大鼠肝缺血再灌注后肺細胞凋亡及七氟醚對細胞凋亡及NF-κBp65的影響

管小萌,徐桂萍,王曉麗

(1.新疆醫(yī)科大學研究生學院;2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院麻醉科,新疆 烏魯木齊　830000)

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大鼠肝缺血再灌注后肺細胞凋亡及七氟醚對細胞凋亡及NF-κBp65的影響

管小萌1,徐桂萍2,王曉麗1

(1.新疆醫(yī)科大學研究生學院;2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院麻醉科,新疆 烏魯木齊830000)

摘要：目的探討七氟醚預處理對大鼠肝缺血再灌注后肺細胞凋亡的影響。方法24只 Wister大鼠隨機分為3組(n=8):假手術(shù)組,缺血再灌注組,七氟醚組，阻斷肝門30 min后建立大鼠70%肝缺血再灌注模型。假手術(shù)組(S組)僅游離肝門，但不阻斷；肝缺血再灌注組(IR組)采用阻斷肝門30 min，再灌注1 h的方法制備大鼠肝缺血再灌注損傷模型；七氟醚預處理組(SP組)吸入2.1%七氟醚30 min,停止吸入10 min后制備肝缺血再灌注模型。于再灌注1 h時處死動物，留取肺組織, 測定濕/干重比(W/D比),采用比色法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量,采用原位末端轉(zhuǎn)移酶法(TUNEL)檢測細胞凋亡,計算細胞凋亡指數(shù)(AI)，采用Western blot法測定核蛋白NF-κBp65 表達，光鏡下觀察肺組織病理學結(jié)果。結(jié)果與S組比較，IR組和SP組再灌注各時點肺組織W/D比值、細胞凋亡指數(shù)(AI)和NF-κB 活性水平及MDA含量均顯著增高(均P<0．05)；SOD活性顯著降低(P<0．05)；與IR組比較，SP組W/D比值、細胞凋亡指數(shù)(AI)、NF-κB表達水平與MDA含量顯著降低(均P<0．05)；而SOD活性顯著增加(P<0．05)；SP組肺組織損傷較IR組減輕。結(jié)論細胞凋亡可能在肝缺血再灌注肺損傷發(fā)生過程中具有重要意義；七氟醚對大鼠肝缺血再灌注后肺細胞凋亡具有抑制作用，其作用機制可能通過降低肺組織NF-κB的活性，從而清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化有關(guān)。

關(guān)鍵詞:七氟醚;細胞凋亡;缺血再灌注

急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)引起的的急性肺損傷(ALI)越來越受到臨床醫(yī)師的廣泛重視，它可產(chǎn)生于肝病、腎病及腸道病變等多種原因。臨床上直接性肝臟的創(chuàng)傷如創(chuàng)傷性休克以及間接性肝臟創(chuàng)傷如外科手術(shù)均會引起肝臟缺血再灌注(IR)這個病理生理過程，在發(fā)生這個過程時會導致遠隔臟器之一肺臟損傷，進而導致肺臟功能下降[1]。在此過程中細胞會發(fā)生一種主動地死亡，叫做細胞凋亡，這個過程中機體自主的清除了死亡衰老及異常的細胞，進而維持機體正常的穩(wěn)態(tài)。NF-κB作為一種核轉(zhuǎn)錄因子具有兩種亞單位p50/p65,其正常情況下是無活性的，應(yīng)激、創(chuàng)傷下均會使其激活。七氟醚是一種具有麻醉誘導迅速，維持平穩(wěn)，易于掌握，蘇醒快速完全的麻醉藥，故其在臨床上已得到了廣泛的應(yīng)用，本實驗擬通過建立大鼠模型，以及應(yīng)用吸入麻醉藥物七氟醚后，觀察在體肺細胞凋亡情況，以及此麻醉藥物在其中發(fā)揮的作用及其可能機制,并為以后的臨床麻醉提供可靠的依據(jù)。

1材料

1.1動物選用由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供的健康雄性Wister大鼠24只(SPF級)，體重300～350 g，動物使用許可證編號：SYXK(新)2011-0001。標準環(huán)境術(shù)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2藥品七氟醚(商品名：喜保福寧，每瓶250 mL，丸石制藥株式會社,批號：1610)。

1.3主要試劑戊巴比妥鈉粉劑(購自南昌東湖強生公司)，4%中性甲醛溶液，丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，原位末端轉(zhuǎn)移酶法(TUNEL)試劑盒,BCA蛋白分析試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)。

1.4主要儀器小動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)，70℃電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9123型上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio—Rad公司，美國)。

2方法

2.1動物分組采用隨機數(shù)字表法，將實驗大鼠分為3組，每組8只：假手術(shù)組(S組)、肝缺血再灌注組(IR組)和七氟醚預處理組(SP組)。

2.2動物模型制備及給藥實驗前，大鼠禁食12 h，自由飲水。參照文獻[2]的方法建立70%肝缺血再灌注模型。選用2%戊巴比妥鈉80 mg·kg-1進行腹腔注射麻醉后固定于定鼠板，氣管切開插管，連接小動物呼吸機行機械通氣，通氣頻率每分鐘60～65次，潮氣量10～15 mL·kg-1, 呼吸比1.0︰1.5。30 min后對實驗大鼠腹部脫毛并碘伏消毒。實驗過程中，大鼠腹部正中切口，暴露肝蒂，頸內(nèi)靜脈注射50 U肝素，5 min后大鼠全身肝素化，于呼氣末采用無創(chuàng)血管夾夾閉進入肝左、中葉的血管，肝臟顏色由淡紅變?yōu)榘底霞t色，表明阻斷成功。阻斷30 min后松開血管鉗，觀察5 min內(nèi)肝臟顏色恢復，表明再灌注成功。S組僅游離肝蒂，但不阻斷肝臟血管；SP組吸入2.1%七氟醚30 min后制備肝缺血再灌注模型。于再灌注1 h后放血處死大鼠，取肺組織進行指標測定。整個術(shù)中光照保溫，鹽水紗布覆蓋防止水分丟失減慢大鼠死亡。

2.3標本制備取右肺上葉組織用4℃生理鹽水沖洗表面血跡，然后用濾紙吸干表面水分稱濕重后，然后放在70℃電熱恒溫鼓風干燥箱中24 h至恒重，稱干重，計算濕干重比(W/D比)。

取右肺下葉組織用4℃生理鹽水洗去血跡后，-80℃下凍存，采用比色法測MDA含量與SOD活性。按檢測試劑盒說明書操作。

取左肺下葉用10%福爾馬林固定24 h后石蠟包埋,連續(xù)切4 μm厚石蠟切片2片,用HE染色,并檢測細胞凋亡， 采用原位末端轉(zhuǎn)移酶(TUNEL)法檢測。

取出部分-80℃冰箱保存的右肺下葉組織，加入細胞裂解液及酶抑制劑，勻漿后離心取上清，BCA法測定蛋白濃度。取20 μL蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE法分離后，以半干轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至NC膜上，NC膜經(jīng)5%BSA室溫封閉2 h后，用TBST稀釋一抗至適當濃度(1︰1 000)，4℃孵育過夜。洗滌液沖洗后加入二抗，室溫孵育2 h，洗膜。以化學發(fā)光檢測試劑顯色之后水洗終止反應(yīng)，暗室中用X膠片感光、顯影、定影。

取部分左肺上葉組織放入4%中性甲醛溶液中固定，予以常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色。

2.4主要觀察指標

2.4.1組織損傷程度的測定計算濕干重比(W/D)用來反應(yīng)各組肺組織損傷程度。

2.4.2脂質(zhì)過氧化程度的測定丙二醛(MDA)可以用來反映脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度，而超氧化物歧化酶(SOD)用來保護細胞不受氧自由基損傷。

2.4.3肺組織病理學改變及細胞凋亡的測定光鏡下觀察肺組織HE染色后的形態(tài)變化；采用TUNEL法原位檢測各組肺細胞凋亡情況。隨機選取5個視野光鏡下觀察,細胞核呈棕黃色為凋亡細胞，400倍光鏡下計數(shù)凋亡細胞并計算細胞凋亡指數(shù)(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%)。

2.4.4肺組織NF-κBp65蛋白表達水平用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描測定條帶的吸光度值行分析處理，以目的蛋白與β-actin灰度值的比值反映NF-κBp65蛋白的表達水平。

3結(jié)果

3.1肺組織W/D比值各組肺組織W/D比值資料見表1。經(jīng)整體比較(單因素方差分析)，3組間均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。再行兩兩比較，結(jié)果為：缺血再灌注組及七氟醚組與假手術(shù)組比較，W/D比值顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05)；而七氟醚組與缺血再灌注組比較，W/D比值顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05)。

表1　三組大鼠肺組織各項指標比較

注：與S組比較，△P<0.05；與IR組比較，*P<0.05。

3.2肺組織MDA含量與SOD活性3個組整體比較也有顯著性意義(P<0.05)。兩兩組間比較：缺血再灌注組及七氟醚組與假手術(shù)組比較MDA含量顯著增高，SOD活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05) ；而七氟醚組與缺血再灌注組比較，MDA含量顯著降低，SOD活性顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05) ,見表1。

3.3肺組織細胞凋亡各組鏡下均可見凋亡細胞。對細胞凋亡指數(shù)(AI)做3組整體比較，結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較：缺血再灌注組及七氟醚組AI較假手術(shù)組顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05)；七氟醚組較缺血再灌注組AI顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05),見表1。

3.4肺組織NF-κBp65蛋白表達水平缺血再灌注組及七氟醚組與假手術(shù)組比較，NF-κBp65蛋白表達水平顯著增加,結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而七氟醚組與缺血再灌注組比較，NF-κBp65蛋白表達水平顯著降低,結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。原始蛋白條帶圖見圖1，圖2。

3.5組織病理學檢查光鏡下S組肺組織結(jié)構(gòu)未見異常；IR組及SP組細胞結(jié)構(gòu)均有不同程度破壞；IR組肺損傷嚴重，肺泡腔完整性破壞，肺泡腔縮窄，間隔增厚，可見炎性細胞浸潤。肺泡壁及肺泡間質(zhì)中可見大量中性粒細胞(PMN)；SP組肺損傷較IR組減輕，但仍可見肺間質(zhì)不同程度增生，肺泡壁毛細血管充血，肺間質(zhì)炎性細胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)仍存在一定損傷。病理學結(jié)果見圖3。

4討論

臨床工作中，病人院內(nèi)死亡有多種原因，重大創(chuàng)傷引起的院內(nèi)死亡之一是多器官衰竭，重大創(chuàng)傷后的敗血癥，膿毒血癥以及全身炎癥反應(yīng)均會發(fā)展為多器官功能衰竭，肝缺血再灌注損傷引起遠隔臟器肺損傷亦是全身炎癥反應(yīng)失衡的結(jié)果[3]。研究證實缺血再灌注的器官因組織受損可向循環(huán)中釋放細胞因子以及其他促炎性介質(zhì)等，從而造成多臟器功能障礙[4]。目前，關(guān)于缺血再灌注的單個器官引起多器官功能障礙的內(nèi)在機制我們知之甚少，而在這些僅有的機制中，氧毒性及自由基產(chǎn)物等炎性介質(zhì)發(fā)揮著重要作用[5]。有研究表明肝缺血再灌注中，損傷的肝組織向循環(huán)內(nèi)釋放具有破壞性的促炎性細胞因子和氧自由基等是引起遠隔臟器損傷的原因[4]，肺臟作為呼吸系統(tǒng)的主要臟器比較常見。 七氟醚的器官保護作用已被廣泛證實,其在肺臟順應(yīng)性方面的保護與NF-κBp65有關(guān)也已經(jīng)被證實[6]。

近年來有關(guān)組織缺血再灌注及細胞凋亡的研究越來越多，細胞凋亡使機體保持穩(wěn)態(tài)。肝臟缺血再灌注使機體處于應(yīng)激狀態(tài)，必然會打破原有的平衡，這就迫使細胞自我保護，已有國外文獻報道，在光學顯微鏡下觀察缺血后的腦組織，其中的病理變化是神經(jīng)細胞的大量凋亡[7]。另有研究表明，NF-κBp65能夠降低急性肺損傷時肺組織損傷程度且與抑制細胞凋亡有關(guān)[8]。而已有報道證明七氟醚在降低組織損傷方面與抑制NF-κB蛋白有關(guān)[9]。 因此本研究同時測定NF-κBp65的表達以此推測其中發(fā)生的變化。

NF-κB作為一種核轉(zhuǎn)錄因子具有兩種亞單位p50/p65, 但只有p65在蛋白的C末端含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，能直接作用于轉(zhuǎn)錄區(qū)域而激活轉(zhuǎn)錄過程[10]有研究表明[8]，正常大鼠細胞內(nèi)NF-κB表達較少，而人為使大鼠處于急性肺損傷2 h后，其表達含量增加，這就證明了NF-κB參與了急性肺損傷，應(yīng)用靜脈麻醉藥丙泊酚后，對比模型組，細胞凋亡的發(fā)生率也相應(yīng)降低, 國外有研究報道[11]，人為使大鼠失去p65基因后，器官缺血后腦組織損傷明顯減輕。另外，若在大鼠腦組織處于缺血再灌注過程中p65基因被激活，則會加重細胞的凋亡[12]。而在此過程中給予抗氧化劑，降低p65活性后，反而減輕了神經(jīng)細胞的凋亡[13]。

組織發(fā)生缺血再灌注后，細胞釋放大量氧自由基，這些氧自由基一方面會進一步激活NF-κB，從而使其編碼的下游的炎癥因子產(chǎn)生增多；另一方面通過改變周圍細胞膜的特性使其產(chǎn)生損傷細胞的氧自由基，在這過程中包括MDA的產(chǎn)生，從而攻擊組織。在本次試驗中，我們成功建造了模型，肺臟作為缺血再灌注后最先受損的器官，表現(xiàn)在細胞完整性的破壞，大量PMN的浸潤，及可見到細胞充血及水腫，W/D用來反映各個實驗組細胞受損程度，MDA反映氧自由基水平以及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度，而SOD是細胞的保護者，它的存在使MDA不能作用于細胞，進而維持一種保護性的平衡。對比SP組可發(fā)現(xiàn)使用七氟醚后細胞凋亡發(fā)生率，遠隔器官病理學改變以及組織發(fā)生的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)均減輕，這就提示遠隔器官的組織損傷與細胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)，并且七氟醚對組織損傷的保護可能是通過降低NF-κB的活性這一機制。但是這種機制是如何發(fā)生的，還有待進一步研究。

綜上所述，七氟烷對大鼠肝缺血再灌注后肺細胞凋亡具有抑制作用，其作用機制可能通過降低肺組織NF-κB的活性，從而抑制脂質(zhì)過氧化有關(guān)。

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基金項目：國家自然科學基金 (No 81160016)

通信作者：徐桂萍，女，主任醫(yī)師，碩士生導師，研究方向：小兒麻醉，E-mail:XGPSYL@126.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.007

(收稿日期：2015-07-28，修回日期：2015-09-15)

Pneumocyte apoptosis after hepatic ischemia-reperfusion in rats
and the effect of sevoflurane on apoptosis and NF-κBp65

GUAN Xiao-meng1,XU Gui-ping2,WANG Xiao-li1

(1.GraduateSchoolofXinjiangMedicalUniversity;2.DepartmentofAnesthesiology，

People’sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion，Urumqi830000,China)

Abstract:Objective To explore the influences of sevoflurane pretreatment on apoptosis of rat lung cells after hepatic ischemia reperfusion. Methods Twenty-four Wister rats were randomized into 3 groups (n=8):sham-operation group, hepatic ischemia reperfusion group and sevoflurane group. After 30 min of hepatic portal occlusion, rat models with 70% hepatic ischemia and reperfusion were established. Porta hepatis was only separated but not blocked in the sham-operation group (group S); hepatic ischemia reperfusion rat model was established by 30 min of hepatic portal occlusion and 1 h of reperfusion in hepatic ischemia reperfusion group (group IR); In sevoflurane pretreatment group (group SP), the rats were inhaled with 2.1% of sevoflurane for 30 min, and then stopped. 10 min later, hepatic ischemia reperfusion model was established. The animals were executed at 1h after reperfusion. The lung tissue was taken. Wet/dry weight ratio (W/D ratio) was determined. Colorimetry was adopted to determine activity of superoxide dismutase (SOD) and content of malondialdehyde (MDA). Terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling (TUNEL) was used to determine cell apoptosis. Cell apoptosis index (AI) was calculated. Western blot was used to determine expressions of NF-κBp65. Pathological results of lung tissue were observed under microscope. Results W/D ratios, AIs, NF-κB activity and MDA content of group IR and group SP at each time after reperfusion were significantly increased compared with group S (All P<0.05); SOD activity was decreased significantly (P<0.05); W/D ratios, AIs, NF-κB activity and MDA content of group SP were significantly lower than those of group IR (All P<0.05); and SOD activity was obviously increased (P<0.05); lung tissue injury of group SP was decreased compared with group IR. Conclusions Cell apoptosis may play an important role in lung tissue injury due to hepatic ischemia reperfusion. Sevoflurane has a certain inhibition on rat lung cell apoptosis after hepatic ischemia reperfusion, which may eliminate free radicals and inhibit lipid peroxidation by reducing activity of NF-κB in lung tissue.

Key words:sevoflurane;cell apoptosis;ischemia-reperfusion