卓秀萍，朱 玲，徐志文

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心，四川 成都 611130)

豬干擾素的研究進展

卓秀萍，朱 玲*，徐志文

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心，四川 成都 611130)

近年來，豬病的流行嚴(yán)重地制約著我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，并造成巨大的經(jīng)濟損失；病毒感染、寄生蟲感染等是造成豬只發(fā)病的主要原因。雖然已有各種疫苗得到廣泛應(yīng)用，但仍不能有效控制疾病的流行，研發(fā)高效、安全的豬病防治制劑成為迫切的需要。干擾素(Interferon， IFN)通過激活細(xì)胞中多種功能基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)各信號傳導(dǎo)通路的協(xié)同作用，能夠發(fā)揮抗病毒、抗細(xì)菌、抗寄生蟲、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能；此外IFN還具有廣譜性和種族特異性，對健康的細(xì)胞無毒，使用安全[1]。通過研究發(fā)現(xiàn)，豬干擾素(Porcine Interferon， PoIFN) 對體外抑制多種病毒、寄生蟲的增殖已初見成效，對治療細(xì)菌、病毒的混合感染也比較有效，因此研究PoIFN對豬病的防治具有積極的現(xiàn)實意義。目前市場上使用最多的PoIFN是豬白細(xì)胞干擾素，其于1997年獲得我國農(nóng)業(yè)部“新獸藥證書”、“生產(chǎn)批準(zhǔn)文號”，于1999年獲得國家“發(fā)明專利證書”[2]。此外，實驗室正在嘗試構(gòu)建動物PoIFN基因重組疫苗，其對提高產(chǎn)量、增強免疫效力、降低病毒載體毒性等方面都有重要的意義。

1 分類與來源

IFN是受體細(xì)胞分泌的一種廣譜抗病毒糖蛋白，正常情況下IFN基因處于被抑制狀態(tài)，在有誘導(dǎo)劑的條件下解除抑制而獲得表達。誘導(dǎo)劑包括病毒或者核酸、細(xì)菌內(nèi)毒素、促細(xì)胞分裂素等，此外現(xiàn)代中藥研究證實知母、板藍根等也可誘導(dǎo)IFN生成。由于與人IFN相似，根據(jù)序列同源性以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體復(fù)合物的不同，PoIFN可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，Ⅰ型包括PoIFN-α、β、δ、ω、τ、κ；Ⅱ型只有PoIFN-γ；Ⅲ型為PoIFN-λ，也可細(xì)分為PoIFN-λ1、λ2、λ3；其中Ⅰ型PoIFN對酸的耐受性最大，抗病毒作用最強。目前為止研究比較多的主要為PoIFN-α、β、ω和PoIFN-γ。

2 生物活性

2.1 廣譜抗病毒作用

與人的IFN相同，PoIFN主要通過間接地抑制病毒的增殖來發(fā)揮抗病毒作用。病毒的感染導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生PoIFN；PoIFN又隨被感染細(xì)胞的死亡和崩解而釋出，并隨血液循環(huán)到達全身。之后PoIFN與豬體內(nèi)細(xì)胞膜上敏感受體結(jié)合，誘導(dǎo)該細(xì)胞轉(zhuǎn)錄出五種抗病毒蛋白（Antiviral Protein，AVP），分別為雙鏈RNA依賴性蛋白激酶（PKR，常稱為P1/eIF-2A）、2'，5'腺苷酸合成酶（2'，5'-Oligoadenylate synthetase，OAS）、腺苷脫氨酶I（Adenosine deaminase 1，ADAR1）、GTP結(jié)合蛋白（Mx蛋白）、氮氧化物合成酶（Nitric oxide synthease，NOS），并分別發(fā)揮抗病毒作用。當(dāng)豬遭受病毒攻擊后，如果病毒還未在細(xì)胞內(nèi)大量生長繁殖，可立即使用PoIFN，以保護正常細(xì)胞；但如果機體大部分細(xì)胞都遭受病毒攻擊并遭到嚴(yán)重破壞時，即使注射PoIFN也不能產(chǎn)生足夠的AVP以保護細(xì)胞；因此在臨床應(yīng)用上應(yīng)盡早用藥[3]。

2.2 抗寄生蟲作用

PoIFN主要通過加強細(xì)胞毒效應(yīng)和降低細(xì)胞的活性來發(fā)揮它的抗寄生蟲活性作用。CD8+T細(xì)胞能夠識別利什曼原蟲、弓形蟲等特異性組織相容性復(fù)合物Ⅰ(MHCⅠ)類抗原，并產(chǎn)生PoIFN；研究結(jié)果表明PoIFN通過激活MΦ來誘導(dǎo)氧自由基攻擊脂質(zhì)膜與NO抑制靶細(xì)胞的DNA合成和線粒體的呼吸作用，從而破壞寄生蟲體并導(dǎo)致病原體活力下降，寄生蟲死亡[4]。同時PoIFN還能夠誘導(dǎo)靶細(xì)胞內(nèi)池的色氨酸降解，從而抑制寄生蟲繁殖。相比于所有PoIFN，PoIFN-γ抗寄生蟲活性最強。

2.3 抗細(xì)菌作用

PoIFN主要是抗胞內(nèi)菌，其主要通過誘導(dǎo)靶細(xì)胞轉(zhuǎn)錄出來的GBP1蛋白，這是一種GTP結(jié)合蛋白。胞內(nèi)菌通過吞噬體進入細(xì)胞，其后續(xù)通過特定途徑進入細(xì)胞質(zhì)進行復(fù)制。研究發(fā)現(xiàn)GBP1發(fā)揮抗胞內(nèi)菌的機制是增強氧化殺傷能力及促進運送抗菌肽至自噬體而發(fā)揮殺菌效應(yīng)；此外還通過下調(diào)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，減少細(xì)菌供鐵或誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)源性NO直接抑制細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌等，而且該機制使得GBP1具有廣譜抗胞內(nèi)菌的能力。

2.4 免疫調(diào)節(jié)作用

PoIFN可增加IgG的Fc受體表達，從而有利于巨噬細(xì)胞對抗原的吞噬，K細(xì)胞、NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷以及T、B淋巴細(xì)胞的激活，增強機體免疫應(yīng)答能力；但劑量過大會起抑制作用。I型的免疫調(diào)節(jié)作用比II型強，兩類PoIFN的協(xié)同調(diào)節(jié)作用使機體處于最佳免疫應(yīng)答狀態(tài)[5]。

2.5 其他生物學(xué)作用

PoIFN除了以上主要功能外，還有其他一些功能：如對妊娠的識別及維持作用、抗腫瘤作用、抗增殖活性等。PoIFN-τ作為一種早期懷孕信號，在胚泡附植前后產(chǎn)生，可能通過抑制子宮內(nèi)膜對催產(chǎn)素的敏感性、降低前列腺素的活性、阻止黃體溶解，以達到維持妊娠的作用識別階段[6]；此外，妊娠識別過程中也產(chǎn)生一種特征性的分泌蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)類似PoIFN-τ，但其具體作用機制有待進一步研究。PoIFN抗腫瘤主要表現(xiàn)在抑制腫瘤的增殖、抑制腫瘤細(xì)胞增生、改變瘤細(xì)胞表面的性能以易于被免疫監(jiān)視細(xì)胞識別和排斥、通過免疫調(diào)節(jié)來增強機體抗腫瘤能力等。PoIFN-α還能針對細(xì)胞周期控制體中的特異因子發(fā)生作用，包括通過作用于c-myc、Prb、D3和cdc25A蛋白來抑制細(xì)胞的增殖。

3 對豬病的防治

3.1 抗病毒

IFN由于抗病毒具有廣譜性和安全性，被譽為最有希望治療病毒病的“青霉素”。造成豬只發(fā)病的病毒性病原主要有口蹄疫病毒(FMDV)、藍耳病病毒（PRRSV）、豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環(huán)病毒 (PCV2)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬傳染病胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、輪狀病毒(RV)等。研究表明，PoIFN對以上病毒均有良好的抑制效果，因而越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的青睞。早期的研究主要使用豬白細(xì)胞PoIFN防治豬病[7]；隨著研究的深入，重組干擾素得到了廣泛地研究，通過畢赤酵母、巴斯德畢赤酵母、腺病毒、桿狀病毒、家蠶桿狀病毒等載體，成功表達并得到純化出rPoIFN-α、rPoIFN--β、rPoIFN-γ、rPoIFN-ω[8-11]，為體內(nèi)和體外抗病毒的研究提供了重要的材料。

3.2 抗寄生蟲

馬良等(1995)[6]在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC）的培養(yǎng)中加入過量的色氨酸能完全抑制IFN-γ、IFN-α介導(dǎo)的抗弓形蟲病作用。潘曉梅等（2008）[12]利用重組PoIFN-γ進行體外抗弓形蟲感染，發(fā)現(xiàn)隨著IFN-γ劑量的增大，巨噬細(xì)胞的抗弓形蟲作用逐漸增強；為利用PoIFN-γ預(yù)防弓形蟲提供了良好的方向。

3.3 治療多種病原體混合感染

張真等用PoIFN與阿莫西林、黃氏多糖聯(lián)合用藥，治療已感染豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、PCV2的病豬，阻止了病情的蔓延，療效顯著。張泉軍等(2005)通過實驗和臨床擴大試驗發(fā)現(xiàn)豬白細(xì)胞IFN對哺乳仔豬和斷奶仔豬某些病毒性腹瀉、細(xì)菌性腹瀉、病毒和細(xì)菌混合感染引發(fā)的腹瀉，均有良好的預(yù)防和治療作用。龍慶軍等（2008）采用PoIFN-α治療混合感染了PRRSV、附紅細(xì)胞體病、鏈球菌的豬，結(jié)果顯示病豬的病情明顯好轉(zhuǎn)。

3.4 免疫佐劑作用

20世紀(jì)80年代初細(xì)胞因子開始作為佐劑得到運用，IFN具有較強的佐劑活性，并且對降低副反應(yīng)也有一定的功效。研究發(fā)現(xiàn)以重組PoIFN-γ為疫苗佐劑，不僅能特異性地增強疫苗的免疫效果，而且可增強機體抗感染的能力。竇永喜等（2004）研究發(fā)現(xiàn)PoIFN-γ對豬囊蟲全蟲疫苗有良好的免疫佐劑作用，優(yōu)于傳統(tǒng)使用的鋁鹽和206佐劑。馬鳳龍等（2005）實驗證明了不同劑量的重組PoIFN-γ分別與豬瘟兔化弱毒苗、豬藍耳病弱毒苗和偽狂犬弱毒疫苗聯(lián)合應(yīng)用，可提高血清抗體水平，增強疫苗的免疫效果。章紅兵（2013）研究發(fā)現(xiàn)在PCV2免疫時聯(lián)合PoIFN可以發(fā)揮協(xié)同作用，增強免疫效果，但與PoIFN的劑量有一定關(guān)系。

3.5作為飼料添加劑

IFN膠囊及納米可以通過藥物釋控技術(shù)與特殊載體結(jié)合，作為保健型飼料的藥物添加劑。岑路（2010）等通過PoIFN-α在促進生長作用和預(yù)防病毒性疾病方面的臨床試驗表明，PoIFN-α對仔豬的生長有良好的促進作用，具有顯著的緊急預(yù)防病毒性疾病的效果。

4 基因工程

正常情況下動物體內(nèi)IFN表達量很少、難以提取和純化，因此在臨床生產(chǎn)中首先考慮高效的基因工程技術(shù)。通過基因工程生產(chǎn)的PoIFN最開始在大腸桿菌上表達，隨著提取工藝的不斷完善，目前PoIFN蛋白提取率可達95%～97%；另3%～5%是大腸桿菌雜蛋白，副作用較大，易引起使用對象發(fā)熱、發(fā)燒、過敏等不良反應(yīng)。為了表達出高效、廉價、副作用小的重組PoIFN，科研工作者們還嘗試了在酵母菌、桿狀病毒、腺病毒等中表達PoIFN，并獲得了成功。從畢赤酵母中表達和純化PoIFN-α效價高、毒素含量低，更類似于天然結(jié)構(gòu)的特點。在腺病毒上表達和純化PoIFN，表達產(chǎn)物具有正確的活性，而且副產(chǎn)物少，易于純化和減少副作用；同時由于缺陷型腺病毒的強力穿透、直達已感染的細(xì)胞內(nèi)，使藥效更長久，增強PoIFN的使用效果。重組PoIFN最理想的劑型為IFN的聚乙二醇化(Pegylated，PEG)和IFN與載體脂質(zhì)體(Liposome-IFN)的結(jié)合，這兩種是劑型能很好的延長IFN在體內(nèi)的半衰期、增加其穩(wěn)定性、降低免疫源性。PoIFN基因工程的發(fā)展不但為PoIFN的大量生產(chǎn)提供了新的方向，而且大大豐富了對PoIFN遺傳結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成的認(rèn)識，并可以闡明PoIFN的組成和功能的關(guān)系，有利于探索特殊功能的PoIFN。PoIFN基因工程的進一步研究對構(gòu)建動物IFN基因重組疫苗，提高其免疫效力，降低病毒載體毒性等方面有著重要的意義。

5 存在問題

研究認(rèn)為在獸醫(yī)臨床上PoIFN對畜禽機體副反應(yīng)一般比較輕，但隨著濃度的增加和療程的延長，肌注可能引起發(fā)熱、紅斑及疼痛。由于PoIFN在治療畜禽疾病主要還處試驗階段，具體的毒副作用并未完全顯現(xiàn)出來。目前影響PoIFN臨床運用的除了毒副作用外，還主要存在以下問題：第一，目前不同PoIFN的組織親和性和生物學(xué)作用亦有待深入研究和了解。第二，PoIFN的提純和測定方法尚不夠穩(wěn)定和簡化。第三，使用PoIFN治療同一疾病的療效并不一致，所以一般需用較大劑量，且療效呈劑量依賴性，但隨著劑量的增加毒副作用也增加。第四，重組PoIFN在治療過程中有時會產(chǎn)生抗體，如果發(fā)現(xiàn)抗體產(chǎn)生，應(yīng)改用其他亞型的PoIFN。第五，在豬的治療主要局限在試驗階段，其與不同藥物最佳配伍等問題需探索。

6 展望

隨著新病原株、變異株的不斷出現(xiàn)，目前許多藥物對某些豬病已經(jīng)難以顯示出滿意的防治效果。大量研究證明PoIFN對威脅重大的多種豬病均具有良好的防治作用，給豬病防治提供了新的手段，有望創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。傳統(tǒng)生產(chǎn)PoIFN有成本高、產(chǎn)品質(zhì)量難控制及臨床療效不穩(wěn)定等問題；建立規(guī)模化生產(chǎn)體系、利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組PoIFN是一條十分有效途徑，但對于其中一些關(guān)鍵技術(shù)問題如PoIFN的表達水平、高密度發(fā)酵工藝、生物學(xué)活性以及臨床應(yīng)用方法等諸多環(huán)節(jié)仍需進行深入研究。大量試驗證實PoIFN與牛、羊等動物之間存在交叉活性，PoIFN不僅對豬病療效良好，對牛病毒性腹瀉、小鵝瘟、羔羊腹瀉等都具有不錯的療效，研究PoIFN對防治牛羊等動物的疾病也具有積極的意義。此外，將生產(chǎn)的PoIFN作為增強劑，與不同的疫苗聯(lián)合應(yīng)用或與保護性抗原基因融合表達，可以增強疫苗的免疫效果，將對豬病防治產(chǎn)生積極的影響。另外，中藥誘生IFN也已成為廣大學(xué)者關(guān)注的熱點之一。PoIFN的臨床治療效果已經(jīng)得到各界專家的肯定，基于其廣闊的發(fā)展前景，PoIFN值得我們進一步關(guān)注和研究。

[1] 銀曉，關(guān)平原.干擾素的研究進展[J].畜牧與飼料科學(xué)，2008，29(2)：65-68.

[2] 林毅，奉孝書.豬干擾素生產(chǎn)及應(yīng)用研究進展[J].今日畜牧獸醫(yī)，2010（5）：69-70.

[3] 馮盼盼，盧雪梅，金小寶，等.干擾素的藥理研究進展[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2014，30(6)：780-783.

[4] 馬良，駱云鵬.干擾素與寄生蟲感染[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1995，20(3)：241-244.

[5] 馬飛，干擾素的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī).2005.32(12)：36-38.

[6] 宋聰穎.孕酮、干擾素τ對牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞GnRH信號傳遞依賴通路基因表達的影響[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[7] 劉萬鈞，胡景韶，張道永，等.用豬白細(xì)胞干擾素防治豬流行性腹瀉[J].中國獸醫(yī)科技，1996，26(2)：27-28.

[8] 萬建青，吳文學(xué)，夏春.畢赤酵母表達豬干擾素-γ基因及其抑制藍耳病病毒效果[J].生物工程學(xué)報，2002，18(6)：683-686.

[9] Overend C，Mitehell R，H e D.Recombinant swine beta interferon Protects swine alveolar macrophages and MARC-145 cells from infection with poreine reproduetive and respiratory syndrome virus. JGenVirology，2007，88(3)：25-31.

[10] Miller LC，Laegreid WW，Bono JL.Interferon type I response in Poreine reproductive and respiratory syndrome virus-infected MARC-145 cells.Arehives of virolo gy，2004，149(12)：2453-2463.

[11] 王彥彬，孫向麗，魏戰(zhàn)勇，等.豬干擾素α和γ在桿狀病毒中共表達及對PRRSV抑制作用[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44(9)：1931-1938.

[12] 潘曉梅，竇永喜，岳城，等.重組豬干擾素r的體外抗弓形蟲作用[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2008，38(8)：676-679.

2015-07-22）

四川省2014年科技支撐計劃（2014NZ0043）

卓秀萍（1990-），女，四川成都人，碩士生，研究傳染病方向

朱玲（1972-），女，四川會東人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究動物傳染病病原分子生物學(xué)方向