楊艷紅，蘭海楠，付志玲，劉 禹，崔煥忠，吳天成，楊 歡，洪 盼，李雨萌，鄭 鑫

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林 長春130118）

生長激素受體(growth hormone recepter，GHR)屬于I類細(xì)胞因子受體，是調(diào)節(jié)機(jī)體后天生長的主要因子，生長激素(growth hormone，GH)只有在與受體結(jié)合后，才能啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝、發(fā)育、繁殖以及免疫等生理功能[1]。由于分泌激素的異常性及需求性的不同，人們開始試圖通過利用免疫學(xué)技術(shù)制備抗獨(dú)特型抗體或抗受體單克隆抗體以及利用基因工程技術(shù)對天然GH分子進(jìn)行改造的方法來改變與受體作用的活性或降低二者的結(jié)合力，尋求GHR的激活劑和拮抗劑。了解GHR激活的機(jī)制是合理設(shè)計(jì)受體激活劑和拮抗劑的關(guān)鍵。

1 生長激素受體的激活機(jī)制

GHR的激活機(jī)制一直都是人們研究的熱點(diǎn)。GHR有胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域組成，其中胞外域具有兩個(gè)亞域（亞域1和亞域2）。過去人們一直認(rèn)為GHR是以單體形式存在于靶細(xì)胞膜表面，是GH誘導(dǎo)受體后使其發(fā)生二聚化，但是，現(xiàn)在有大量研究發(fā)現(xiàn)，GHR本身就是二聚體形式[2]。受體亞域2內(nèi)含有二聚化接口，在這個(gè)接口處的氨基酸可以形成GH（GHR）2復(fù)合物中兩個(gè)單體GHR間的非共價(jià)鍵[3]。腦垂體前葉分泌的GH與GHR以1∶2的比例結(jié)合后，二聚化接口處的氨基酸雖然對于激素結(jié)合的作用不大，但是對于啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)卻是必不可少的，可促進(jìn)誘發(fā)后續(xù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活性受體的形成，進(jìn)而發(fā)揮其促進(jìn)合成與代謝等生物學(xué)作用[3]。每個(gè)GH有兩個(gè)GHR結(jié)合位點(diǎn)，這兩個(gè)位點(diǎn)一個(gè)為高親和性位點(diǎn)(Site 1)，由螺旋4近C端的一些氨基酸殘基、螺旋1和螺旋2之間非螺旋的連接部分以及螺旋1近N端的少數(shù)幾個(gè)殘基共同組成，另一個(gè)是低親和性位點(diǎn)（Site 2），由N端的一些殘基以及螺旋3上的一些殘基組成，兩個(gè)位點(diǎn)與受體的結(jié)合是通過一種有序方式進(jìn)行的，不能反向?yàn)橹甗4]。

如果一種抗體具有GH結(jié)合的兩個(gè)位點(diǎn)或有與這兩個(gè)位點(diǎn)相近的氨基酸組成，并且能夠與受體結(jié)合，則有可能成為受體激活劑的一種；如果限制了其中一個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合或者是與受體結(jié)合后不能誘導(dǎo)受體轉(zhuǎn)換成激活受體的形式，也即不能誘導(dǎo)其發(fā)生能夠引發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的構(gòu)象變化，則會限制GHR介導(dǎo)的生物學(xué)作用，成為GHR拮抗劑。

2 生長激素受體激活劑與拮抗劑的發(fā)展

2.1 生長激素受體激活劑的發(fā)展 GH部分或完全缺乏，或由于結(jié)構(gòu)異常、受體缺陷等原因都會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)生長激素缺乏癥（Growth Hormone Deficiency，GHD），GH缺乏的患者，生長發(fā)育遲緩，有的還會表現(xiàn)為侏儒癥。比較理想的治療方案是激素替代治療，但是，因?yàn)镚H的半衰期很短，這就要求替代治療過程中每天都需要對病人進(jìn)行注射GH。為此，人們開始對長效GH進(jìn)行探索以減少替代治療中的不便。其中的一種方法是誘導(dǎo)激素結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行突變來增強(qiáng)激素與受體結(jié)合的親和性來增加GH的生物活性。例如，用存在于hGH位點(diǎn)1上的氨基酸殘基取代pGH位點(diǎn)1的殘基后得到的激素其活性要比正常pGH的活性高5倍，但是未能改變其半衰期較短的問題[5]。將GH分子共價(jià)連接聚乙二醇后被證實(shí)可以延長激素的半衰期，對于GHD患者可由原來的每天注射改成每周注射，但是該方法降低了激素的活性[6]。于是，緩釋長效激素分子吸引了眾多目光，當(dāng)前研究比較多的藥品有Nutropin Depot和Biosphere，但是療效不明顯現(xiàn)在也已經(jīng)停產(chǎn)[1]。

除了改變激素本身來提高GH的活性外，利用免疫學(xué)方法尋找長效受體激活劑也一直受到國內(nèi)外研究者的青睞。其中一種方法是制備GH的抗獨(dú)特型抗體，由于GH的抗獨(dú)特性抗體具有2個(gè)相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)，因此可以同時(shí)與2個(gè)GHR結(jié)合，啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，如豬生長激素抗獨(dú)特型單克隆抗體（CG1）[7]。另外一種方法是用GHR免疫Balb/c小鼠獲得抗GHR單克隆抗體mAb263，據(jù)報(bào)道，每天給垂體切除鼠注射200μg的mAb263與注射3μg hGH/d對鼠的增重效果是相近的，可見mAb263具有模擬GH的作用，同時(shí)mAb263還能夠誘導(dǎo)受體發(fā)生與GH刺激相近但是不一致的受體構(gòu)象變化。mAb263是一種構(gòu)象敏感型的激活性抗體，與GHR ECD親和性很高，其表位殘基不連續(xù)的結(jié)合到靶細(xì)胞膜受體亞域1上，主要分布在D-E帶以及二者間的β環(huán)狀肽內(nèi)（見圖1），結(jié)合后誘導(dǎo)受體亞域2及胞內(nèi)域發(fā)生特定的構(gòu)象變化，進(jìn)而決定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的選擇方向[8-9]。

2.2 生長激素受體拮抗劑的發(fā)展 受體拮抗劑的研制與開發(fā)主要基于兩點(diǎn)：（1）通過抑制生長激素與受體結(jié)合，進(jìn)而抑制生長激素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而封閉其生理作用，這種抑制劑的開發(fā)著力點(diǎn)是研制無活性的生長激素類似物；（2）通過抑制生長激素誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這種技術(shù)方法并不抑制生長激素與受體結(jié)合，而是主要通過抑制受體的構(gòu)象變化，進(jìn)而使生長激素不能發(fā)揮其生理活性，這種抑制主要是靠生長激素受體的抗體而實(shí)現(xiàn)的。

通過對hGH和bGH的比較研究發(fā)現(xiàn)，bGH的117、119位和122位氨基酸并未能排列成一個(gè)理想的α螺旋,它們所組成螺旋3的多肽具有明顯低的促生長活性，所以產(chǎn)生了合成理想螺旋3來生成高活性的GH類似物的想法[10]。于是出現(xiàn)了表達(dá)有bGHM8（GH的螺旋3基因發(fā)生突變，一種GH模擬物）的轉(zhuǎn)基因小鼠，但是這種小鼠表現(xiàn)為侏儒鼠，還有低循環(huán)的胰島素樣生長因子I(insulin-like growth factorI，IGF-I)，并且在體外bGH-M8還會抑制125I-bGH與肝細(xì)胞膜的結(jié)合，綜合這些癥狀可見bGH-M8實(shí)際上是一種GHR的競爭性拮抗劑，這也是報(bào)道最早的受體拮抗劑[10]。轉(zhuǎn)基因動物模型同時(shí)也證實(shí)了如果將GH分子的一個(gè)氨基酸取代后，GH分子就能從一個(gè)模擬物轉(zhuǎn)變成為受體拮抗劑。bGH分子的119位甘氨酸殘基相當(dāng)于hGH分子螺旋3的120位甘氨酸殘基，這個(gè)氨基酸殘基對于GH的生物活性是很重要的。hGH G120K和hGH G120R是將120位甘氨酸殘基分別被賴氨酸殘基與精氨酸殘基替換后所得到的GH激素類似物，這種類似物的位點(diǎn)1與受體結(jié)合緊密抑制位點(diǎn)2的結(jié)合，使得類似物能夠與受體結(jié)合但是不能激活受體相關(guān)的構(gòu)象變化，促生長活性減弱，產(chǎn)生拮抗hGH的作用。但是由于兩者的半衰期都很短（約30min）不能直接應(yīng)用，于是研究者又改動了hGH G120K結(jié)合位點(diǎn)1內(nèi)很重要的8個(gè)位點(diǎn)的氨基酸，并將其與聚乙二醇（PEG，相對分子量為5 000）結(jié)合后形成PEG-hGH G120K（B2036 PEG），即培維索孟（pegvisomant）[11]。培維索孟是第一個(gè)用于臨床治療肢端肥大癥的GHR拮抗劑[12]。

除了從配體的角度對拮抗劑進(jìn)行研究以外，另一種比較成功的拮抗劑方案是從受體的角度來尋求受體拮抗劑。如抗GHRmAb18.24會通過識別受體亞域2而不能識別受體亞域1，阻止配體與受體結(jié)合進(jìn)而抑制受體的激活，從而抑制體外試驗(yàn)中GH依賴性細(xì)胞增殖和體內(nèi)肝細(xì)胞GH信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。另一個(gè)單克隆抗體mAb5它能夠抑制生長激素誘導(dǎo)的受體構(gòu)象變化，使生長激素只能通過一個(gè)位點(diǎn)結(jié)合到生長激素受體上，致其不能進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此mAb5單克隆抗體在研究生長激素受體激活機(jī)制的研究中，受到廣泛應(yīng)用[2]。

3 生長激素受體激活劑和拮抗劑的應(yīng)用

3.1 生長激素受體激活劑的應(yīng)用 GH廣泛的生理作用，對畜牧業(yè)生產(chǎn)有重要的經(jīng)濟(jì)意義。當(dāng)機(jī)體GH分泌量很少的時(shí)候，如果額外施加GH，雖然會增加動物的生長，但是會引起內(nèi)分泌失調(diào)、精神異常等一系列負(fù)面影響。目前，GH緩釋制劑并不具有給藥次數(shù)少，避免注射帶來的痛苦等特點(diǎn)。由于受體單克隆抗體的研究發(fā)現(xiàn)，使人們明白應(yīng)用特異性抗體可以改變動物原有的生理學(xué)模式，例如，孕酮抗體可以防止動物妊娠等，生長抑素抗體可以增加垂體對GH的合成與分泌,抗脂肪細(xì)胞膜蛋白抗體可以減少動物脂肪沉積，針對GH特異性表位以及GH抗體的抗體可以增強(qiáng)或模擬激素功效等[14]。mAb263作為一種可以與受體結(jié)合的商業(yè)化抗體，在給小鼠注射后還沒有發(fā)現(xiàn)異常反應(yīng)，但是由于其作為受體激活劑的活性要比hGH弱的多，且mAb263會不會誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性信號路徑還都是未知，使得在當(dāng)前mAb263大部分還都只是應(yīng)用于試驗(yàn)階段，將其作為鑒定受體的工具或者是試驗(yàn)進(jìn)程中的陽性對照使用，并未進(jìn)行生產(chǎn)實(shí)踐上的使用。

3.2 生長激素受體拮抗劑的應(yīng)用 機(jī)體GH分泌量過多一直也是醫(yī)學(xué)上難以解決的問題。通過手術(shù)、放療等減少激素分泌量的傳統(tǒng)方法效果并不理想，內(nèi)科藥物如多巴胺興奮劑溴隱停及應(yīng)用較廣泛地SMS也因其眾多的副作用而限制了其臨床應(yīng)用[11]。商品名為Somaver的Pegvisomant，是當(dāng)前惟一一種首次獲得歐盟批準(zhǔn)可以應(yīng)用于臨床治療的新一代GHR拮抗劑藥物[11]。在一項(xiàng)驗(yàn)證Pegvisomant治療肢端肥大癥療效的研究中發(fā)現(xiàn)，對112例患者進(jìn)行為期l2周的隨機(jī)雙盲、安慰劑對照的試驗(yàn)，所有患者血清IGF-I基線水平均達(dá)到年齡相關(guān)的參考值上限的130%以上，且Pegvisomant治療的患者中血清IGF-I呈現(xiàn)劑量依賴性下降，皮下注射10mg、15mg和20mg Pegvisomant的三組受試者中，隨著注射劑量的增加血清IGF-I水平恢復(fù)正常水平的個(gè)體數(shù)也相應(yīng)的會增加，20mg組可以使89%的個(gè)體血清IGF-I水平降至正常[15]。同時(shí)，Parkinson等[16]還發(fā)現(xiàn)使用Pegvisomant可以使肢端肥大癥患者骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)降至正常水平，從而改善由肢端肥大癥所引起的代謝性骨病和骨質(zhì)疏松癥等。

此外，van der Lely通過對152名患者平均接受Pegvisomant治療18個(gè)月的臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其中有90%的病人治療12個(gè)月后IGF-l為正常水平[15]，同時(shí)，Muller等[10]還發(fā)現(xiàn)在長期治療過程中GH分泌水平大幅增長，而且，Pegvisomant能潛在地抑制硬腦胞膜瘤、結(jié)腸癌、乳腺腫瘤的生長。還有相關(guān)報(bào)道說通過轉(zhuǎn)基因小鼠可以證實(shí)Pegvisomant能夠防止腎小球硬化等[17]。由于Pegvisomant和細(xì)胞膜上二聚化受體的親和力只有hGH的1/40，所以要加大Pegvisomant的濃度才能對hGH起到拮抗作用。

4 展望

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人們不會停止對于治療激素缺乏或者過剩等疾病的腳步。由于GH抗獨(dú)特型抗體兩個(gè)位點(diǎn)的同一性還不能夠完全等價(jià)于GH這種柔性不對稱的蛋白分子，能夠模擬激素多種功能的mAb263由于其活性的過低性，沒有得到廣泛應(yīng)用，但是如果從mAb263可以誘導(dǎo)受體發(fā)生與激素刺激相近但不一致的構(gòu)象變化來看，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能與激素介導(dǎo)的也不完全一致，也許mAb263能夠作為特異性信號通路的激活因子也是未可知的。生長激素受體拮抗劑中比較成功的典例是培維索孟，它可直接作用于外周GHR，阻止其形成功能性二聚體，減少后續(xù)的信號傳導(dǎo)，可使肝臟和其他組織合成IGF-1減少，有效改善肢端肥大癥患者臨床癥狀及代謝紊亂。培維索孟半衰期長，在阻斷GH的作用和降低血清IGF-1水平的作用上效率高、起效快，但是其臨床長期使用的安全性尚未得到全面評估。

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