩組；解凍后0～12 h內(nèi)，70℃組的平均精子活力顯著高于其他兩組(\%P\%<0.05)，60℃解凍組次之，且70℃和60℃解凍組的精子活力維持在0.37～0.44之間；12～48 h時(shí)各組精子活力基本維持穩(wěn)定，保持在0.35～0.36之間，各組差異不顯著(\%P\%>0.05)。

2.3 解凍溫度和保存時(shí)間對受胎率的影響

不同解凍溫度和保存時(shí)間對受胎率的影響見表2，由表2可以看出在50℃、60℃、70℃三個(gè)溫區(qū)解凍后的凍精對母牛受胎率影響差異不顯著(\%P\%<0.05)；隨凍精保存時(shí)間的延長，母牛情期受胎率和總受胎率均有所降低，在48小時(shí)以內(nèi)，情期受胎率和總受胎率分別維持在61.8%～67.1%和91.9%～95.8%，平均情期受胎率和總受胎率達(dá)63.0%、92.5%，略高于當(dāng)?shù)攸S牛兩項(xiàng)受胎率的平均值61.1%、91.7%。

3 結(jié)論與討論

3.1 解凍溫度和時(shí)間對精子存活時(shí)間的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，在50～90℃5個(gè)溫區(qū)范圍內(nèi)解凍牛細(xì)管凍精，每個(gè)溫區(qū)都內(nèi)都有一個(gè)解凍的最佳時(shí)間段，90℃解凍的最佳解凍時(shí)間是3 s～4 s，80℃是4～5 s，70℃是4～6 s，60℃是7～8 s，50℃是20 s～30 s。在這些溫區(qū)解凍細(xì)管凍精后于常溫水中保存的效果各有差異。其中以70℃保存效果最佳，解凍后精子活力最高，保存時(shí)間最長，60℃次之。90℃和80℃解凍后保存時(shí)間較短。說明凍精解凍后的保存效果與解凍溫度有很大的關(guān)系，在解凍精液時(shí)如何快速越過精子的冰晶期這是一個(gè)重要環(huán)節(jié)[1]。精子在冰晶化、玻璃化及復(fù)蘇時(shí)最容易發(fā)生死亡，也是解凍后精液活力快速下降的主要原因之一。高溫快速解凍可以使精子冰晶化、玻璃化及復(fù)蘇時(shí)間大大縮短，從而使精子細(xì)胞結(jié)構(gòu)得到保護(hù)，使精子損傷降到最低，減少了精子不必要的死亡，提升了解凍后精子的活力；低溫精子處于休眠狀態(tài)，活動量降低，精子能量消耗少，精子死亡率小[1-2]，將高溫解凍后的凍精放入常溫水中保存，可以有效延長精子的保存時(shí)間，500 ml水在20～25℃自然條件下24h升溫不到2℃，不會造成保存環(huán)境溫度出現(xiàn)波動起伏，很好的保持了精子生命狀態(tài)的穩(wěn)定，延長了保存時(shí)間和維持受精的能量，用此方法運(yùn)輸保存解凍后的牛細(xì)管凍精，在牛改良上門服務(wù)、偏遠(yuǎn)地區(qū)及養(yǎng)殖場配種，攜帶解凍后凍精非常經(jīng)濟(jì)方便。

3.2 解凍溫度和保存時(shí)間對受胎率的影響

母牛受胎率的高低，直接影響著品種改良速度和養(yǎng)殖者的經(jīng)濟(jì)效益，而受胎率的高低與凍精的解凍溫度，輸精時(shí)間、牛的膘情、發(fā)情時(shí)間等因素息息相關(guān)[3]。從試驗(yàn)結(jié)果也可以看出，隨著凍精保存時(shí)間的延長，母牛情期受胎率和總受胎率均呈下降趨勢，分析其原因主要是，隨著凍精保存時(shí)間的延長，精子的能量耗損逐漸升高，代謝產(chǎn)物積聚，降低和抑制了精子活動能力，導(dǎo)致受胎率下降。在細(xì)管凍精解凍過后的24 h以內(nèi)用于配種對受胎率影響不大，此法也可用于凍精解凍后，母牛處在不適宜配種階段的精液短時(shí)間保存，有效延長解凍后精液攜帶保存時(shí)間，對交通不便、技術(shù)人員較少、路途遙遠(yuǎn)的散養(yǎng)戶和場區(qū)較大、操作間距離配種點(diǎn)較遠(yuǎn)的飼養(yǎng)場，具有很大的優(yōu)勢。對加快黃牛改良步伐、適當(dāng)減少配種點(diǎn)、降低黃牛改良的投入和成本、提高肉牛細(xì)管凍精受胎率意義重大。

[1] 張永春,張顯華,劉東升,等.解凍溫度和保存時(shí)間對牛細(xì)管凍精精子活率的影響[J].中國奶牛,2013.15:60-62.

[2] 郝愛玲,阿淑艷,李淑坤.不同溫度解凍對凍后精子活力及生存時(shí)間的影響[J].中國奶牛業(yè)發(fā)展會,2006,2:683-684.

[3] 劉小明,李東.解凍精子存活時(shí)間對受胎率的影響[J].寧夏農(nóng)林科技,2000.6:35-36.

Impact on conception rate of the thawed bovine straw semen preserved in water at room temperature

ZHANG Bao-Liang , MA Yu-ting , KONG Wei , DOU Shi-ling , YIN Shi-dong, HUANG Wan-guang

(LivestockbreedingcenterinGansuProvince, 733000 )

[Objective] To test the effect of storage time in water at room temperature of cattle straw frozen semen after thawing on sperm motility, seek effective and easy semen carrying method for non- sentinel mating , observe the survival time and conception rate of thawed sperm at different temperatures . [Method] At 5 thawing temperature zones and different time thawed beef thin tube semen, after thawing preserved in the water at room temperature (17 ～ 19 ℃), observed effect of thawing temperature and sperm survival time on conception rate . [Results]At 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃ thawed, the saved time of sperm was no significant differences , when saved to 72h sperm motility were lower than 0.35 ; conception rate was not significant ; With prolonged storage time, the conception rate declined, within 48h estrus conception rate and overall conception rate remained at 61.8% ～ 67.1% and 91.9 ～ 95.8% . [Conclusion] Thawed each time of 70 ℃, preservation effect is the best , 60 ℃ followed, both in sperm motility ≥ 0.35 when estrus conception rate and overall conception rate reached 63.0% , 92.5% , slightly higher than the local cattle two of the average conception rate 61.1% 91.7% . Saved the straw semen in water at room temperature after thawing, carry to far regional inseminated, had no effect on sperm motility and pregnancy rate.

thin tube semen ; thawing time ; thawing temperature ; sperm motility ; retention time ; conception rate

2014-12-26 修改日期:2015-01-20

張寶良(1986-)，男，甘肅靖遠(yuǎn)縣人，本科，助理畜牧師，主要從事牛冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)工作。

S8-1

A

1001-9111(2015)02-0041-04