曾慶平，鮑飛

（1.國家中醫(yī)藥管理局原蟲與病毒重點(diǎn)實(shí)驗室，廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510405）

青蒿素合成生物學(xué)及代謝工程研究進(jìn)展

曾慶平1，2，鮑飛1，2

（1.國家中醫(yī)藥管理局原蟲與病毒重點(diǎn)實(shí)驗室，廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510405）

青蒿素（artemisinin）是中國科學(xué)家于20世紀(jì)70年代從傳統(tǒng)中草藥青蒿或稱黃花蒿（Artemisia annua L.）中分離提純的抗瘧有效單體，其化學(xué)本質(zhì)是含有“過氧橋”結(jié)構(gòu)（1,2,4-三噁烷環(huán)）的倍半萜內(nèi)酯[1]。以青蒿素為母核經(jīng)人工半合成獲得的青蒿素琥珀酸酯（青蒿琥酯）、青蒿素甲醚（蒿甲醚）、青蒿素乙醚（蒿乙醚）和雙氫青蒿素等青蒿素類藥物，血中溶解性好，生物利用度高，對氯喹抗性瘧疾及致命性腦型瘧有特效，已成為世界衛(wèi)生組織（WHO）倡導(dǎo)的“基于青蒿素的聯(lián)合療法”（artemisinin-based combination therapies，ACTs）首選的抗瘧新藥，其中青蒿琥酯、蒿甲醚及蒿甲醚復(fù)方已被列入WHO“基本藥品目錄”[2]。

青蒿分布地域狹窄，青蒿素含量低（0.01%～0.5%）?；瘜W(xué)合成青蒿素產(chǎn)率不理想，成本高。隨著全球瘧疾發(fā)病率（3.8億人/年）和死亡率（4600萬人/年）逐年升高[3]，青蒿素類抗瘧藥需求量迅猛增長，導(dǎo)致青蒿素原料藥供不應(yīng)求，市場價格飆升[4]。近10年來，為了從根本上解決青蒿素的供需矛盾，國內(nèi)外爭相開展了青蒿素合成生物學(xué)及代謝工程研究，一方面嘗試在微生物體內(nèi)重建青蒿素生物合成途徑[5]，另一方面對青蒿中原有的青蒿素生物合成途徑進(jìn)行遺傳改良[6]。

在Bill & Melinda Gates基金贊助下，由One World Health 非贏利組織主導(dǎo)，在Amyris Biotechnologies公司和Sanofi-Aventis公司參與下，美國加州大學(xué)伯克利分校Keasling研究小組會同加拿大植物生物技術(shù)研究所Covello研究小組，于2004年啟動了以高產(chǎn)青蒿素酵母工程菌構(gòu)建為目標(biāo)的“青蒿素項目”（The Artemisinin Project）。該項目實(shí)施至今已獲得產(chǎn)青蒿酸及雙氫青蒿酸等青蒿素前體的基因工程酵母菌[7]。

可是，迄今仍無法將基因修飾酵母菌所產(chǎn)青蒿素前體轉(zhuǎn)變成青蒿素，表明在青蒿中開展轉(zhuǎn)基因研究仍然是一個不可忽略的重要方向，為此已育成青蒿素含量大幅提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株或品系[8]。同時，英國約克大學(xué)的Bowles小組已繪制出青蒿的遺傳圖譜，并鑒定出青蒿素高產(chǎn)相關(guān)基因，為指導(dǎo)青蒿素高產(chǎn)育種提供了科學(xué)依據(jù)[9]。

如果說青蒿素合成生物學(xué)研究具有革命性和前瞻性，在未來可能取得突破性成果，那么青蒿轉(zhuǎn)基因研究則更有現(xiàn)實(shí)意義，因為其成果是優(yōu)良的青蒿種質(zhì)。值得強(qiáng)調(diào)的是，中國科學(xué)家不僅在青蒿素合成生物學(xué)及代謝工程領(lǐng)域取得若干重大成果，而且正在引領(lǐng)著世界高產(chǎn)青蒿素轉(zhuǎn)基因青蒿植株培育的新潮流，充分發(fā)揚(yáng)了中國在青蒿素科學(xué)研究上的傳統(tǒng)優(yōu)勢。本文擬對當(dāng)前青蒿素合成生物學(xué)及代謝工程研究的最新進(jìn)展進(jìn)行初步評述。

1 青蒿素生物合成研究歷史與現(xiàn)狀

早在20世紀(jì)80年代，中國科學(xué)院上海有機(jī)化研究所汪猷院士領(lǐng)導(dǎo)的研究小組就利用放射性同位素標(biāo)記的2-14C-青蒿酸與青蒿勻漿（無細(xì)胞系統(tǒng)）保溫法證明，青蒿酸和青蒿素B是青蒿素的共同前體[10]。該結(jié)論相繼得到放射性標(biāo)記青蒿酸飼喂實(shí)驗[11]、青蒿素B離體轉(zhuǎn)化實(shí)驗[12]和青蒿酸、青蒿素B、雙氫青蒿素B離體轉(zhuǎn)化實(shí)驗[13]的支持。當(dāng)然，也有不支持青蒿酸是青蒿素前體結(jié)論的實(shí)驗結(jié)果[14]。香港大學(xué)施麗瓊小組用15-[2H313C]-青蒿酸飼喂青蒿植株后發(fā)現(xiàn)，青蒿酸的代謝產(chǎn)物中僅能檢測到11,13-脫氫倍半萜類（如青蒿酸、青蒿素B/脫氧青蒿素B、青蒿內(nèi)酯/異青蒿內(nèi)酯、杜松烷等），而未檢測到11,13-二氫倍半萜類（如雙氫青蒿酸、雙氫青蒿酸氫過氧化物、青蒿素等）[15]。因此，有人認(rèn)為，目前還不能完全排除其他中間產(chǎn)物作為青蒿素直接或間接前體的可能性。這些化合物包括： 青蒿酸、青蒿素B和青蒿烯、表-脫氧青蒿素B和二氫-表-青蒿素B、seco-杜松烷和青蒿烯[16]。

然而，荷蘭瓦格林根大學(xué)的Quax小組從青蒿中分離出雙氫青蒿酸及雙氫青蒿酸氫過氧化物，并提出雙氫青蒿酸經(jīng)雙氫青蒿酸氫過氧化物生成青蒿素的新觀點(diǎn)[17,18]。巧合的是，韓國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿酸與青蒿酸之間不能互變[19]，意味著青蒿中可能同時存在青蒿酸合成途徑和雙氫青蒿酸合成途徑，ΔC11,13位的氧化還原狀態(tài)是生成青蒿酸還是雙氫青蒿酸的“分水嶺”。換句話說，若產(chǎn)生青蒿酸，則不能繼續(xù)轉(zhuǎn)變成青蒿素；若產(chǎn)生雙氫青蒿酸，則能最終獲得青蒿素。這個結(jié)論正好與Bouwmeester小組發(fā)現(xiàn)青蒿中存在著青蒿素化學(xué)型和青蒿酸化學(xué)型的結(jié)果一致[20]。他們的研究結(jié)果還顯示，青蒿中青蒿素的含量通常比雙氫青蒿酸的含量低5～10倍，最大相差15倍[21]。因此，雙氫青蒿酸向青蒿素的轉(zhuǎn)變很可能是青蒿素合成的“瓶頸”，此過程涉及雙氫青蒿酸氫過氧化物生成的限速反應(yīng)。

若以雙氫青蒿酸為青蒿素的直接前體，則青蒿素生物合成可以人為地劃分成3個階段：第一階段是從乙酰輔酶A 經(jīng)異戊烯基焦磷酸（IPP）、二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）、法呢基焦磷酸到紫穗槐-4,11-二烯的合成途徑，其中DMAPP與IPP受IPP異構(gòu)酶（IPPI）催化發(fā)生互變，二者再被法呢基焦磷酸合成酶（FDS）作用生成法呢基焦磷酸，并在紫穗槐二烯合酶（ADS）催化下閉環(huán)產(chǎn)生紫穗槐-4,11-二烯；第二階段是從紫穗槐-4,11-二烯到雙氫青蒿酸的合成途徑，紫穗槐-4,11-二烯在細(xì)胞色素P450單加氧酶（CYP71AV1）催化下，經(jīng)連續(xù)氧化依次生成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸，其中青蒿醛受青蒿醛雙鍵還原酶2（DBR2）催化而還原成雙氫青蒿醛，后者再在青蒿醛脫氫酶1（ALDH1）催化下氧化成雙氫青蒿酸。雙氫青蒿醇轉(zhuǎn)變成雙氫青蒿醛由ALDH1/CYP71AV1催化，其逆反應(yīng)則由雙氫青蒿酸還原酶1（RED1）催化；第三階段是從雙氫青蒿酸到青蒿素的合成途徑，雙氫青蒿酸經(jīng)過未知的多個非酶促反應(yīng)最終生成青蒿素。此外，青蒿酸可能經(jīng)多步反應(yīng)合成青蒿素B后再轉(zhuǎn)變成青蒿素。圖1為最新提出的青蒿素生物合成途徑[22]。

2 青蒿素前體合成工程菌的構(gòu)建

從萜類合成的角度，可以將青蒿素生物合成分為從乙酰輔酶A到法呢基焦磷酸的“上游”途徑、從法呢基焦磷酸到雙氫青蒿酸的“中游”途徑和從雙氫青蒿酸到青蒿素的“下游”途徑。青蒿及其他高等植物與酵母等真核微生物合成法呢基焦磷酸的酶促反應(yīng)完全相同（循甲羥戊酸途徑），因而只需在酵母中額外增加一個青蒿素合成代謝支路，就能讓酵母全合成青蒿素。目前，中游途徑的酶促反應(yīng)已通過導(dǎo)入青蒿ADS，CYP71AV1，CPR，DBR2和ALDH1等基因至酵母而得以完全重建，但下游途徑的反應(yīng)條件在酵母中則尚未建立。

回溯到2003年，美國Keasling小組將青蒿ADS基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后導(dǎo)入大腸桿菌中表達(dá)，同時用酵母萜類合成途徑代替大腸桿菌萜類合成途徑，首次在細(xì)菌體內(nèi)合成出青蒿素的第一個關(guān)鍵前體——紫穗槐-4,11-二烯，在6 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)60 h的產(chǎn)率實(shí)線箭頭表示已被證實(shí)的反應(yīng)步驟，虛線箭頭表示推測或未被證實(shí)的反應(yīng)步驟；粗線箭頭表示主要反應(yīng)步驟，細(xì)線箭頭表示次要反應(yīng)步驟；單箭頭表示一個反應(yīng)步驟，多箭頭表示多個反應(yīng)步驟達(dá)到450 mg/L[23]。2006年，他們將ADS基因連同CYP71AV1和CPR基因同時導(dǎo)入釀酒酵母中表達(dá)，培育出世界上第一株生產(chǎn)青蒿酸的酵母工程菌，經(jīng)代謝途徑修飾與優(yōu)化，其產(chǎn)率已達(dá)153 mg/L[24]。加拿大Covello小組于2008年將新克隆的青蒿DBR2基因連同ADS，CYP71AV1 和CPR基因一同導(dǎo)入釀酒酵母，率先培育出合成雙氫青蒿酸的酵母工程菌，其中雙氫青蒿酸產(chǎn)率為15.7 mg/L，青蒿酸產(chǎn)率為11.8 mg/L[25]。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院及北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所的程克棣小組將青蒿ADS基因按酵母偏愛密碼子優(yōu)化并導(dǎo)入釀酒酵母后，也培育出產(chǎn)紫穗槐-4,11-二烯的酵母工程菌[26]。瑞典卡爾馬大學(xué)的Brodelius小組將ADS基因?qū)虢湍钢?，分別獲得質(zhì)粒表達(dá)及染色體整合表達(dá)的產(chǎn)紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌，其中質(zhì)粒表達(dá)酵母工程菌培養(yǎng)16 d后的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量為0.6 mg/L[27]。

然而，到目前為止，國內(nèi)外還沒有一個研究小組將酵母工程菌中的青蒿素前體轉(zhuǎn)變成青蒿素，其原因可能是酵母不具備青蒿素合成所需要的細(xì)胞環(huán)境。Covello小組的研究顯示，在青蒿葉片表面具有特殊腺體結(jié)構(gòu)并充滿揮發(fā)性芳香油的腺毛（glandular trichome）細(xì)胞中，青蒿素合成酶基因高表達(dá)，暗示青蒿素生物合成可能就發(fā)生在腺毛細(xì)胞中[28]。香港大學(xué)施麗瓊小組給青蒿飼喂標(biāo)記雙氫青蒿酸后并未測得標(biāo)記青蒿素，推測腺毛油相環(huán)境缺乏可能影響了分子中羥基的穩(wěn)定性[29]。在無腺毛隔離的環(huán)境中，青蒿素分子中特有的過氧化基團(tuán)可能烷化蛋白質(zhì)而檢測不到青蒿素。作為佐證，我們發(fā)現(xiàn)青蒿素可與腫瘤細(xì)胞或細(xì)菌的一氧化氮合酶及過氧化氫酶的血紅素輔基結(jié)合而使酶失活，導(dǎo)致一氧化氮水平降低，過氧化氫水平升高[30,31]。

這里面臨著一個策略選擇，即在微生物中合成青蒿素前體后是改用化學(xué)方法半合成青蒿素，還是繼續(xù)探索讓微生物將青蒿素前體轉(zhuǎn)變成青蒿素的方法？現(xiàn)在看來，國外選擇的是前者，并且已先期啟動產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。不過，從工藝、成本、環(huán)境影響等方面考慮，實(shí)現(xiàn)青蒿素的微生物全合成無疑有著更大的應(yīng)用價值。

3 高產(chǎn)青蒿素轉(zhuǎn)基因青蒿植株的培育

3.1 尋找高產(chǎn)青蒿素轉(zhuǎn)基因青蒿培育的有效途徑

青蒿素是一種次生代謝產(chǎn)物，它在青蒿中的積累量很小，而且不同地區(qū)生態(tài)類型的差異很大。中國科學(xué)院植物研究所葉和春研究小組最早開展轉(zhuǎn)基因青蒿研究，他們將重組法呢基焦磷酸合成酶基因（FPS）導(dǎo)入青蒿，以增加FPS基因的拷貝數(shù)目，期望增大青蒿素生物合成途徑的碳流（“開源法”），由此獲得青蒿素含量比對照高3～4倍的轉(zhuǎn)基因青蒿發(fā)根（0.2%～0.3%）[32]及比對照高2～3倍的轉(zhuǎn)基因青蒿植株（0.8%～1%）[33,34]。類似地，印度科學(xué)家用重組羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（HMGR）培育轉(zhuǎn)基因青蒿植株，其青蒿素含量提高22.5%[35]。

本課題組將反義鯊烯合酶基因（asSS）導(dǎo)入青蒿，以阻斷競爭青蒿素生物合成的類固醇分支途徑（“節(jié)流法”），獲得類固醇含量比對照（0.08%鮮重）下降近一半（0.04%～0.05%鮮重）及青蒿素含量比對照（0.45%干重）提高近3倍（1.23%干重）的轉(zhuǎn)基因青蒿植株[36]。上海交通大學(xué)唐克軒小組利用發(fā)夾RNA介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)阻斷類固醇合成途徑，使轉(zhuǎn)基因青蒿中的青蒿素含量達(dá)到3.14%干重，比對照提高3.14倍[37]。最近，中國科學(xué)院植物研究所的研究小組利用β-石竹烯合酶cDNA反義片段抑制青蒿的倍半萜合成支路，通過減少β-石竹烯對紫穗槐-4,11-二烯的競爭，使青蒿素含量提高50%以上[38]。

在今后的研究中，可以考慮將“開源”與“節(jié)流”兩種方法結(jié)合起來，也許能收到更好的效果。一種更有前景的創(chuàng)意是將青蒿中更多的非青蒿素合成途徑剔除或者僅保留青蒿素合成途徑及其他必要的代謝途徑，從而通過合成生物學(xué)創(chuàng)造出自然界不存在的新型代謝網(wǎng)絡(luò)。

3.2 通過調(diào)節(jié)激素及發(fā)育基因表達(dá)促進(jìn)青蒿素合成

細(xì)胞分裂素可刺激葉片生長，而青蒿素主要由青蒿葉片合成。因此，提高青蒿中的細(xì)胞分裂素水平有可能促進(jìn)青蒿素的合成。葉和春小組曾將異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因（ipt）導(dǎo)入青蒿，結(jié)果使細(xì)胞分裂素水平提高2～3倍，青蒿素含量增加30%～70%[39]。有關(guān)植物激素與青蒿素合成的相關(guān)性及其作用機(jī)理詳見后述。

為了闡明青蒿生長發(fā)育（尤其是生殖發(fā)育）與青蒿素高產(chǎn)的關(guān)系，葉和春小組曾用擬南芥開花促進(jìn)因子1基因（fpf1）及成花基因（CO）分別轉(zhuǎn)化青蒿，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然青蒿開花時間大大提前（分別提前20和14 d），但青蒿素含量并無明顯提高，表明開花并非青蒿素高產(chǎn)的先決條件[40,41]。

3.3 利用異種植物創(chuàng)建青蒿素生物合成新支路

美國肯塔基大學(xué)的Chapel小組將青蒿ADS基因及鳥類FPS基因?qū)霟煵葜斜磉_(dá)，經(jīng)葉綠體信號序列引導(dǎo)，ADS和FPS被轉(zhuǎn)運(yùn)至葉綠體，并合成紫穗槐-4,11-二烯，產(chǎn)量達(dá)到25 μg/g鮮重[42]。如果將來能將青蒿素合成途徑“搬到”葉綠體內(nèi)，那么這種獨(dú)特的“葉綠體催化”方法可能比常規(guī)的“細(xì)胞質(zhì)催化”方法更能獲得高產(chǎn)青蒿素。

荷蘭Bouwmeester小組利用煙草表達(dá)青蒿ADS，F(xiàn)PS和HMGR 基因，獲得產(chǎn)紫穗槐-4,11-二烯的轉(zhuǎn)基因煙草。但是，當(dāng)繼續(xù)導(dǎo)入CYP71AV1基因后，卻未檢測到預(yù)期產(chǎn)物青蒿酸，而只檢測到青蒿酸-12-β-雙葡萄糖苷，產(chǎn)量達(dá)到39.5 mg/kg鮮重，推測其為煙草葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的催化產(chǎn)物[43]。加拿大Covello小組將青蒿ADS和CYP71AV1基因?qū)霟煵莺?，只檢出紫穗槐-4,11-二烯和青蒿醇，未檢出青蒿酸。若再導(dǎo)入DBR2和ALDH1基因，也只檢出雙氫青蒿醇，未檢出雙氫青蒿酸[44]。由此可見，盡管在青蒿以外的植物中重建青蒿素合成途徑是可行的，但在產(chǎn)物（如青蒿酸糖苷）的后處理上可能會面臨較多的技術(shù)困難。

3.4 通過細(xì)胞培養(yǎng)探索青蒿素的工廠化生產(chǎn)

長期以來，以美國堪薩斯大學(xué)Weathers研究團(tuán)隊為代表，系統(tǒng)地開展了青蒿莖尖及根系體外培養(yǎng)，并通過添加植物激素[45]、營養(yǎng)成分[46]、光照[47,48]、非生物脅迫刺激劑[49,50]等試圖提高青蒿培養(yǎng)細(xì)胞的青蒿素含量，但結(jié)果均不理想。例如，在青蒿發(fā)根培養(yǎng)基中添加殼多糖能使其青蒿素含量提高6倍，但青蒿素的凈產(chǎn)出僅為1.8 mg/g干重[51]，這說明開展青蒿細(xì)胞培養(yǎng)并非獲取高產(chǎn)青蒿素的最佳選擇。

4 關(guān)于青蒿素生物合成的幾個關(guān)鍵問題

4.1 青蒿素合成基因表達(dá)具有時空特異性

我們利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)追蹤分析了青蒿素合成基因的發(fā)育及組織表達(dá)模式，結(jié)果顯示，各基因的表達(dá)水平在8月份開花前達(dá)到高峰，其中青蒿素特異合成ADS mRNA和CYP71AV1 mRNA升幅最大，為最低水平的12和15倍。處于盛花期的青蒿在根、莖、葉、花各個組織中都能檢測到青蒿素合成基因的表達(dá)，葉片中ADS mRNA 水平較其他組織高2倍左右[52]。我們采用組織化學(xué)染色法和分光光度法對CYP71AV1啟動子-GUS融合基因轉(zhuǎn)化煙草在正常和脅迫條件下的表達(dá)進(jìn)行定性及定量檢測，結(jié)果表明，在脫水、4℃和紫外輻射條件下，轉(zhuǎn)基因煙草的GUS 活性提高1.4～2.7倍[53]。瑞典及荷蘭科學(xué)家的研究結(jié)果表明，ADS，CYP71AV1，DBR2和ALDH1等青蒿素合成基因在花芽及嫩葉中的表達(dá)水平比其他組織（老葉、莖、根、發(fā)根培養(yǎng)細(xì)胞）高40～500倍，而對青蒿素合成有負(fù)調(diào)節(jié)作用的雙氫青蒿醛還原酶基因（RED1）則只在發(fā)根培養(yǎng)細(xì)胞中高表達(dá)[54,55]。

4.2 內(nèi)外環(huán)境因素促進(jìn)青蒿素的合成與積累

早在2000年，葉和春小組就證明，植物病原真菌可以不同程度地促進(jìn)體外培養(yǎng)青蒿發(fā)根中青蒿素的積累，其中大麗花輪枝孢處理發(fā)根后的青蒿素含量比對照提高45%[56]。南京大學(xué)譚仁祥小組也證實(shí)，來自真菌的寡聚糖激發(fā)子可使青蒿素含量從7 mg/g干重提高到13 mg/g干重，而寡聚糖激發(fā)子與一氧化氮供體硝普鈉共用，則青蒿素含量升高至12～22 mg/g干重[57]。

葉和春小組還發(fā)現(xiàn)，外源性赤霉酸可以通過反饋抑制赤霉酸合成，將碳源分流到青蒿素合成途徑，導(dǎo)致青蒿素含量增高，同時青蒿酸含量降低，表明從青蒿酸到青蒿素是青蒿素合成的限速步驟之一[58]。美國Weathers小組的研究發(fā)現(xiàn)，在青蒿發(fā)根培養(yǎng)基中添加2-異丙基腺嘌呤（一種細(xì)胞分裂素），也能顯著提高青蒿素含量[59]。

比利時根特大學(xué)及加拿大Covello小組的最新合作研究結(jié)果表明，茉莉酸既能加速腺毛發(fā)育，也能上調(diào)倍半萜合成基因表達(dá)，并大幅提高倍半萜含量[60]。香港中文大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)，茉莉酸甲酯對青蒿素合成的影響取決于青蒿的化學(xué)型，其中Ⅰ型積累較多的雙氫青蒿酸和青蒿素，而Ⅱ型中青蒿酸和青蒿素顯著減少[61]。

中國科學(xué)院植物研究所的研究團(tuán)隊也發(fā)現(xiàn)，水楊酸可使青蒿素、青蒿酸和雙氫青蒿酸含量分別提高54%，127%和72%[62]。意大利科學(xué)家證實(shí)，50 mmol/L β-環(huán)糊精或50 mmol/L β-環(huán)糊精+水楊酸可使青蒿懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中的青蒿素含量達(dá)到27 μmol/g干重，比對照高300倍左右[63]。他們還發(fā)現(xiàn)，22 μmol/L水楊酸可在30 min內(nèi)誘導(dǎo)青蒿素含量升高3倍，而200 μmol/L咪康唑則在24 h內(nèi)使青蒿素含量提高2.5倍[64]。

4.3 青蒿素產(chǎn)量與單線態(tài)氧水平高度相關(guān)

以往研究表明，青蒿收獲后干燥[65]及重金屬（鉛）、鹽脅迫[66]處理青蒿均有利于青蒿素的積累，推測極端環(huán)境脅迫尤其是氧化脅迫可能與青蒿素合成有著十分密切的關(guān)系，但始終缺乏活性氧參與青蒿素生物合成的證據(jù)。

我們研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因青蒿植株經(jīng)過冷處理后，單線態(tài)氧的釋放比對照植株明顯增強(qiáng)，同時青蒿素含量從1.23%增加到1.66%，轉(zhuǎn)基因青蒿植株干粉經(jīng)15個月貯存后青蒿素含量升至2.35%[67]。我們采用mRNA定量擴(kuò)增技術(shù)系統(tǒng)地研究了低溫[68]、衰老[69]、水楊酸及茉莉酸甲酯[70]等內(nèi)外環(huán)境因素對青蒿素生物合成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青蒿素合成mRNA水平升高、酶類合成增加、青蒿素含量提高均與單線態(tài)氧大量釋放同步發(fā)生，從而為單線態(tài)氧參與調(diào)節(jié)青蒿素生物合成提供了直接證據(jù)。

4.4 單線態(tài)氧來自青蒿葉綠體并可誘導(dǎo)青蒿素合成基因表達(dá)

擬南芥的條件性flu突變體在由黑暗轉(zhuǎn)光照的交替中可激發(fā)葉綠體產(chǎn)生單線態(tài)氧[71]，并且由核基因組編碼的葉綠體蛋白Executer 1 和Executer 2負(fù)責(zé)單線態(tài)氧信號從葉綠體向細(xì)胞核的逆向轉(zhuǎn)導(dǎo)[72]。最近，我們還發(fā)現(xiàn)，Executer 1基因與抗氧化酶（谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶）基因均受萜類合成抑制劑處理后激發(fā)的單線態(tài)氧的共調(diào)控（未發(fā)表結(jié)果）。

關(guān)于內(nèi)源性與外源性單線態(tài)氧在青蒿素合成中的作用，我們利用類胡蘿卜素合成抑制劑證明，葉綠體釋放的單線態(tài)氧可作為“逆向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子”誘導(dǎo)核內(nèi)編碼的青蒿素合成相關(guān)基因表達(dá)[73]。相反，我們在培養(yǎng)基中添加單線態(tài)氧光敏發(fā)生劑孟加拉玫紅（rose Bengal）并照光或通入次氯酸鈉與過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)生單線態(tài)氧后，不僅顯著降低青蒿素含量，而且導(dǎo)致大量未知產(chǎn)物合成[70]。

以上結(jié)果表明，單線態(tài)氧催化的非酶促反應(yīng)可能是青蒿素生物合成的限速步驟，而單線態(tài)氧來源于細(xì)胞內(nèi)而不是細(xì)胞外，內(nèi)源性單線態(tài)氧不僅能上調(diào)青蒿素合成基因表達(dá)，而且可催化雙氫青蒿酸轉(zhuǎn)變成青蒿素。

5 結(jié)論及展望

近10年來，青蒿素合成生物學(xué)進(jìn)展速度驚人，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)青蒿素前體已接近工業(yè)化規(guī)模，但目前還不能實(shí)現(xiàn)青蒿素在微生物體內(nèi)的全合成。國外擬采取“兩步法”策略半合成青蒿素：第一步是在微生物中獲得青蒿素前體，第二步是利用化學(xué)方法將青蒿素前體轉(zhuǎn)變成青蒿素。該方法一旦實(shí)施成功并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，必將帶來青蒿素生產(chǎn)方式的徹底變革，也是緩解日益嚴(yán)重的青蒿素短缺局面的根本出路。

青蒿素合成基因基本上都由國外研究機(jī)構(gòu)首先發(fā)現(xiàn)并鑒定，而且?guī)缀跛邢嚓P(guān)基因均已申請國際專利保護(hù)，我國培育青蒿素前體合成微生物工程菌將面臨諸多的專利壁壘。因此，我國不宜步國外研究后塵開展產(chǎn)青蒿素前體工程菌構(gòu)建的跟風(fēng)研究，而應(yīng)該一方面著力推動具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高產(chǎn)青蒿素轉(zhuǎn)基因青蒿的田間試驗和評價，另一方面加強(qiáng)青蒿素合成終端反應(yīng)的分子機(jī)理研究，并在此基礎(chǔ)上建立青蒿及轉(zhuǎn)基因青蒿中由雙氫青蒿酸高效轉(zhuǎn)變?yōu)榍噍锼氐耐獠織l件，爭取早日實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗等優(yōu)良農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)基因青蒿品系的推廣應(yīng)用。

摘編自《科學(xué)通報》2011年56卷27期：2289～2297頁，圖、表、參考文獻(xiàn)已省略。