張 雙，郭 慧，徐 浩，孟繁星，胡桂學(xué)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118）

豬瘟（CSF）是由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的豬的急性、熱性、高度接觸性傳染病，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)。目前用來防治豬瘟的疫苗主要是中國豬瘟兔化弱毒疫苗、日本GPE-疫苗和法國Thireval 疫苗[1]。在我國，豬瘟弱毒疫苗的應(yīng)用一定程度上控制了該病的暴發(fā)與流行，但是目前尚沒有方法可以區(qū)別豬瘟疫苗免疫抗體和野毒感染抗體，豬瘟的隱性感染和散發(fā)仍然嚴(yán)重影響我國養(yǎng)豬業(yè)。因此，現(xiàn)有的傳統(tǒng)疫苗已不能適應(yīng)新形勢的需要，研究和開發(fā)新型豬瘟疫苗是未來研究的方向。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的迅速興起和發(fā)展，為新型豬瘟疫苗的研究和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 亞單位疫苗

亞單位疫苗（subunit vaccine）是將編碼病原微生物的保護(hù)性抗原基因?qū)胧荏w菌或細(xì)胞，使其在受體中高效表達(dá)保護(hù)性抗原蛋白，將此抗原蛋白與佐劑聯(lián)合制成的一類疫苗。亞單位疫苗是病毒粒子的一部分，不含核酸，具有良好的安全性和穩(wěn)定性，但亞單位疫苗的免疫原性通常較低，需要與佐劑聯(lián)合使用，或偶聯(lián)到適當(dāng)?shù)妮d體上應(yīng)用。CSFV編碼的E2 和E0 蛋白是其主要保護(hù)性抗原，均能獨(dú)立誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，保護(hù)機(jī)體免受強(qiáng)毒攻擊。E2 亞單位疫苗是最早投入使用也是目前惟一投入使用的亞單位疫苗。

荷蘭學(xué)者將CSFVE2 基因與核型多角體病毒（AcNPV）重組，并在昆蟲細(xì)胞Sf21 中成功表達(dá)，免疫20 μg 表達(dá)的E2 蛋白可以保護(hù)被免疫豬免受強(qiáng)毒的攻擊。在克隆豬瘟病毒囊膜糖蛋白E2和Erns 的基礎(chǔ)上，開發(fā)出了豬瘟的亞單位標(biāo)記疫苗及與之相配套的診斷試驗(yàn)。初步檢驗(yàn)結(jié)果顯示，這種E2 疫苗和配套的診斷試驗(yàn)具有較好的效果。2009 年臺灣研究者利用巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)成功的表達(dá)重組E2 蛋白，并在其后的動物試驗(yàn)中也取得了成功[2]。另外，E2 蛋白上的中和表位在豬瘟病毒毒株中是保守的，因此在E2 蛋白基礎(chǔ)上開發(fā)的亞單位疫苗不僅具有對抗CSFV野毒株的廣泛保護(hù)作用，而且很容易通過檢測抗Erns 的抗體將免疫的和感染的豬區(qū)分開[3]，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。

亞單位疫苗雖然具有良好的個體保護(hù)效果，但其接種動物血清中的E2 抗體滴度上升較慢，也不能阻止CSFV的水平傳播[4]。另外，接種動物血清中的Erns 抗體在接種后短時(shí)間內(nèi)無法達(dá)到可檢水平，這為配套的抗體鑒別檢測造成了很大的局限。目前，國內(nèi)外許多機(jī)構(gòu)正在研究改進(jìn)CSFV亞單位疫苗的佐劑以及配套的ELISA檢測，已取得了一定的進(jìn)展。

2 合成肽疫苗

利用DNA重組技術(shù)，根據(jù)CSFV基因組的核苷酸序列，可推導(dǎo)出CSFV蛋白質(zhì)的氨基酸序列，從而可用人工合成方法制備其主要抗原相應(yīng)的寡肽，制備豬瘟合成肽疫苗[5]。Zhou Y J等[6]報(bào)道，合成5 段豬瘟石門株B/C區(qū)693～777 位氨基酸，偶聯(lián)BSA制成合成肽苗，結(jié)果免疫豬能產(chǎn)生高滴度的抗體，并能完全保護(hù)強(qiáng)毒的攻擊。以此多肽制備高免血清，此血清1∶4 和1∶6 稀釋后能抑制C株的兔體熱反應(yīng)，而用合成多肽對高免血清進(jìn)行親和層析處理后，則不能抑制C株的兔體熱反應(yīng)。

許多研究結(jié)果表明，豬瘟合成肽疫苗免疫后所起的免疫保護(hù)作用不是很理想，而且構(gòu)建合成肽疫苗的抗原性及其免疫原性要受到其自身組成、豬體免疫系統(tǒng)等多種因素的影響。在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫的過程中，單一的中和抗原表位是不夠的，增加中和抗原表位的數(shù)目和引入細(xì)胞抗原表位將起到輔助協(xié)同作用。若要提高合成肽疫苗的免疫效果，需要在探究合成肽疫苗的免疫機(jī)理，利用有限的抗原表位誘導(dǎo)強(qiáng)有力的免疫保護(hù)作用等方面做進(jìn)一步的研究。

3 基因缺失型弱毒疫苗

通過基因工程技術(shù)使病毒基因組中的毒力基因缺失，可以獲得基因缺失型弱毒疫苗株。Widjojoatmodjo MN 等[7]建立了能夠表達(dá)豬瘟病毒糖蛋白Erns 的細(xì)胞系SK-6c26，構(gòu)建了兩個Erns 缺失突變株Flc23 和Flc22，經(jīng)檢測證明SK-6c26 所產(chǎn)生的Erns 蛋白和其他豬瘟病毒Erns 蛋白具有相同的生化特性，分別用兩個突變株免疫試驗(yàn)豬，均可抵抗致死量豬瘟病毒強(qiáng)毒的攻擊，而且Erns 的缺失可用于感染豬和免疫豬的鑒別。Yang Z 等[8]構(gòu)建了3 個E2 基因缺失的感染性DNA，這3 個缺失突變株均不能產(chǎn)生活病毒，表明E2 的每一個抗原區(qū)對豬瘟病毒的生存都是必要的。但是這些缺失突變株接種豬后，均會產(chǎn)生不同程度的免疫作用，用血清學(xué)試驗(yàn)可以區(qū)別于正常毒株。Ruggli N 等[9]使用鼠的泛素來替換CSFVNpro 基因,分別在強(qiáng)毒株Alfort/187 和Eystrup 的基礎(chǔ)上，構(gòu)建出了2 個穩(wěn)定的CSFV弱毒株。試驗(yàn)動物在接種一次弱毒以后能夠抵抗強(qiáng)毒株Eystrup的攻毒。但Npro 蛋白在感染動物體內(nèi)產(chǎn)生的抗體并不能達(dá)到ELISA檢測水平，所以Npro 基因缺失株必須同時(shí)進(jìn)行額外的修飾來達(dá)到可鑒別的目的。

以上研究說明，基因缺失型弱毒疫苗可能是發(fā)展豬瘟新型疫苗的有效途徑之一，采用此方法會制造出免疫原性好、安全性高的弱毒疫苗株。

4 活載體重組疫苗

豬瘟病毒活載體重組疫苗是將CSFV的目的基因用重組DNA技術(shù)克隆到活的載體病毒中制備的一種疫苗，可直接用這種疫苗經(jīng)多種途徑免疫豬。目前用于表達(dá)外源性病毒蛋白的載體包括偽狂犬病病毒（PRV）、痘病毒（VAC）和腺病毒（ADV）等[10]。

4.1 偽狂犬病病毒載體疫苗 重組PRV能保持良好的抗原性、毒力不返強(qiáng)、對人無傳染性、易于與野毒區(qū)別[11]。目前，PRV基因缺失疫苗株多通過缺失gE、gI、gC、gG、TK 等非必需基因來實(shí)現(xiàn)。Lee K S[12]等構(gòu)建了能表達(dá)CS2FVE2 蛋白的gD、gE 雙缺失的偽狂犬病病毒重組疫苗，免疫接種試驗(yàn)表明，該活載體疫苗能使豬獲得對偽狂犬病和豬瘟的雙重保護(hù)。路明華等[13]將SV40 啟動子控制下的Lac Z 報(bào)告基因的表達(dá)盒與分別在CMV啟動子控制下的含有CSFVE2 基因及PRRSVGP5 基因的表達(dá)盒插入到PRVBartha-K61 株TK 基因中，Western blot 和間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)E2、GP5 基因在重組病毒感染細(xì)胞中獲得表達(dá)。

4.2 痘病毒載體疫苗 痘病毒的宿主范圍較廣，毒性弱，而且其基因組較大，可插入大片段的外源基因，同時(shí)能表達(dá)多個目的基因，各基因的表達(dá)互不干擾，遺傳穩(wěn)定。使用痘苗病毒作為載體，插入E2 基因，并缺失胸腺激酶（TK）基因獲得毒力降低的重組痘苗病毒，免疫豬后可以保護(hù)豬免受CSFV強(qiáng)毒的感染。李譜華等[14]選擇雞痘病毒作為載體，將CSFV石門株的Erns 和E2 基因克隆入雞痘病毒表達(dá)載體FPV-P11 中，成功構(gòu)建了重組雞痘病毒，免疫豬后用100 LD50的強(qiáng)毒進(jìn)行攻擊，結(jié)果顯示，免疫豬保護(hù)率達(dá)到75%。目前，一些新的高度致弱的痘苗病毒載體被開發(fā)出來，具有較高的生物安全性，在豬瘟新型疫苗的研究中具有很大的潛力。

4.3 腺病毒載體疫苗 腺病毒只感染豬，毒力低，高滴度制備，易純化，是一種很好的活病毒載體。CSFV的E2 基因重組ADV疫苗，可以保護(hù)豬抵抗強(qiáng)毒攻擊，且攻毒后無任何臨床癥狀，剖檢無任何病理變化[15]。孫元等[16]將CSFV的石門株E2 全長基因片段，定向克隆到重組腺病毒AdEasy-1 系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV上，成功包裝出重組腺病毒rAdVE2，分別在兔體和豬體上進(jìn)行動物試驗(yàn)，結(jié)果顯示試驗(yàn)中的兔體未出現(xiàn)定型熱反應(yīng)，接種rAdV-E2 的試驗(yàn)豬則能完全抵抗CSFV石門株強(qiáng)毒的攻擊。

目前活載體重組疫苗的安全性和實(shí)用價(jià)值仍有爭議，因?yàn)槿祟愔两襁€不了解病毒的自然發(fā)生及變異機(jī)制，也就無法控制這類人造病毒的未來走向。一旦將該病毒放入自然界中，重組疫苗載體株與其他弱毒疫苗或野生毒株之間的異常遺傳信息交換，同源或非同源重組后會產(chǎn)生攜有外源基因的強(qiáng)毒性突變株，有可能改變其生物學(xué)特征，衍變出對人、獸有害的病毒變種，這還需要做深入細(xì)致的研究。

5 核酸疫苗

用豬瘟病毒E2 蛋白基因的表達(dá)載體可直接作為免疫豬體的核酸疫苗，該疫苗既可以誘導(dǎo)體液免疫，也可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，是近年來豬瘟病毒免疫研究的熱點(diǎn)。

核酸疫苗雖然起步較晚，但在豬瘟疫苗領(lǐng)域取得了很大的進(jìn)展。Hammond 等和Andrew等分別構(gòu)建了表達(dá)CSFVE2 基因的重組質(zhì)粒，并證明了對豬具有較好的保護(hù)作用。周鵬程等實(shí)驗(yàn)證明，針對CSFV5'端非編碼區(qū)NS3 蛋白絲氨酸蛋白酶功能區(qū)的寡聚核苷酸對CSFV復(fù)制均有顯著的抑制作用，這種特異性的寡聚核苷酸有可能成為抗CSFV的新型藥物或DNA疫苗。李娜等[17]構(gòu)建了基于甲病毒SFV復(fù)制子的DNA疫苗PSFV1CS-E2，隨后的兔體交換試驗(yàn)和豬體攻毒保護(hù)試驗(yàn)均顯示了良好的免疫保護(hù)效果。

DNA疫苗免疫的最大優(yōu)點(diǎn)是能在同一時(shí)間，通過質(zhì)粒攜帶的編碼不同病毒抗原基因進(jìn)行免疫，若同時(shí)將編碼細(xì)胞因子的基因插在質(zhì)粒上，不但可以提高免疫反應(yīng)，而且可以調(diào)整反應(yīng)從Th1 向Th2 型反應(yīng)過渡。另外，DNA疫苗還可有效排除母源抗體的干擾。如果能夠解決和改進(jìn)核酸疫苗潛在的安全性和接種方法，CSFV核酸疫苗會為豬瘟疫苗研究領(lǐng)域注入新的活力。

6 全長感染性cDNA標(biāo)記疫苗

全長cDNA標(biāo)記疫苗是在分子水平上，將具有選擇性標(biāo)記的基因替換或克隆到致弱病毒全長cDNA中，獲得的重組病毒，免疫動物后經(jīng)過檢測，可以區(qū)分抗體來自于自然感染還是標(biāo)記疫苗免疫，從而鑒別出感染豬群和免疫豬群[18]。

2000 年，De Smit 等利用CSFV疫苗毒株、中國C株的基因組DNA拷貝構(gòu)建了2 個重組CSFV（Flc2、Flc3）。試驗(yàn)表明，重組病毒在兔和豬中保留了父代C株的生物學(xué)特性和免疫原性，C株全長cDNA可作為基質(zhì)以開發(fā)活的重組CSFV標(biāo)記疫苗。2001 年，De Smit 等[19]將疫苗株重組病毒的E2 和Erns 部分序列分別用BVDV相應(yīng)區(qū)段替換構(gòu)建了2 個鑲嵌病毒，在免疫1～2 周后，即可對豬產(chǎn)生較好的保護(hù)作用。經(jīng)重組病毒接種的豬，可以抵抗致死劑量豬瘟病毒的攻擊，即使不能誘導(dǎo)中和抗體的重組子也可產(chǎn)生保護(hù)性的免疫力。2010 年，J.Kortekaas 等[20]對CSFV全長感染性cDNA疫苗進(jìn)行了研究，證明E2 結(jié)構(gòu)蛋白A區(qū)是豬瘟特異性ELISA鑒測的主要靶目標(biāo)，通過改進(jìn)后的疫苗可有效地區(qū)別自然感染豬群與疫苗免疫豬群,為建立快速、準(zhǔn)確的CSFV診斷試劑盒奠定基礎(chǔ)。

CSFV全長感染性cDNA標(biāo)記疫苗的最大優(yōu)點(diǎn)是帶有可識別的標(biāo)記，誘導(dǎo)抗體能與野毒誘導(dǎo)的抗體相區(qū)別，為建立快速、準(zhǔn)確的CSFV診斷試劑盒奠定基礎(chǔ)，便于及早發(fā)現(xiàn)感染動物并采取控制措施，也可在實(shí)施豬瘟“撲滅計(jì)劃”時(shí)減少大量錯殺導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失。

7 小結(jié)

隨著獸醫(yī)生物技術(shù)研究的不斷深入，CSF 新型疫苗也隨之不斷發(fā)展。雖然CSF 新型疫苗取得了一定進(jìn)步，但各種備選疫苗都還存在一定缺陷，比如免疫原性、配套DIVA（differentiating infected from vaccinated animals）血清學(xué)檢測、抗體效價(jià)以及造價(jià)等，阻礙了其投入應(yīng)用的進(jìn)程。因此新型豬瘟疫苗的研究不僅是開發(fā)新的具有可行性的標(biāo)記疫苗設(shè)計(jì)方案，更重要的是要逐步解決已有備選標(biāo)記疫苗的優(yōu)化問題，使其能夠真正形成商品化產(chǎn)品，用來有效控制和預(yù)防豬瘟的暴發(fā)。此外，研究疫苗聯(lián)合免疫策略也會起到增強(qiáng)免疫效果的作用，也是今后豬瘟疫苗研究的一個重要方向。相信良好的免疫效果結(jié)合綜合防控的措施，最終能達(dá)到控制并消滅豬瘟的遠(yuǎn)大目標(biāo)。

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