張 燕，滕 月，張 鍵，李 婧，李 旭

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，陜西 西安 710061)

慢病毒介導(dǎo)Nrp1過表達(dá)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖

張 燕，滕 月，張 鍵，李 婧，李 旭

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，陜西 西安 710061)

目的 研究神經(jīng)纖毛蛋白1 (neuropilin 1，Nrp1)在卵巢癌中的作用，探討其作為治療靶點(diǎn)的可行性。方法 克隆Nrp1基因，采用慢病毒包裝體系包裝過表達(dá)Nrp1的重組慢病毒，感染卵巢癌SKOV3細(xì)胞，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定高表達(dá)Nrp1的SKOV3細(xì)胞，通過細(xì)胞計數(shù)檢測其增殖能力的改變。結(jié)果 成功包裝了過表達(dá)Nrp1重組慢病毒，篩選得到了穩(wěn)定高表達(dá)Nrp1的SKOV3細(xì)胞，其增殖能力顯著高于對照細(xì)胞(t>t0.05(4)，P<0.05)。結(jié)論 Nrp1促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖，可能在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中起促進(jìn)作用。

卵巢癌；神經(jīng)纖毛蛋白1；慢病毒；細(xì)胞增殖

卵巢癌是女性生殖器官最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于宮頸癌和宮體癌，居于第3位[1]。由于其發(fā)病隱匿，缺乏有效的早期診斷方法，70%以上的患者初診時已屬晚期，治療及預(yù)后效果極差，致死率居各類婦科惡性腫瘤首位[2]。因此，探尋卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵分子，對于開發(fā)卵巢癌靶向治療藥物具有非常重要的意義[3]。神經(jīng)纖毛蛋白1 (neuropilin 1，Nrp1)是一種單次跨膜糖蛋白，是神經(jīng)軸突蛋白3家族(semaphorins 3，Sema3s) 和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)家族的共同受體[4]。Nrp1胞內(nèi)段無功能結(jié)構(gòu)域，不具備激酶活性，與配體結(jié)合后需再與神經(jīng)叢蛋白Plexins或血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)結(jié)合形成三體復(fù)合物，介導(dǎo)活化信號向下游傳遞[5]。Nrp1可與多個配體相互作用，發(fā)揮多種功能，涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生[6]。目前已有多個研究小組報道了Nrp1在非小細(xì)胞肺癌[7]、乳腺癌[8]、肝癌[9]、胰腺癌[10]、結(jié)腸癌[11]、前列腺癌[12]等腫瘤中的重要作用，但未見Nrp1在卵巢癌中作用的相關(guān)報道。本研究擬包裝過表達(dá)Nrp1的慢病毒，利用其感染卵巢癌細(xì)胞，建立穩(wěn)定高表達(dá)Nrp1的卵巢癌細(xì)胞系，檢測Nrp1過表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞增殖能力的改變。本研究為進(jìn)一步研究Nrp1在卵巢癌中的重要作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

卵巢癌細(xì)胞系SKOV3為本實(shí)驗(yàn)室保存；Trizol購自于美國Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑、高保真Taq酶、pMD18-T載體購自于日本TaKaRa公司；多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain peaction PCR)擴(kuò)增引物購自于上海生工生物工程公司；兔抗Nrp1抗體購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SKOV3細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2，每隔2天傳代1次。

1.2.2 組織總RNA提取

取小鼠腦組織0.1g，加Trizol 1mL，冰中勻漿后轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中。4℃下12 000rpm離心15min，轉(zhuǎn)移上清加入200μL氯仿進(jìn)行萃取，轉(zhuǎn)移上層無色水相層加500μL異丙醇，沉淀用75%乙醇洗滌，晾干后溶于30μL DEPC水中。

1.2.3 RNA反轉(zhuǎn)錄

取總RNA 1μg加入oligo(dT)152μL，70℃溫育10min。25μL反應(yīng)體系中加5×buffer 5μL、10mM dNTP 2.5μL、AMV 1μL，42℃下孵育1h。95℃ 5min終止反應(yīng)。

1.2.4 PCR分段擴(kuò)增神經(jīng)纖毛蛋白1

200μL反應(yīng)體系中加cDNA模板2μL、10mM dNTP 0.5μL、10mM上下游引物各0.5μL、10 Buffer 2μL、高保真Taq酶2U。引物序列見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物回收后溶于30μL TE中，進(jìn)行補(bǔ)“A”反應(yīng)。

1.2.5 連接T載體

補(bǔ)“A”產(chǎn)物回收后與pMD18-T載體連接，連接體系為10μL，16℃反應(yīng)過夜，次日轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑選克隆，對于Nrp1上段(U)、中段(M)、下段(D)分別進(jìn)行HindⅢ/SalI、SalI/XbaI、XbaI/EcoRI酶切，鑒定目的片段是否插入pMD18-T載體中。將陽性克隆送上海生工測序，序列正確的陽性克隆分別命名為U-pMD18-T、M-pMD18-T、D-pMD18-T。

1.2.6 亞克隆

用SspI/XbaI將M-pMD18-T中的Nrp1中段切下來，連接入同樣酶切過的U-pMD18-T，構(gòu)建成為U/M-pMD18-T。將PvuII/EcoRI將D-pMD18-T中的Nrp1下段切下來，連接入同樣酶切過的U/M-pMD18-T，構(gòu)建成為Nrp1-pMD18-T，PCR及測序鑒定。將Nrp1序列亞克隆至病毒骨架載體，酶切鑒定。

1.2.7 包裝病毒

將3×105個HEK293FT細(xì)胞種于10cm平皿中，細(xì)胞密度達(dá)到80%時，將9μg pRRLsin-Nrp1、9μg p△R與3μg VSVG質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，12h后換新鮮培養(yǎng)基。24h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用0.45μm的濾膜過濾，此即為制備好的重組慢病毒。

1.2.8 感染SKOV3細(xì)胞建立穩(wěn)定細(xì)胞系

將病毒原液加入50%～60%密度的SKOV3細(xì)胞，48h后將培養(yǎng)液更新為含5μg/mL嘌呤霉素新鮮培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，檢測感染效率。每隔2天換液一次，直至單克隆產(chǎn)生。挑取單克隆，鑒定后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.9 蛋白表達(dá)驗(yàn)證

細(xì)胞經(jīng)PBS漂洗后加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下來，冰浴30min讓細(xì)胞充分裂解，離心后取上清。BCA法定量后進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)束后將膠從電泳槽取出，與NC膜一起放在轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡10min，按順序?qū)V紙、膠、NC膜放入轉(zhuǎn)移夾子中安裝入槽，轉(zhuǎn)移3h后取出NC膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1h，用適當(dāng)比例Nrp一抗或GAPDH一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次后用適當(dāng)比例二抗室溫孵育1h，洗膜3次后化學(xué)發(fā)光。

1.2.10 測定細(xì)胞增殖能力

將對照細(xì)胞和1#克隆細(xì)胞分別種入96孔板中，每孔5×103個，設(shè)5個復(fù)孔。每隔24h消化細(xì)胞，用Countess細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，連續(xù)計數(shù)5天。

表1 Nrp1基因分段PCR擴(kuò)增引物序列

Table 1 PCR amplication primer sequences for Nrp1 gene

2 結(jié)果

2.1 PCR分段擴(kuò)增神經(jīng)纖毛蛋白1上段、中段、下段3個片段

Nrp1基因全長2 772bp，長度過長，難于一次性擴(kuò)增出來。我們采取分段PCR的策略，在Nrp1基因內(nèi)部找出限制性酶切位點(diǎn)SspI和PvuII，將Nrp1分為3段，上段(U)大小為1 055bp、中段(D)大小為712bp、下段(D)為1 007bp，分別進(jìn)行PCR。結(jié)果如圖1所示，PCR增出的條帶大小與預(yù)期的一致,見圖1。

注：1：為上段引物擴(kuò)增產(chǎn)物；2：為中段引物擴(kuò)增產(chǎn)物；3：為下段引物擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖1 PCR分段擴(kuò)增Nrp1基因

Fig.1 PCR amplication of Nrp1 gene

2.2 構(gòu)建神經(jīng)纖毛蛋白1重組骨架載體

分別將3個片段連接至T載體，并分別采用HindⅢ/SalI、SalI/XbaI、XbaI/EcoRI雙酶切進(jìn)行鑒定。與預(yù)期一致，切出了大小約為1 000、700和1 000bp的條帶，見圖2，采取1號克隆進(jìn)行測序分析，其條帶確定為U、M和D。

依次將M、D切下連接至U-pMD18-T，構(gòu)建為Nrp1-pMD18-T，PCR鑒定結(jié)果如圖3所示，利用U上游引物/D下游引物可擴(kuò)增出陽性條帶，且條帶大小在2 000bp以上。經(jīng)測序，所得序列確定為Nrp1基因序列，且3段之間無間隔或插入序列。最后將Nrp1切下連接至病毒骨架載體，HindIII/EcoRI酶切鑒定結(jié)果如圖3所示，1號克隆片段大小與預(yù)期一致，為陽性克隆。

圖2 酶切鑒定重組pMD-18T載體

Fig.2 Restriction enzyme identification of recombinant pMD-18T

注：A為HindⅢ/SalI酶切鑒定重組載體U-pMD-18T,1～5為不同克隆；B為SalI/XbaI酶切鑒定重組載體M-pMD-18T，1～5為不同克??；C為XbaI/EcoRI酶切鑒定載體D-pMD-18T，1～4為不同克隆。

2.3 穩(wěn)定過表達(dá)神經(jīng)纖毛蛋白1慢病毒的包裝

共轉(zhuǎn)染病毒包裝質(zhì)粒至293FT細(xì)胞中，24h后如圖4所示，幾乎所有細(xì)胞都表達(dá)綠色熒光蛋白，預(yù)計病毒包裝情況良好。收集含病毒的培養(yǎng)上清，感染SKOV3細(xì)胞，48h后約30%細(xì)胞為陽性，該陽性細(xì)胞為成功感染Nrp1過表達(dá)慢病毒的SKOV3細(xì)胞。嘌呤霉素壓力篩選21天后單克隆形成，擴(kuò)大培養(yǎng)2個單克隆，經(jīng)RT-PCR鑒定，該克隆的Nrp1 mRNA水平明顯高于對照細(xì)胞。Western實(shí)驗(yàn)用抗Nrp1的抗體檢測出了特異性條帶，相對分子質(zhì)量約為120kD，見圖5，以上結(jié)果證明，篩選得到的2個穩(wěn)定克隆的Nrp1的表達(dá)水平均高于對照細(xì)胞。

注：A為RT-PCR鑒定重組Nrp1-pMD-18T載體；B為HindⅢ/EcoRI酶切鑒定Nrp1重組骨架載體，1～3為不同克隆

圖3 Nrp1重組骨架載體的構(gòu)建

Fig.3 Construction of Nrp1 recombinant skeleton vector

2.4 細(xì)胞增殖能力檢測

再采用細(xì)胞計數(shù)方法檢測過表達(dá)Nrp1對卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞增殖能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩組細(xì)胞在第3天起細(xì)胞數(shù)目產(chǎn)生顯著差異(t>t0.05(4)，P<0.05)，穩(wěn)定過表達(dá)Nrp1的SKOV3細(xì)胞與對照細(xì)胞相比，細(xì)胞數(shù)目為對照細(xì)胞的2倍，且差異一直持續(xù)到第5天，表明穩(wěn)定過表達(dá)Nrp1導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力變強(qiáng)，見圖6。

注：A為共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞24h后明視野；B為共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞24h后GFP陽性細(xì)胞；C為感染SKOV3細(xì)胞48h后明視野；D為感染SKOV3細(xì)胞48h后GFP陽性細(xì)胞 。

圖4 Nrp1過表達(dá)慢病毒的包裝

Fig.4 Package of lentivirus overexpressing Nrp1

注：A為mRNA水平；B為蛋白水平。

圖5 穩(wěn)定高表達(dá)Nrp1細(xì)胞克隆的鑒定

Fig.5 Identification of stable overexpressing Nrp1 cell clones

圖6 過表達(dá)Nrp1細(xì)胞與對照細(xì)胞增殖能力比較

Fig.6 Comparison of proliferation between overexpressing Nrp1 cells and control cells

3 討論

3.1 神經(jīng)纖毛蛋白1的研究現(xiàn)狀

Nrp1是一種多功能受體。作為plexin的共受體，參與神經(jīng)細(xì)胞導(dǎo)向和軸突生長的調(diào)控[4]；作為VEGFR的共受體，參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞活化、增殖和遷移[6]；近期研究發(fā)現(xiàn)，Nrp1介導(dǎo)獨(dú)立的信號通路，參與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[5]。由于其分布特點(diǎn)和多配體結(jié)合模式，Nrp1在腫瘤中的作用機(jī)制非常復(fù)雜。Nrp1既分布于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上，也直接分布于腫瘤細(xì)胞上，在這兩個部位分別發(fā)生作用。Nrp1的兩種配體Sema家族和VEGF家族呈拮抗作用[6]，導(dǎo)致Nrp1在不同情況下發(fā)揮不同的功能。Chu等[13]發(fā)現(xiàn)Nrp1通過激活NFκB促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，與人口腔鱗癌較差的預(yù)后相關(guān)。Chaudhary等[14]發(fā)現(xiàn)Sema3F通過與乳腺癌細(xì)胞表面Nrp1結(jié)合，抑制E-鈣粘蛋白(E-cadherin)介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞與基質(zhì)的粘附，減少乳腺癌細(xì)胞播散。

3.2 慢病毒介導(dǎo)的基因過表達(dá)載體系統(tǒng)相比其他載體系統(tǒng)的優(yōu)越性

慢病毒是一種高效的轉(zhuǎn)基因病毒載體，感染靶細(xì)胞后不會感染其他細(xì)胞，也不會在宿主細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生新的病毒顆粒。與腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒等其他病毒載體相比，具備很多優(yōu)點(diǎn)：如能夠整合于宿主基因組中穩(wěn)定長時間表達(dá)；能夠感染非分裂細(xì)胞；組織嗜性廣泛；感染后不表達(dá)病毒蛋白，細(xì)胞毒性小，宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)小等。慢病毒載體以其優(yōu)越的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)能力現(xiàn)已成為研究者最為常用的基因修飾工具。

目前有多個研究都報道了Nrp1在多種腫瘤中的表達(dá)和作用，但Nrp1在卵巢中的作用尚不明確。本研究采用慢病毒包裝系統(tǒng)，包裝能夠過表達(dá)Nrp1的重組慢病毒，通過慢病毒感染，建立穩(wěn)定高表達(dá)Nrp1的SKOV3卵巢癌細(xì)胞系，比較過表達(dá)Nrp1后細(xì)胞增殖能力的差異。本研究初步證明Nrp1可以促進(jìn)SKOV3卵巢癌細(xì)胞的增殖，初步揭示了Nrp1促進(jìn)卵巢癌發(fā)生發(fā)展的作用，為進(jìn)一步明確Nrp1在卵巢癌中的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：張忠明]

Lentivirus-mediated Nrp1 overexpression promotes the proliferation of ovarian cancer cells

ZHANG Yan，TENG Yue,ZHANG Jian, LI Jing,LI Xu

(CenterforTranslationalMedicine,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China)

Objective To study the function of neuropilin 1 (Nrp1) in ovarian cancer and the possibility of Nrp1 as therapeutic target. Methods Nrp 1 gene was cloned, and Nrp 1 overexpressing recombinant lentivirus was packed. After infection of SKOV3 ovarian cancer cells, puromycin selection generated the stable cell clones overexpressing Nrp 1. Cell number counting assay was performed to detect the cell proliferation. Results Nrp 1 overexpressing recombinant lentivirus was successfully packed. The stable SKOV3 cell clones overexpressing Nrp 1 was selected, and it had more powerful proliferation ability than control cells (t>t0.05(4),P<0.05).Conclusion Nrp1 promotes the proliferation of SKOV3 cells, and may stimulate the progression of ovarian cancer.

ovarian cancer; neuropilin 1(Nrp1); lentivirus; cell proliferation

2015-06-18

張 燕(1981-)，女，助理研究員，醫(yī)學(xué)博士，主要從事卵巢癌分子機(jī)制研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.04.017

R349.82

A

1673-5293(2015)04-0706-04

李 旭，教授。

[作者簡介]滕 月(1983-)，女，助理研究員，醫(yī)學(xué)博士，主要從事卵巢癌分子機(jī)制研究(共同第一作者)。