產(chǎn)前診斷病例母體細胞鑒定污染方法的建立及臨床應(yīng)用

楊 昕，李發(fā)濤，甄 理，潘 敏，李東至，韓 瑾

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)前診斷門診，廣州 廣東 510623)

【出生缺陷預(yù)防】

產(chǎn)前診斷病例母體細胞鑒定污染方法的建立及臨床應(yīng)用

楊 昕，李發(fā)濤，甄 理，潘 敏，李東至，韓 瑾

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)前診斷門診，廣州 廣東 510623)

目的 建立單基因病介入性產(chǎn)前診斷的母體細胞污染鑒定技術(shù)，對絨毛穿刺、羊水穿刺及胎血穿刺的標(biāo)本進行母體細胞污染的鑒定，以降低誤診率。方法 選擇8個短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)位點，建立短串聯(lián)重復(fù)序列-聚合酶鏈式反應(yīng)(STR-PCR)方法，并建立母體細胞污染的濃度梯度模型，對2 120例產(chǎn)前診斷標(biāo)本進行檢測，比較羊水穿刺、絨毛穿刺及臍血穿刺母體細胞污染的發(fā)生率。結(jié)果 共施行約2 120例產(chǎn)前診斷標(biāo)本，采用STR-PCR方法檢測標(biāo)本1 452例，其中羊水穿刺標(biāo)本1 022例，臍血標(biāo)本229例，絨毛標(biāo)本201例。3種方法檢測到母體細胞污染病例共19例，其中羊水16例(1.6%)，絨毛2例(1.0%)，臍血1例(0.4%)。在19例檢測到母血細胞污染的病例中，污染比例在25%以上的病例有2例，污染比例10%以上的有18例。結(jié)論 在產(chǎn)前診斷標(biāo)本中，羊水穿刺母體細胞污染發(fā)生率較高。在單基因遺傳病產(chǎn)前診斷中，應(yīng)常規(guī)進行母體細胞污染的檢測。

產(chǎn)前診斷；標(biāo)本；母體細胞污染；短串聯(lián)重復(fù)序列-聚合酶鏈式反應(yīng)

介入性產(chǎn)前診斷目前仍是胎兒染色體檢查和單基因遺傳病診斷的主要方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的單基因遺傳病可以通過在孕早期絨毛穿刺或孕中期羊水穿刺進行產(chǎn)前診斷。盡管診斷不同單基因病的具體實驗室技術(shù)差異很大，但大部分仍然是通過基因擴增所采集的胎兒組織，然后對擴增產(chǎn)物進行分析。由于基因擴增的高度敏感性，即使微量的母體組織污染都可能干擾基因診斷結(jié)果，發(fā)生嚴重的臨床后果。因此，鑒定所取胎兒組織是否存在母體污染是產(chǎn)前診斷分子遺傳實驗室必需具備的鑒別技術(shù)。

2008年，英國臨床分子遺傳協(xié)會(CMGS)制訂了產(chǎn)前診斷標(biāo)本分子檢測母體細胞污染(maternal cells contamination，MCC)的檢測規(guī)范。在規(guī)范中明確建議所有單基因病的產(chǎn)前診斷結(jié)果必須包括母體細胞污染的鑒別實驗。且鑒別母體細胞污染的實驗技術(shù)應(yīng)最少能檢測出10%比例的母體細胞污染的產(chǎn)前診斷樣本[1]。

2010年1月至2014年1月，廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)前診斷門診產(chǎn)前診斷中心采用短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat,STR)PCR方法建立了母體細胞污染的鑒定體系。本研究的主要目的是建立母體細胞污染的檢測方法并檢測產(chǎn)前診斷標(biāo)本中母體細胞污染的發(fā)生率及絨毛、羊水、臍血穿刺病例母體細胞污染發(fā)生率的比較分析。

1 對象與方法

1.1 短串聯(lián)重復(fù)序列位點選擇

為了選擇高度多態(tài)性的STR位點，本中心對所選21個STR位點進行了400例樣本人群多態(tài)性分析，選擇雜合率較高的8個STR位點作為母體細胞污染鑒定的主要擴增位點。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗儀器

PCR儀 ABI3100遺傳分析。

1.2.2 實驗試劑

DNA extraction Kit[Qiagene]；PCR reagent(Shanghai Promega)；10×PCR Buffer；dNTPs；Mgcl2；Taq 酶；HiDi甲酰胺；Size Standard(Rox 500HD) 。

1.2.3 實驗步驟

DNA提?。涸斠?Qiagen Kit試劑說明，提取DNA濃度及OD值附在結(jié)果報告中。 DNA濃度要求大于20ng/μL，OD260/280要求介于1.5～2.0之間。

PCR：為了保證PCR體系的敏感性，將8個STR位點的擴增引物分為兩組，每組包含4個STR位點進行擴增。擴增體系如下：Master Mixture total volum：23μl；DNA ：50～100ng/μL (1～2μL)；PCR Protocol： 10× Buffer 2.5μL； dNTPs(2.5mM) 2μL Mgcl2(25mM) 2μL；Primers(2.5mM) 2μL；Taq酶(5IU/μL) 0.2μL；H2O 11μL Total volume 25μL。PCR程序：95℃5min；95℃ 10s；58℃ 30s；72℃ 45s；40cycles 4℃ forever。

變性：將0.5μL Genescan 500HD[rox] size standard 加入 8μL formamide中，充分混合，瞬時離心，將PCR產(chǎn)物2uL加入到混合液中，混合離心。95℃變性5min，迅速放入冰水混合物中冷卻3min，置入ABI 3100遺傳分析儀中電泳。

1.3 母體細胞污染梯度模型的建立

隨機選取兩組正常母親/胎兒的DNA標(biāo)本，分別測量DNA濃度及OD260/OD280值，將兩樣本(母親/胎兒)DNA按照50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%比例進行稀釋，建立母體細胞污染的人工模型，見圖1，并采用以上建立的STR-PCR體系對此模型進行檢測。

1.4 樣本來源

2013年至2015年1月，本產(chǎn)前診斷中心開始對所有因家族遺傳性單基因病(主要包括地中海貧血、血友病等)而前來我院接受產(chǎn)前診斷(包括絨毛穿刺、羊水穿刺及臍血穿刺)的標(biāo)本進行STR-PCR檢測，所有孕婦于穿刺前均知情同意并簽署知情同意書。當(dāng)STR-PCR結(jié)果提示陰性時方發(fā)放產(chǎn)前診斷報告，而當(dāng)結(jié)果提示存在母體細胞污染時，應(yīng)告知孕婦并建議重新進行二次產(chǎn)前診斷。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Genescan 3.7 軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果

2.1 短串聯(lián)重復(fù)序列選擇

2012年本產(chǎn)前診斷中心建立了以快速檢測常見染色體病為主要目的的分子生物學(xué)方法。此方法采用21個STR位點對21、18、13及性染色體進行檢測，檢測準確率達到97.5%以上[2]。本研究在以上成果的基礎(chǔ)上挑選了8個雜合率較高的STR位點作為母體細胞污染鑒定的基本位點。8個等位基因片段大小、雜合度、多態(tài)信息量、個體識別力和非父排除率，見表1。

表1 廣東漢族人群8個STR等位基因片段大小、雜合度、多態(tài)信息量、個體識別力和非父排除率分析

2.2 母體細胞污染模型的建立

本檢測體系對2組模型分別進行檢測，發(fā)現(xiàn)在6個不同稀釋比例的標(biāo)本中，2組模型中6.25%以上稀釋比例的標(biāo)本均能夠檢測，見圖1。而3.125%的稀釋比例中，僅有1組標(biāo)本能夠清楚顯示。因此在標(biāo)本檢測結(jié)果中，如發(fā)現(xiàn)MCC陽性，則代表MCC的比例不低于10%。

注：對樣本DNA質(zhì)量要求：DNA濃度：20～100ng/mL，OD260/OD280：1.6。

圖1 母體細胞污染不同濃度梯度參照標(biāo)準

Fig.1 Reference standard for different concentration gradient of MCC

2.3 產(chǎn)前診斷樣本的檢測

2012年10月至2014年6月，本中心共施行約2 120例產(chǎn)前診斷標(biāo)本，采用STR-PCR方法檢測標(biāo)本1 452例，其中羊水穿刺標(biāo)本1 022例，臍血標(biāo)本229例，絨毛標(biāo)本201例。3種方法檢測到MCC病例共19例，其中羊水16例(1.6%)，絨毛2例(1.0%)，臍血1例(0.4%)。在19例檢測到母血細胞污染的病例中，污染比例在25%以上的病例2例，10%以上的18例。

3 討論

眾所周知，目前產(chǎn)前診斷的主要途徑為超聲引導(dǎo)下經(jīng)母體腹部行絨毛(或羊水、臍血)穿刺術(shù)，因此在取材的標(biāo)本中，不可避免的會存在母體組織成份的污染。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的單基因遺傳病可以通過在早、中孕期進行診斷，由于基因擴增的高度敏感性，即使微量的母體組織污染都可能干擾基因診斷結(jié)果，發(fā)生嚴重的臨床后果[3]，因此，鑒定所取胎兒組織是否存在母體污染是分子遺傳實驗室必需具備的技術(shù)。2005年，Stojilkovic-Mikic等[4]采用QF-PCR技術(shù)對254例羊水標(biāo)本進行檢測，發(fā)現(xiàn)39.8%的標(biāo)本存在母體細胞的污染，母體細胞污染的比例由5%至100%不等，由此可見，在進行有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷手術(shù)中，母體細胞污染的比例是相當(dāng)高的。在美國一項多中心的調(diào)查報告中，35個產(chǎn)前診斷中心有34個對所有的產(chǎn)前診斷樣本進行MCC的檢測[5]。2008年，英國臨床分子遺傳協(xié)會制定了關(guān)于產(chǎn)前診斷中MCC檢測方法建立的規(guī)范，要求所有單基因病的產(chǎn)前診斷都應(yīng)該進行MCC鑒定，且分子產(chǎn)前診斷報告應(yīng)在MCC檢測報告完成后交給病人[1]。

在我國，由于產(chǎn)前診斷技術(shù)開展的時間較晚，關(guān)于產(chǎn)前診斷標(biāo)本母體細胞污染的檢測仍未受到足夠的重視。2010年，本中心開始將QF-PCR技術(shù)應(yīng)用于臨床[4]，為孕婦提供21、18及13三體綜合征的快速分子診斷。針對母體細胞污染檢測本身要求較高雜合率的特點，重新選擇并優(yōu)化了STR位點，采用8位點單管PCR擴增的方法，既保證了檢測結(jié)果的特異性，同時還保證了檢測結(jié)果的敏感性。2012年10月至2014年6月，采用該方法共檢測產(chǎn)前診斷標(biāo)本2 120例，共發(fā)現(xiàn)19例產(chǎn)前診斷標(biāo)本存在不同程度的母體細胞污染，其中羊水標(biāo)本中出現(xiàn)MCC的幾率最高，這與侯巧芳等[6]的研究結(jié)果相一致，但是該研究未經(jīng)培養(yǎng)的羊水和絨毛MCC發(fā)生率分別達到3.1%和5%。而在本研究中，所有的羊水標(biāo)本均為培養(yǎng)后標(biāo)本，MCC檢出率僅為1.6%。在2例絨毛MCC的病例中，其中1例實際上完全為母體組織，后通過二次穿刺(羊水穿刺)得到確診。通過該病例顯示出，在絨毛穿刺中，經(jīng)驗豐富的手術(shù)醫(yī)生及抓取典型的絨毛組織是保證診斷結(jié)果的重要前提。同時在進行母體細胞污染鑒定時，應(yīng)同時對母體DNA進行檢測并作為對照。

雖然本研究初步建立了產(chǎn)前診斷標(biāo)本中母體細胞污染的鑒定體系，但由于僅僅為相對定性的診斷，因此當(dāng)我們發(fā)現(xiàn)樣本存在母體細胞污染時，只能根據(jù)已有的模型做出粗略的定性，不能對母體細胞污染的程度進行精細的定量。另外一點需要注意的是，本研究所建立的MCC 鑒定體系是以檢測敏感性為10%以上的污染比例為基礎(chǔ)的，當(dāng)母體細胞污染的比例小于10%時，本方法可能無法檢測，因此我們在對產(chǎn)前診斷標(biāo)本進行單基因病的檢測時，也需要清楚母體細胞污染在什么情況下可以顯著影響基因診斷的結(jié)果，并對孕婦及家屬進行充分的告知。

[1]Allen S, Mountford R, Butler A,etal.Practice guidelines for the Testing for maternal cell contamination (MCC) in prenatal samples for molecular studies[Z].Guidelines ratified by the UK Clinical Molecular Genetics Society,2008.

[2]梁麗,廖燦,潘敏,等.熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)快速產(chǎn)前診斷常見染色體非整倍體的臨床應(yīng)用[J].中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志,2012,15(2):106-112.

[3]Winsor E J, Akoury H, Chitayat D,etal. The role of molecular microsatellite identity testing to detect sampling errors in prenatal diagnosi[J]. Prenat Diagn, 2010,30(8): 746-752.

[4]Stojilkovic-Mikic T, Mann K, Docherty Z,etal. Maternal cell contamination of prenatal samples assessed by QF-PCR genotyping[J]. Prenat Diagn, 2005, 25(1): 79-83.

[5]Schrijver I, Cherny S C, Zehnder J L.Testing for maternal cell contamination in prenatal samples: a comprehensive survey of current diagnostic practices in 35 molecular diagnostic laboratories[J]. J Mol Diagn,2007,9(3):394-400.

[6]侯巧芳,廖世秀,李濤,等. 產(chǎn)前診斷標(biāo)本的母體細胞污染及其影響[J]. 中華婦產(chǎn)科雜志2013,48(2):86-91.

[專業(yè)責(zé)任編輯：于學(xué)文]

Establishing methods to detect maternal cells contamination in cases for prenatal diagnosis and clinical application

YAND Xin, LI Fa-tao, ZHEN Li, PAN Min, LI Dong-zhi, HAN Jin

(PrenatalDiagnosisCenter,GuangzhouWomenandChildrenHospital,GuangzhouGuangdong510623,China)

Objective To test maternal cells contamination (MCC) in samples of choriomic villus puncture, amniotic fluid puncture and cord blood puncture by establishing the test technique of MCC in interventional prenatal diagnosis of monogenic disease so as to reduce misdiagnosis rate. Methods Eight STR sites were selected to establish STR-PCR method and MCC concentration gradients. Totally 2 120 prenatal samples were detected to compare the incidence of MCC among choriomic villus puncture, amniotic fluid puncture and cord blood puncture samples. Results Totally 2 120 prenatal diagnosis samples were performed, and 1 452 samples were tested by STR-PCR method, including 1 022 amniotic fluid puncture samples, 229 cord blood samples and 201 choriomic villus samples. There were 19 cases with MCC detected by three methods, including 16 (1.6%) cases with amniotic fluid puncture, 2 (1.0%) cases with choriomic villus puncture and 1 (0.4%) case with cord blood puncture. Of 19 cases there were 2 cases with contamination over 25% and 18 cases with contamination over 10%. Conclusion In prenatal diagnosis samples, the incidence of MCC is relatively high in amniotic fluid puncture samples. MCC detection should be performed as a routine test in prenatal diagnosis of monogenic disease.

prenatal diagnosis; sample; maternal cells contamination (MCC); short tandem repeat (STR)-PCR

2015-06-02

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目(項目編號：2013A011040013)

楊 昕(1977-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事胎兒醫(yī)學(xué)的研究。

韓 瑾，副主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.04.055

R714.55

A

1673-5293(2015)04-0815-03