刃天青還原法檢測細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴總數(shù)

若山古麗·肉孜，高惠靜，劉 輝，肖云峰，楊 寧，趙 軍，王建華，林仁勇，溫 浩，呂國棟

刃天青還原法檢測細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴總數(shù)

若山古麗·肉孜1,2，高惠靜1，劉 輝1，肖云峰1，楊 寧1，趙 軍1，王建華1，林仁勇1，溫 浩1，呂國棟1

目的 建立刃天青還原法體外檢測細(xì)粒棘球絳蟲存活原頭蚴總數(shù)的實(shí)驗(yàn)方法。方法 根據(jù)刃天青在活細(xì)胞線粒體酶作用下被還原成強(qiáng)熒光物質(zhì)的原理，將體外培養(yǎng)的原頭蚴，用2 mg/mL刃天青染色10 h后，用熒光分光光度計(jì)(激發(fā)光波長在560 nm，發(fā)射長590 nm)測定熒光值，并利用激光掃描共聚焦顯微鏡形態(tài)觀察，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法建立活原頭蚴總數(shù)與對應(yīng)的熒光值之間的數(shù)學(xué)模型，用于存活原頭蚴總數(shù)的檢測。結(jié)果 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，死亡的原頭蚴經(jīng)刃天青染色沒有熒光，活的原頭蚴經(jīng)刃天青染色發(fā)出紅色熒光?；钤^蚴總數(shù)與對應(yīng)的熒光值呈線性關(guān)系，建立直線方程y=0.019x+6.453，在檢驗(yàn)中將測得的熒光值(y)帶入該公式即可獲得活原頭蚴總數(shù)，此數(shù)學(xué)模型相關(guān)系數(shù)r=0.994，P<0.01，說明每個濃度下活原頭蚴總數(shù)與每個濃度對應(yīng)的熒光值之間的相關(guān)系數(shù)r極顯著。結(jié)論 本研究建立了刃天青還原法體外快速檢測細(xì)粒棘球絳蟲存活原頭蚴總數(shù)的實(shí)驗(yàn)方法，該方法可應(yīng)用于抗包蟲病藥物體外篩選，具有避免人為誤差、降低人力消耗等優(yōu)點(diǎn)。

刃天青；細(xì)粒棘球絳蟲；原頭蚴；總數(shù)檢測

囊型包蟲病(Cystic echinococcosis)，是由細(xì)粒棘球絳蟲的幼蟲寄生于人、羊等中間宿主體內(nèi)，引起的一種人獸共患病[1]。我國是囊型包蟲病高發(fā)國家之一[2]，該病對我國健康衛(wèi)生事業(yè)和畜牧業(yè)均有較大的危害，尤其是西部一些省區(qū)是該病的流行區(qū)，年經(jīng)濟(jì)損失達(dá)30億元左右。由于畜牧產(chǎn)品的流通和城市地區(qū)犬類等寵物飼養(yǎng)的增多，囊型包蟲病呈現(xiàn)由牧業(yè)區(qū)向農(nóng)業(yè)區(qū)和城區(qū)擴(kuò)散，由西部和北部向東部和南部蔓延的趨勢[3]。

目前，常規(guī)抗包蟲病藥物為苯丙咪唑類藥物，包括：甲苯咪唑、阿苯達(dá)唑[4-5]和奧芬達(dá)唑[6]等。苯丙咪唑類藥物存在腸道吸收差，血藥、肝藥濃度較低，療效不穩(wěn)定，個體差異大等缺點(diǎn)，加大劑量又易造成藥物的毒性反應(yīng)[7]，亟需研發(fā)新型抗包蟲病藥物。抗包蟲病藥物研發(fā)的第一步為體外藥效學(xué)研究，通常采用伊紅、臺盼藍(lán)等染色劑通過染色后的顏色反應(yīng)來判斷細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴的存活情況。但這些方法均需靠肉眼判斷和人工計(jì)數(shù)，存在一定的人為誤差，可靠性低、操作繁瑣、耗時長，不利于大規(guī)模的抗包蟲藥物篩選，因此，抗包蟲體外藥物篩選亟需建立一種快速、簡便、準(zhǔn)確、可靠的檢測活原頭蚴總數(shù)的方法。

刃天青是一種氧化還原指示劑，本身為暗藍(lán)色的非熒光物質(zhì)，在活細(xì)胞線粒體酶作用下被還原成粉紅色強(qiáng)熒光物質(zhì)。刃天青還原法已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、綿羊精子、植物種子、肝細(xì)胞等的活性檢測或計(jì)數(shù)工作；劉娜等[8]刃天青還原法快速檢測鮮牛奶中總菌數(shù)，Driessche[9]等用刃天青染色定量微生物生物膜活性，Martin[10]等采用刃天青測定綿羊精液中活精子數(shù)量，Tai[11]等用刃天青檢測十字花科植物種子的活性，Daniel[12]等用刃天青還原法測定細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的活性，Valtink[13]等用刃天青檢測細(xì)胞數(shù)量和活性來評價角膜存儲介質(zhì)及其部件的質(zhì)量。而該方法尚未應(yīng)用于寄生蟲的活性檢測或計(jì)數(shù)。本文首次根據(jù)刃天青在活細(xì)胞線粒體酶作用下被還原成為粉紅色強(qiáng)熒光物質(zhì)的特點(diǎn)，建立了刃天青檢測細(xì)粒棘球絳蟲活原頭蚴總數(shù)的方法。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 從新疆烏魯木齊市屠宰場新鮮采集自然感染細(xì)粒棘球蚴的綿羊肝臟。在無菌條件下，采集原頭蚴，并用含有青鏈霉素的無菌PBS液(pH7.3)洗3次，加入1%pepsin(pH 2.0)，37 ℃消化30 min，期間每隔5 min，輕搖、翻轉(zhuǎn)試管，使原頭蚴從育囊中散出，隨后用無菌PBS液漂洗3次，倒置顯微鏡下檢查其活性，伊紅染色計(jì)數(shù)若活力大于95 %則用含有l(wèi)0%胎牛血清和1%雙抗的1 640培養(yǎng)基無菌培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，實(shí)驗(yàn)備用。

1.2 主要試劑 1640培養(yǎng)基(C11875500BT)、胎牛血清(16010159)和青鏈霉素均購自于美國Gibco公司；刃天青(R7017-5G)購自于美國Sigma公司。

1.3 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測 將刃天青染色20 h的原頭蚴經(jīng)PBS清洗3次后，在激光掃描共聚焦顯微鏡下，放大200倍、激發(fā)波長561 nm發(fā)射波長580～710 nm、紅光下觀測及拍照。

1.4 檢測波長的優(yōu)化 原頭蚴總數(shù)分別取0、50、100、200、400、800頭，加刃天青濃度為0.2 mg/mL孵育10 h。為了確定最佳的檢測波長，選擇發(fā)射波長520～570 nm，激發(fā)波長590 nm、600 nm下進(jìn)行檢測。

1.5 刃天青濃度的優(yōu)化 原頭蚴總數(shù)分別取0、50、100、200、400、800頭，激發(fā)波長560 nm發(fā)射波長590 nm，刃天青孵育10 h，為了確定最佳的刃天青濃度，選擇刃天青濃度分別為0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL進(jìn)行檢測。

1.6 檢測時間的優(yōu)化 原頭蚴總數(shù)分別取0、50、100、200、400、800頭，激發(fā)波長560 nm發(fā)射波長590 nm，加刃天青濃度為0.2 mg/mL的條件下，為了確定最佳的檢測時間設(shè)置加刃天青過4 h、6 h、8 h、10 h和12 h進(jìn)行檢測。

1.7 原頭蚴總數(shù)的檢測 取在37 ℃體外培養(yǎng)的原頭蚴經(jīng)生理鹽水洗滌3次，分別取0、50、100、200、400、800頭原頭蚴加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)置2個副孔。每個孔用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基定容至250 μL，加入終濃度為0.2 mg/mL的刃天青工作液。37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育10 h，在激發(fā)波長560 nm發(fā)射波長590 nm下測定熒光值，重復(fù)檢測1次。

1.8 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理方法 本實(shí)驗(yàn)通過使用Excel、prism5.0和生物統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析。

2 結(jié) 果

2.1 原頭蚴在激光掃描共聚焦顯微鏡檢測的照片 原頭蚴經(jīng)刃天青染色20 h，置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：活的原頭蚴經(jīng)刃天青染色發(fā)出紅色熒光，其中原頭蚴的小鉤和顆粒細(xì)胞熒光強(qiáng)度較高，死亡的原頭蚴經(jīng)刃天青染色沒有熒光或熒光亮度很弱(圖 1)。

2.2 確定最佳檢測波長 根據(jù)刃天青的性質(zhì)，選擇激發(fā)波長520～570 nm，發(fā)射波長590 nm、600 nm下進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，各激發(fā)波長在發(fā)射波長590 nm下的R2值在0.959 6～0.992之間，各激發(fā)波長在發(fā)射波長600 nm下的R2值在0.952～0.983 7之間，在激發(fā)波長560 nm發(fā)射波長590 nm下檢測的每個孔的活原頭蚴總數(shù)和對應(yīng)的熒光值之間的相關(guān)系數(shù)最大，為0.992 8(圖 2)。

2.3 確定最佳檢測時間 為優(yōu)化刃天青的檢測時間，加刃天青4 h、6 h、8 h、10 h和12 h后，分別進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，各檢測時間點(diǎn)的R2值在0.944 3～0.997 5之間，加刃天青過10 h時檢測的每個孔的活原頭蚴總數(shù)和對應(yīng)的熒光值之間的相關(guān)系數(shù)最大，R2為0.997 5(圖 3)。

2.4 確定最佳刃天青濃度 為優(yōu)化刃天青的濃度，選擇刃天青濃度為0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL分別進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，各刃天青濃度的R2值在0.948 1～0.992 0之間刃天青工作液加0.2 mg/mL為最佳，因?yàn)槿刑烨嘣诖藵舛葧r的每個孔的活原頭蚴總數(shù)和對應(yīng)的熒光值之間相關(guān)系數(shù)最大(圖 4)。

2.5 建立數(shù)學(xué)模型 本實(shí)驗(yàn)共重復(fù)了9次，每次實(shí)驗(yàn)2個復(fù)孔(表 1)，取18組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值繪制散點(diǎn)圖(圖 5)，存活原頭蚴總數(shù)(x)與熒光值(y)呈正比，為線型關(guān)系。經(jīng)線型回歸分析，獲得方程里a=6.453、b=0.019 ，回歸方程為y=0.019x+6.453，R2=0.989，相關(guān)系數(shù)r=0.994。對相關(guān)系數(shù)r作顯著性檢驗(yàn)，得知P<0.01。說明每個濃度的活原頭蚴總數(shù)與每個濃度對應(yīng)的熒光值之間的相關(guān)系數(shù)r極顯著。

Fig.2 The R2chart on excitation wavelengths (520, 530, 540, 550, 560, and 570) nm and emission wavelength of 590 nm and 600 nm

2.6 可重復(fù)性分析 為了驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)方法的可重復(fù)性，對9次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明，2個平行實(shí)驗(yàn)中的對應(yīng)的熒光值的方差近似相同，因此符合單因素方差分析的條件(表 2)。對每次實(shí)驗(yàn)的對應(yīng)熒光值的2個平行測量值做方差分析，所有測量的平行實(shí)驗(yàn)方差基本相同，F(xiàn)統(tǒng)計(jì)量值為1.79，小于臨界值6.96，說明每個平行實(shí)驗(yàn)對應(yīng)熒光值之間無明顯差異；同樣，P=0.155大于0.05也可以說明不同次實(shí)驗(yàn)的活原頭蚴總數(shù)的不同平行實(shí)驗(yàn)之間無明顯差異。

Fig.5 Scatter diagram of protoscolex number and corresponding fluorescence value

3 討 論

本研究利用刃天青在活細(xì)胞線粒體酶的作用下被還原成強(qiáng)熒光物質(zhì)的性質(zhì)，建立了檢測細(xì)粒棘球絳蟲存活原頭蚴總數(shù)的檢測方法。0.2 mg/mL的刃天青染色原頭蚴10 h后，利用全波長掃描儀檢測激發(fā)波長560 nm、發(fā)射波長590 nm下的熒光值，根據(jù)已知存活原頭蚴總數(shù)(x)與對應(yīng)的熒光值(y)建立數(shù)學(xué)模型，即可用于計(jì)算未知存活原頭蚴的總數(shù)。激光掃描共聚焦顯微鏡的結(jié)果(圖 1)提示，在該條件下，刃天青能夠特異性使存活的原頭蚴發(fā)出紅色熒光，而該紅色熒光可被全波長掃描儀檢測，從而根據(jù)熒光值可檢測存活原頭蚴的總數(shù)。目前常規(guī)的原頭蚴計(jì)數(shù)方法為，在普通光學(xué)顯微鏡下，通過判斷原頭蚴是否被伊紅[14]、臺盼藍(lán)[15]等染色劑染色，來鑒定原頭蚴的活性并計(jì)數(shù)。此方法需靠肉眼判斷和人工計(jì)數(shù)，存在一定的人為誤差，當(dāng)檢測的藥物數(shù)量較多時，耗費(fèi)人力較高。刃天青染色法能夠避免伊紅和臺盼藍(lán)等染色法的弊端，僅需計(jì)數(shù)數(shù)學(xué)模型中的原頭蚴總數(shù)，在大規(guī)模篩選抗包蟲病藥物的工作中具有誤差小和方便快捷等優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用于細(xì)菌、綿羊精子、植物種子、肝細(xì)胞等物質(zhì)的活性檢測或計(jì)數(shù)。Samreen等[16]在對多種維生素和畸胎劑對雞胚心肌細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)法的影響研究中用刃天青測定雞胚心肌細(xì)胞的活性，Shabafrooz[17]等在透明質(zhì)酸對膠原組織工程支架的腸道生理功能的影響的研究中用刃天青測定細(xì)胞的活性和數(shù)量。

Note:theFvalue was 1.79, the critical value ofFis 6.96; thePvalue is 0.155

本研究從刃天青濃度、檢測時間、激發(fā)波長和發(fā)射波長等方面對刃天青的檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化。Alberto等[18]和John等[19]研究中，刃天青的激發(fā)波長為530 nm或560 nm，發(fā)射波長為590 nm，刃天青終濃度為0.5 mg/mL，檢測時間為19 h或45 h。本研究選擇激發(fā)波長范圍為520～570 nm，發(fā)射波長為590 nm和600 nm，刃天青濃度為0.1 mg/ mL、0.2 mg/ mL、0.3 mg/mL和0.4 mg/mL，檢測時間為4 h、6 h、8 h、10 h和12 h進(jìn)行檢測，基本涵蓋了關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。結(jié)果表明：激發(fā)波長560 nm、發(fā)射波長590 nm下，加0.2 mg/mL刃天青過4 h、6 h、8 h、10 h和12 h測的結(jié)果都較好，即R2值分別為0.969 1、0.935 1、0.995 6、0.997 6、0.965 6(圖 2)。本研究認(rèn)為加刃天青終濃度為0.2 mg/mL，檢測時間為10 h，激發(fā)波長為560 nm、發(fā)射波長為590 nm下測的結(jié)果相關(guān)性最好。

本原頭蚴計(jì)數(shù)方法初步建立，有待在大規(guī)模的抗包蟲病藥物體外篩選中應(yīng)用，以驗(yàn)證該方法的有效性。另外，本方法的最佳刃天青染色時間為10 h，耗時較長，需要篩選更為快速的熒光染色劑用于細(xì)粒棘球蚴蟲的計(jì)數(shù)工作。

本研究首次建立了熒光檢測細(xì)粒棘球蚴蟲活性的實(shí)驗(yàn)方法，為包蟲病新藥及其他寄生蟲病藥物的研發(fā)提供了一種簡便、準(zhǔn)確度高的實(shí)驗(yàn)方法。

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Detection of amount of protoscolices of Echinococcus granulosus with resazurin reduction method

RUOSHANGULI Rou-zi1,2,GAO Hui-jing1,LIU Hui1,XIAO Yun-feng1,YANG Ning1,ZHAO Jun1,WANG Jian-hua1,LIN Ren-yong1,WEN Hao1,LYU Guo-dong1

(1.Xinjiang Major Disease Medical Laboratory and Key Laboratory of the Ministry and Province Cultivation Base,Clinical Medical Research Institute, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China;2.Xinjiang Bestmind Biological Technology Development Co,. Ltd., Urumqi 830054, China)

We aimed to establish a new experimental method to detect the total number of living protoscolices ofEchinococcusgranulosusbased on the reduction characteristic of resazurin that the resazurin could emit strong fluorescence when reduced by mitochondrial enzyme. The fluorescence values of the protoscolices stained with resazurin was determined by fluorescence spectrophotometer (excitation wavelength at 560 nm, emission wavelength 590 nm), and the morphology were observed by laser scanning confocal microscope. A mathematical model was established based on the relationship between the number of living protoscolices and the corresponding fluorescence values through the statistical method. Results of the laser scanning confocal microscope showed that the living protoscolices stained by resazurin emitted red fluorescence while the death one emitted little fluorescence. According to the relationship between the measured fluorescence values and corresponding protoscolices number, a linear equation y=0.019x+6.453 was established, and the total numbers of living protoscolices could be obtained by putting the fluorescence value (y) into the formula. The correlation coefficient of the mathematical model was r=0.994 andP<0.01, which showed that the correlation coefficient r between living protoscolices number in each concentration and corresponding fluorescence values of each concentration was very significant. This study established a rapidly experimental method, which based on the reduction characteristic of resazurin, to detect the total number of living protoscolices ofEchinococcusgranulosusinvitro. This method avoids artificial errors and reduce the human consumption, and could be applied to screening anti-echinococcosis drugs in large scaleinvitro. Keywords: resazurin;Echinococcusgranulosus; protoscolices; total number detection Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81360251), the Scientific Research Foundation of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University (No. 2010YX01), and the State Key Laboratory Incubation Base of Xinjiang Major Diseases Research Fund (No. SKLIB-XJMDR-2012-2)

Lü Guo-dong, Email: lgd_xju@163.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.009

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81360251)；新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(No.2010YX01)；新疆重大疾病醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題資助項(xiàng)目(SKLIB-XJMDR-2012-2)；教育部長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRT1181)

呂國棟，Email:lgd_xju@163.com

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，臨床醫(yī)學(xué)研究院，新疆重大疾病醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830054； 2.新疆貝斯明生物技術(shù)發(fā)展有限公司，烏魯木齊 830054

R383.3

A

1002-2694(2015)04-0334-06

2014-07-04；

2014-10-27